专利名称：一种提取连翘叶片dna的方法
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种提取连翘叶片DNA的方法。
背景技术：
连翘(Forsythia suspensa (Thunb. ) Vahl)为木犀科(Oleaceae)连翘属 (Forsythia)多年生落叶灌木，果实初熟尚带绿色时采收称为青翘，果实熟透颜色发黄时采 收称为老翘，具有清热解毒、消肿散结之功效。随着分子生物学的发展，目前DNA标记技术已经渗透到中药的各个领域，而DNA提 取技术是分子标记技术的关键。连翘叶片内含有较多的酚类、鞣质类物质，这些次生代谢物 的存在严重影响了 DNA的纯度，进而影响到其后续的DNA扩增工作。因而连翘DNA的提取 是分子标记技术应用其研究中的重中之重。电泳检测表明经典的CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥 散，A2607280 = 1. 38，所提取DNA中因纯度低，连翘叶片内含有过多的酚类、鞣质等杂质，对其 后续分子标记技术的研究造成很大的影响，因此很有必要对连翘DNA提取方法进行改进。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种提取连翘叶片 DNA的方法，可有效克服连翘DNA的含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A26(l/28(l = 1. 38，并 消除连翘叶片内过多的酚类、鞣质等杂质对连翘DNA影响造成的纯度低问题。本发明解决的技术方案是，以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成 粉末(必要时，在加液氮之前，可先在研钵中加入0. 05gPVP)，之后将粉末转入灭菌离心 管中，加入0-4°C预冷的提取缓冲液I，提取缓冲液I加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的 6-10倍，(所说的重量体积为连翘幼嫩叶片以重量g计，提取缓冲液I以体积ml计，以下 同)，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液I混勻，冰浴10min，4°C下离 心lOmin，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液II，提取缓冲液II加 入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的6倍，沉淀物与提取缓冲液II混勻，冰浴10min，4°C下 离心lOmin，弃去上清液，立即加入预热的2XCTAB和β -巯基乙醇，2XCTAB加入量为连 翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，β -巯基乙醇加入量为每0. 5g连翘幼嫩叶片原材料加入 60-120 μ L，充分混勻，在65°C水浴中保温4h期间每隔0. 5h轻轻摇动离心管一次；水浴后， 4°C下离心IOmin ；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇的混合 溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24 1，轻轻颠倒离心管，混勻，4°C下离 心lOmin，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清 液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20°C预冷的异丙醇，轻轻晃动， 于-20°C静置过夜(8-12小时)；4°C下离心5min，收集沉淀，弃去上清液，用75% (V/V)的 乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的2倍，将离心管倒置在吸 水纸上，风干，得风干物；每0. 5g连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用50-60 μ LTE缓冲液
3溶解，并加入0. 5 μ L 5-10mg/mLRNase,轻轻混勻，于37°C水浴中温浴30min，即得到高质量 的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA ；所说的提取缓冲液I 是由 0. 25mol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、0. 25mol/LNaCl 和余量为水混合均勻制成；所说的提取缓冲液II是由100mmOl/LTriS-HCl，20mmOl/L EDTA，0. 25mol/L NaCl,0. 025mol/L Na2B4O7 和余量为水混合均勻制成。本发明有效用于提取连翘叶片DNA，提出物纯度高，效率高，有效克服了电泳检测 表明经典的CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，Α26(1/28(1 = 1. 38，所 提取DNA纯度较低的问题，有效保证了对其后续分子标记技术的研究创造了良好的技术条 件，是提取连翘叶片DNA的方法的一大创造。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式
作详细说明。实施例1本发明在实施中，具体可由以下步骤实现取0.5g连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末 转入灭菌离心管中，加入0-4 °C预冷的提取缓冲液I 3-5mL，混勻，冰浴lOmin，4 °C下 6000-10000r/min离心IOmin,弃去上清液，再加入提取缓冲液II 3ml，混勻，冰浴IOmin, 4°C下6000-10000r/min离心lOmin，弃去上清液，立即加入3_5mL 65°C预热的2 X CTAB和 60-120 μ L β -巯基乙醇，充分混勻，在65°C水浴中保温4h期间每隔0. 5h轻轻摇动离心管 一次；温浴后，4°C下lOOOOr/min离心IOmin ；取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入与上清 液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24 1，轻 轻颠倒离心管，混勻，4°C下12000r/min离心lOmin，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇 混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体 积、并于-20°C预冷的异丙醇，轻轻晃动，于_20°C静置(8-12小时)过夜；4°C下8000r/min 离心5min，弃去上清液，收集沉淀物，沉淀物用75% (V/V)的乙醇漂洗沉淀物2次或3次， 每次lmL，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用50-60 μ LTE缓冲液溶解，并 加入0. 5 μ L5-10mg/mLRNase,轻轻混勻，于37°C水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接 用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA。实施例2①称取0. 5g连翘嫩叶片，在研钵中加入液氮迅速研磨成粉末(必要时，在加液氮 之前，可先在研钵中加入0. 05gPVP)；②将粉末材料转入5mL的灭菌离心管中，加入4°C遇冷的提取缓冲液I (0. 25mol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，0. 25mol/L NaCl) 3_5mL，混勻，冰浴 lOmin，4°C下 6000_10000r/ min离心lOmin，倾去上清液，再加入提取缓冲液II(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA, 0. 25mol/L NaCl，0. 025mol/L Na2B4O7) 3ml，混勻，冰浴 10min，4°C下 6000-10000r/min 离心 lOmin，倾去上清液，立即加入3mL 65°C预热的2 X CTAB和60 μ L β -巯基乙醇，充分混勻， 在65°C水浴中保温4h期间每隔0. 5h轻轻摇动离心管一次)。③温浴后，4°C下10000r/min 离心 lOmin。④取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇V/V = (24/1)，
4轻轻颠倒离心管，混勻，4°C下12000r/min离心lOmin，重复此操作，至两液面无白色沉淀为止。⑤把上清液转移到5mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20°C预冷的异丙 醇，轻轻晃动，于-20 0C静置过夜。⑥4°C下8000r/min离心5min，收集沉淀。倾去上清液，用75% (V/V)的乙醇漂洗 沉淀3次每次lmL，将离心管倒置在吸水纸上，风干。⑦沉淀用50 μ LTE缓冲液溶解，并加入0. 5 μ L lOmg/mLRNase,轻轻混勻，于37°C 水浴中温浴30min，-20°C中保存备用。实施例3①称取0. 5g连翘嫩叶片，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。②将粉末材料转入5mL的灭菌离心管中，加入4mL 65°C预热的2XCTAB和60 μ L β -巯基乙醇，充分混勻，在65°C水浴中保温4h期间每隔0. 5h轻轻摇动离心管一次。③温浴后，4°C下10000r/min 离心 lOmin。④取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇V/V = (24/1)， 轻轻颠倒离心管，混勻，4°C下12000r/min离心lOmin，重复此操作，至两液面无白色沉淀为止。⑤把上清液转移到5mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20°C预冷的异丙 醇，轻轻晃动，于-20 0C静置过夜。⑥4°C下8000r/min离心5min，收集沉淀。倾去上清液，用75% (V/V)的乙醇漂洗 沉淀2次每次lmL，将离心管倒置在吸水纸上，风干。⑦沉淀用60 μ LTE缓冲液溶解，并加入0. 5 μ L5mg/mLRNase,轻轻混勻，于37°C水 浴中温浴20min，-20°C中保存备用。实施例4①称取0. 5g连翘嫩叶片，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。 ②将粉末材料转入5mL的灭菌离心管中，加入0°C遇冷的提取缓冲液4mL，混勻，冰 浴lOmin，4°C下10000r/min离心lOmin，倾去上清液，立即加入5mL 65°C预热的2 X CTAB和 SOyL β-巯基乙醇，充分混勻，在65°C水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次。③温浴后，4°C下10000r/min 离心 lOmin。④取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇V/V = (24/1)， 轻轻颠倒离心管，混勻，4°C下12000r/min离心lOmin，重复此操作，至两液面无白色沉淀为止。⑤把上清液转移到5mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于_20°C预冷的异丙 醇，轻轻晃动，于-20 0C静置过夜。⑥4°C下8000r/min离心5min，收集沉淀。倾去上清液，用75% (V/V)的乙醇漂洗 沉淀2次每次lmL，将离心管倒置在吸水纸上，风干。⑦沉淀用55 μ LTE缓冲液溶解，并加入0. 5 μ L6mg/mLRNase,轻轻混勻，于37°C水 浴中温浴20min，-20°C中保存备用。本发明方法稳定可靠，提取的连翘总DNA纯度高，经先后10次试验，均取得了相同 和相似的结果，并经检测，本发明提出的连翘总DNA与经典CTAB法提出来的DNA相比基本上没有蛋白，A2607280 = 1. 81，而经典CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带 弥散，A2607280 = 1. 38，说明本发明方法提取出来的DNA纯度较高，有效解决了长期以来科研 人员未能解决的制备连翘DNA纯度低的技术难题，经济和社会效益巨大。
权利要求
一种提取连翘叶片DNA的方法，其特征在于以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0 4℃预冷的提取缓冲液I，提取缓冲液I加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6 10倍，，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液I混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液II，提取缓冲液II加入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的6倍，沉淀物与提取缓冲液II混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，立即加入预热的2×CTAB和β 巯基乙醇，2×CTAB加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6 10倍，β 巯基乙醇加入量为每0.5g连翘幼嫩叶片原材料加入60 120μL，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4℃下离心10min；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于 20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于 20℃静置过夜；4℃下离心5min，收集沉淀，弃去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2 3次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的2倍，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；每0.5g连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用50 60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL5 10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA；所说的提取缓冲液I是由0.25mol/L Tris HCl、50mmol/L EDTA、0.25mol/LNaCl和余量为水混合均匀制成；所说的提取缓冲液II是由100mmol/LTris HCl，20mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L Na2B4O7和余量为水混合均匀制成。
2.根据权利要求1所述的提取连翘叶片DNA的方法，其特征在于取0.5g连翘幼嫩叶 片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4°C预 冷的提取缓冲液I 3-5mL，混勻，冰浴10min，4°C下6000-10000r/min离心lOmin，弃去上清 液，再加入提取缓冲液II 3ml，混勻，冰浴10min，4°C下6000-10000r/min离心lOmin，弃去 上清液，立即加入3-5mL65°C预热的2 X CTAB和60-120 μ L β -巯基乙醇，充分混勻，在65°C 水浴中保温4h期间每隔0. 5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4°C下lOOOOr/min离心IOmin ； 取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合 溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24 1，轻轻颠倒离心管，混勻，4°C下12000r/min离 心lOmin，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清 液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20°C预冷的异丙醇，轻轻晃动， 于_20°C静置8-12小时过夜；4°C下8000r/min离心5min，弃去上清液，收集沉淀物，沉淀物 用75% (V/V)的乙醇漂洗沉淀物2次或3次，每次lmL，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得 风干物；风干物用50-60 μ LTE缓冲液溶解，并加入0. 5 μ L 5-10mg/mLRNase,轻轻混勻，于 37°C水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA。
全文摘要
本发明涉及提取连翘叶片DNA的方法，有效克服连翘DNA含有蛋白、条带弥散，A260/280＝1.38，消除连翘叶片内的酚类、鞣质等杂质的问题，方法是，连翘叶片在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将粉末转入离心管中，加提取缓冲液，混匀，冰浴，离心，弃去上清液，加入2×CTAB和β-巯基乙醇，混匀，水浴，离心，上清液置离心管中，加入氯仿和异戊醇的混合溶液，轻轻颠倒离心管，混匀，离心，重复此操作，至上清液液面无白色沉淀为止；把上清液置入离心管中，加入异丙醇，静置过夜；离心，收集沉淀，用乙醇漂洗沉淀，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用缓冲液溶解，加入RNase，混匀，温浴，即得，本发明有效用于提取连翘叶片DNA，纯度高，效率高。
文档编号C12N15/10GK101914525SQ20101024351
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者冯卫生, 李汉伟, 苏秀红, 董诚明, 陈随清 申请人:河南中医学院