一种检测喹诺酮类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒的制作方法

专利名称：一种检测喹诺酮类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测喹诺酮类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒。
背景技术：
目前其中兽药残留问题是影响动物性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本 成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提 出了更高的要求。量子点(Quantum dot,QD)由于具有独特的光学和电学性质，使其荧光免 疫分析中得到越来越多的应用，作为荧光探针，QD的光学特性比在免疫荧光分析法中经常 采用的传统发色团如罗丹明6G或其它有机染料分子有明显的优越性QD的激发光谱宽，且 连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，荧光发射波长可通过改变量子点的大小而加 以调节，因而不同大小的半导体量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的荧光。量 子点可持续发光，其荧光寿命可达染料分子的100倍以上，比常规的酶联免疫吸附检测方 法的抗背景干扰能力强，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，在兽医学、医学、食品分 析等方面将会有更广阔的应用前景。喹诺酮类化合物(Quinolones，FQs)是一类人工合成的新型抗菌药，因其抗菌谱 广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小等特点，广泛用于人类和动物 多种感染性疾病的治疗。但该类药物的长期和广泛应用会造成畜产品的药物残留，并会导 致许多细菌对喹诺酮类化合物产生耐药性，不仅给人类健康带来极大的危害，同时也影响 了畜牧业的发展。因此，我国农业部第235号文件规定其残留限量为100yg/kg。但由于在 畜牧生产中不合理使用现象严重，使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康 危害的潜在威胁已倍受关注。动物组织中喹诺酮类化合物残留的检测方法主要采用液相色 谱法、液相色谱_联质谱法、酶联免疫法等。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测喹诺酮类化合物的量子点荧光免疫试剂盒。本发明提供的检测喹诺酮类化合物的量子点荧光免疫试剂盒，包括喹诺酮类化合
物特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为喹诺酮类化合物半抗原与载体蛋
白的偶联物；其结构式如式ι所示U H 所述试剂盒还包括浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和量子点标记抗 抗体；所述试剂盒由喹诺酮类化合物特异性抗体、包被原、标准品溶液、浓缩洗涤液、浓 缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和量子点标记抗抗体组成。所述喹诺酮类化合物特异性抗体为诺氟沙星单克隆抗体或诺氟沙星多克隆抗体， 所述诺氟沙星单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 3779的对11种喹诺酮类化合物(恩诺 沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟 沙星和依诺沙星)都有交叉反应的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株QNs分泌的抗体。所述标准品溶液中标准品的浓度为0 μ g/L、0. 5 μ g/L、1. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、 22. 5 μ g/L或112. 5 μ g/L,所述标准品为诺氟沙星； 所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐 缓冲液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的 磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是pH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、 PH值为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。
基碳化
所述包被原是按照如下方法制备得到的
将每70mg载体蛋白溶于ImL 0. OlM PBS缓冲液中，再加入30mgEDC (乙基二甲氨 亚胺)，25°C搅拌8h，称为A液；
将40mg喹诺酮类化合物半抗原溶于ImL 0. OlM PBS缓冲液，称为B液； 将B液加入到A液中，25°C搅拌反应12h，将得到的产物透析，得到所述包被原。 所述喹诺酮化合物半抗原的结构式如式II所示 所述喹诺酮化合物半抗原是按照如下方法制备得到的1、将每320mg诺氟沙星与 143 μ L 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亚砜中，再加入700mg碳酸钾和30mg碘化钠， 70°C回流提取3天，再静置1天；II、用乙酸乙酯对步骤I得到的产物进行萃取，取有机相， 将有机相干燥，得固体残留物；III、将固体残留物加到2mL IM氢氧化钠水溶液和500μ L乙 醇中，70°C反应8h，得到喹诺酮半抗原。所述量子点标记抗抗体为量子点QD650标记羊抗鼠抗抗体；所述载体蛋白为鼠血 清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；
所述喹诺酮类化合物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲 喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依诺沙星。本发明的另一个目的是提供一种检测喹诺酮类化合物的方法。本发明提供的检测喹诺酮类化合物的方法包括以下步骤1)样品前处理将每Ig动物组织勻浆后，加入4mL乙腈-0. IM氢氧化钠混合溶液，混勻；以3000g 的速度离心IOmin ；取2mL上清液氮气吹干，加入ImL复溶液溶解干燥的残留物，再加入ImL 正己烷充分混合，3000g离心5min，取下层溶液用复溶液稀释2倍获得样本溶液，所述动物 组织为猪肉或鸡肉；所述乙腈-0. IM氢氧化钠混合溶液是由体积比为84 16的乙腈和浓 度为0. IM氢氧化钠水溶液混合得到；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值 为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；2)利用上述的检测喹诺酮类化合物的量子点荧光免疫试剂盒检测步骤1中的样 本溶液；所述喹诺酮类化合物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲 喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依诺沙星。由保藏号为CGMCC No. 3779的对11种喹诺酮类化合物都有交叉反应的诺氟沙星 单克隆杂交瘤细胞株QNs分泌的喹诺酮类化合物单克隆抗体也属于本发明的保护范围。保藏号为CGMCC No. 3779的对11种喹诺酮类化合物都有交叉反应的诺氟沙星单 克隆杂交瘤细胞株QNs也属于本发明的保护范围。该细胞株已于2010年4月12日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯 路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 3779。诺氟沙星的通用名称为诺氟沙星，化学名称为1-乙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧 代-7-α-哌嗪基)-3-喹啉羧酸。本发明的实验证明，本发明的量子点荧光免疫试剂盒主要采用间接竞争方法定性 或定量检测喹诺酮类化合物的残留量，该试剂盒试剂盒的主要内容物采用了方便使用的工 作液形式，工作液保存性及稳定性好；利用本发明试剂盒检测喹诺酮类化合物的残留量的 方法，可用于检测动物组织如猪肉、鸡肉等样品中喹诺酮类化合物的残留量，具有样品前处 理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且 适合大量样本的筛查。因此本发明检测方法及其专用试剂盒将在动物源性食品中喹诺酮类 化合物的残留检测中发挥重要作用。


图1为喹诺酮类化合物标准曲线图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中各试剂盒的检测原理如下当在量子点荧光板微孔上预包被喹诺酮类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物时， 加入样本溶液或标准品溶液后，再加入喹诺酮类化合物抗体溶液，样本中残留的喹诺酮类化合物或喹诺酮类化合物标准品与量子点荧光板上包被的喹诺酮类化合物偶联抗原竞争 喹诺酮类化合物抗体，加入量子点标记抗抗体，用荧光酶标仪检测荧光强度，样本荧光强度 值与样本中喹诺酮类化合物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中喹诺酮类化 合物的残留量。实施例1、量子点荧光免疫试剂盒的制备及其检测方法一、量子点荧光免疫试剂盒包括(1)包被原溶液将包被原溶解于包被缓冲液中得到的，其中包被原在包被原溶 液中的浓度为0. 08μ g/mL ；包被原为喹诺酮类化合物半抗原与牛血清白蛋白偶联物；(2)量子点标记的羊抗鼠抗抗体工作液用稀释液稀释量子点标记的羊抗鼠抗抗体得到的，稀释度为1 500;稀释液为50mL牛血清白蛋白和950mL磷酸盐缓冲液混合得到；所述磷酸盐缓冲液 的浓度为0. 02M, pH值为7.4。羊抗鼠抗抗体购自北京博奥森，产品目录号为bs_0295G。(3)诺氟沙星标准品溶液将标准品溶于稀释液中得到的，其中标准品在诺氟沙星标准品溶液的浓度分别为 0 μ g/L、0. 5 μ g/L、l. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、22. 5 μ g/L 或 112. 5 μ g/L，稀释液为 ρΗ7· 4、0· 05Μ
的磷酸盐缓冲液。诺氟沙星标准品为诺氟沙星，购自中国药品生物制品检定所，产品目录号为 130450-200705 ο(4)喹诺酮类化合物单克隆抗体工作液将单抗溶于稀释液中得到的，单抗与稀释液的配比为1 1000;单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 3779的对11种喹诺酮类化合物都有交叉反 应的喹诺酮甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株QNs产生。稀释液为25g酪蛋白、0. 03g叠氮化钠和IOOOmL磷酸盐缓冲液混合得到。(6)浓缩洗涤液将0. 05g叠氮钠化钠与IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐 缓冲液混合得到。(7)浓缩复溶液将0.^牛血清白蛋白与1001^浓度为0.0511101/1、？!1值为7.4 的磷酸盐缓冲液混合而成。400mL/瓶，1瓶。(8)包被缓冲液pH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。(9)封闭液将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH 值为7. 4的磷酸盐溶液混合而成。二、试剂盒的制备1、量子点荧光板的制备(1)喹诺酮类化合物半抗原的合成诺氟沙星(Norfloxacin，NOR)的哌嗪环仲氨基与4_溴丁酸乙酯结合来制备NOR 半抗原将320mg NOR与143 μ L 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亚砜中，再加入700mg 碳酸钾和30mg碘化钠，70°C回流3天，再静置1天；然后加水400mL，用100mL2X乙酸乙酯 萃取，萃取相经水洗涤、无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，得浅黄色粘稠状液体。酯的碱性水解在上述黄色粘稠状液体中加入IM氢氧化钠(2mL)，再加入500 μ L乙醇助溶，70°C反应8h(溶液由浑浊变为浅黄色澄清液体，说明水解成功)，用盐酸调节pH 为7左右。用氮气吹干上述溶液，冷冻干燥过夜，得到诺氟沙星半抗原。
所述诺氟沙星半抗原的结构式如式II所示
〇O
II)。(2)包被原的制备采用活性酯法将诺氟沙星半抗原和卵清蛋白(OVA)偶联得到 包被原。70mg卵清蛋白溶于ImL 0. OlM PBS中，再加入30mgEDC，25°C搅拌8h，称为A液。 将上述获得的40mg诺氟沙星半抗原溶于ImL 0. OlM PBS,称为B液，将B液加入到A液中得 到混合物。将混合物25°C搅拌反应12h。反应后的溶液转移到透析袋中，用0. OlM pH 7.2 的PBS透析3天，期间应换3次透析液。透析后，离心除去残余的沉淀，取上清液得到包被 原，分装后-20°C保存。所述包被原为喹诺酮类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所
OVA
O
(式 I)。(3)量子点荧光板的制备用包被缓冲液将步骤(2)得到包被原(即诺氟沙星半抗原和卵清蛋白偶联物)稀 释成0. 08 μ g/mL,每孔加入100 μ 1，37°C温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的洗涤液洗涤2 次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封闭液，37°C温育lh，倾去孔内液体，干燥后 包被有包被原的量子点荧光板，用铝膜真空密封保存。2、喹诺酮类化合物单克隆抗体的制备(1)免疫原合成将诺氟沙星半抗原和牛血清白蛋白通过活性酯法偶联得到免疫原。具体制备过程如下与包被原的制备方法相同，不同的是将卵清蛋白(OVA)替换 为牛血清白蛋白BSA。(2)动物免疫与细胞融合
采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以以步骤2的(1)获得的免疫原进行免疫，免疫 剂量为IOOyg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下 多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次， 四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5 1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合。 采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化， 直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将此细胞株命名为QNs。经筛选得到对11种喹诺酮类化合物(恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、 达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星)都有交叉反应的诺 氟沙星单克隆杂交瘤细胞株QNs，该细胞株已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生 物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3779。(3)细胞冻存和复苏取单克隆杂交瘤细胞株QNs CGMCC No. 3779用冻存液制成 5X IO6个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放 入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将上述培养的杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培 养，用下述辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠得到的细胞 培养基，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (体积百分含量)，使碳酸氢钠在细胞 培养基中的终浓度为0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的PH为7. 4。辛酸-饱和硫酸铵法1) 50 %饱和度盐析取上述细胞培养液5mL，加等量 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢二钠2. 86g，氯化 钾0. 2g，氯化钠8. Sg)混勻，然后逐渐滴加等体积的饱和硫酸铵(pH7. 4)溶液(使硫酸铵溶 液的饱和度达到50% )，边加边搅拌，室温放置30min，3000g离心30min，弃上清液留沉淀。 2)33%饱和度盐析在步骤1)得到的沉淀中分别加入5mL 0. Olmol/LPBS (1L溶液中含有磷 酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢二钠2. 86g，氯化钾0. 2g，氯化钠8. 8g)溶解沉淀，再加饱和 硫酸铵溶液达到33%饱和度，边加边搅拌，室温放置30min，弃上清液留沉淀。重复操作2 次。3)脱盐取0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢 二钠2. 86g，氯化钾0. 2g，氯化钠8. Sg)溶解步骤2)得到的沉淀，装于透析袋中，悬于盛有 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢二钠2. 86g，氯化 钾0. 2g，氯化钠8. Sg)的烧杯中脱盐，放置于4°C，每天换液3-4次，BaCl2检测直至透 析液中无硫酸根离子为止。4)透析完毕，3000g离心5min，取上清液得到纯化的诺氟沙星单 克隆抗体，_20°C冰箱保存。3、量子点与羊抗鼠抗体的制备表面氨基(-NH2)修饰的水溶性量子点QD650购自北京中科物源，产品目录号为 W-4007-650 ；羊抗鼠抗体购自北京博奥森，产品目录号为bs-0259G ；(1)活化量子点表面氨基(-NH2)修饰的水溶性QD6502mL经20 μ 1偶联剂 SMCC (琥珀酰亚胺4- [N-甲基马来酸]-1-羧环己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子点。凝胶柱去除过量的SMCC。(2)还原羊抗鼠抗体羊抗鼠抗体2mL中加入还原剂DTT 25 μ 1 (dithiothreitol， 二硫苏糖醇)，断开二硫键形成的巯基。凝胶柱去除DTT。(3)将活化的量子点和还原的羊抗鼠抗体混合，37°C反应1小时，10 μ 1 beta-巯 基乙醇终止反应，形成量子点标记的羊抗鼠抗体。三、用步骤一所述试剂盒检测样品中残留的喹诺酮类化合物方法方法如下1、样品前处理样品为猪肉、鸡肉等组织样本。 将Ig动物组织勻浆后，加入4mL乙腈-0. IM氢氧化钠混合溶液，混勻；以3000g的 速度离心IOmin ；取2mL上清液氮气吹干，加入ImL复溶液溶解干燥的残留物，再加入ImL正 己烷充分混合，3000g离心5min，取下层溶液用复溶液稀释倍数2获得样本溶液，进行试验 分析；所述乙腈-0. IM氢氧化钠混合溶液是由体积比为84 16的乙腈和浓度为0. IM氢氧 化钠水溶液混合得到；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐 缓冲液稀释10倍得到的。2、检测向步骤一获得包被有包被原(诺氟沙星半抗原与卵清蛋白偶联物)的量子点荧光 板微孔中加入诺氟沙星标准品溶液或样本溶液50 μ 1，再加入诺氟沙星单克隆抗体工作液 50 μ 1，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min ；倒出孔中液体，每孔加入250 μ 1洗涤液， 30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入量子点标记的羊 抗鼠抗抗体工作液100mL，37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤；用荧光 酶标仪，测定每孔荧光强度值。3、结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的荧光强度平均值(B)除以第一个标准溶液 (0标准)的荧光强度值(BO)再乘以100%，即百分荧光值。计算公式为百分荧光值(%) = (B/BO) X 100%以诺氟沙星标准品溶液的浓度(μ g/L)的半对数值为X轴，百分荧光值为Y轴，绘 制标准曲线图(图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分荧光值，相对应每一个样品的浓 度则可从标准曲线上读出样本中喹诺酮类化合物的残留量。本发明中检测结果的分析也可 以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专 业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1. 5小时可以完成。按照上述方法获得三批试剂盒(01批、02批、03批)。实施例2、试剂盒灵敏度、准确度和保存期试验一、试剂盒灵敏度实验对零标准溶液(即稀释液为pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液)进行20次检测，测定 结果的平均值加上3倍标准差作为试剂盒的最低检测限。表1零标准测定结果统计表 yg/L 由表1可知，试剂盒的最低检测限为0. 5μ g/L。二、标准品精密度试验从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取10个试剂盒，
测定4. 5 μ g/L标准品溶液的发光强度值，计算变异系数。检测方法与实施例1中实验三所
述一致。实验设3次重复，结果如表2所示，表明变异系数范围在5. 3% 14. 6%之间，符 合精密度小于或等于20%的规定。表2标准可重复性试验(CV % ) 三、样本精密度和准确度试验1、样品精密度试验将不含喹诺酮类化合物的猪肉、鸡肉按照实施例1的方法进行样品前处理后，添 加诺氟沙星标准品，使其终浓度为10μ g/kg。从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02 批、03批)中每批抽取3个试剂盒，进行实验，每个实验重复5次，分别计算变异系数，结果 如表3-4所示。结果表明猪肉、鸡肉样本的变异系数均小于20%，符合了《农业部文件》农 医发200517号附件2试剂盒备案参考评判标准。表3猪肉样本可重复性试验 表4鸡肉样本可重复性试验 2、样本准确度试验将不含喹诺酮类化合物的猪肉、鸡肉按照实施例1中所述的样品前处理方法进行 处理，然后向每种组织中加入诺氟沙星标准品，使其终浓度分别为20μ g/kg和100μ g/kg ； 然后用实施例1中所述的试剂盒检测猪肉、鸡肉中喹诺酮类化合物，每个浓度做4个平行， 分别计算准确度(准确度=实测值/添加值)。结果如表5所示，表明各样本以20 μ g/kg、 100 μ g/kg诺氟沙星添加回收率均在75. 2% -99. 之间。表5试剂盒的准确度
四、交叉反应率试验选择与喹诺酮类化合物有类似结构和类似功能的13种药物测定交叉反应率。通 过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反 应率。交叉反应越小，那么此试剂盒对喹诺酮类化合物的检测特异性就越好。交叉反应率 (%)=(抑制50%诺氟沙星的浓度/抑制50%的喹诺酮类化合物类似物浓度)*100%表6试剂盒的特异性
药物名称交叉反应率(％)
环丙沙星100
恩诺沙星95
氧氟沙星120
诺氟沙星170
达氟沙星89
氟甲喹85 实验结果表明，本发明所研制的试剂盒对环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙 星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星的特异性好。五、试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8 °C，保存6个月后，测定试剂盒的50 %抑制浓度、喹诺酮类化合物实际添加测定，结果表明试剂盒的50%抑制浓度均在正常范围之内。考虑在运输和 使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存的条件下放置6天，进行加速 老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂 盒放入-20°C冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出 试剂盒可以在2_8°C至少可以保存6个月以上。
权利要求
一种检测喹诺酮类化合物的量子点荧光免疫试剂盒，包括喹诺酮类化合物特异性抗体、包被原和标准品溶液所述包被原为喹诺酮类化合物半抗原与载体蛋白的偶(式I)。FSA00000215988500011.tif
2.根据权利要求1所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括浓 缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和量子点标记抗抗体；所述试剂盒由喹诺酮类化合物特异性抗体、包被原、标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩复 溶液、包被缓冲液、封闭液和量子点标记抗抗体组成。
3.根据权利要求1或2所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于所述喹诺酮类化合物特异性抗体为诺氟沙星单克隆抗体或诺氟沙星多克隆抗体，所述 诺氟沙星单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 3779的对11种喹诺酮类化合物(恩诺沙星、 氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星 和依诺沙星)都有交叉反应的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株QNs分泌的抗体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于所述标准品溶液中标准品的浓度为ο μ g/L、0. 5 μ g/L、l. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、22. 5 μ g/L 或112. 5μ g/L，所述标准品为诺氟沙星；所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐缓冲 液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的磷酸 盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是PH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液； 所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH值 为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于 所述包被原是按照如下方法制备得到的将每70mg载体蛋白溶于ImL 0. OlM PBS缓冲液中，再加入30mg乙基二甲氨基碳化二 亚胺，25°C搅拌8h，称为A液；将40mg喹诺酮类化合物半抗原溶于ImL 0. OlM PBS缓冲液，称为B液； 将B液加入到A液中，25°C搅拌反应12h，将得到的产物透析，得到所述包被原； 所述喹诺酮化合物半抗原的结构式如式II所示 (式 II)。
6.根据权利要求1-5中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于所述喹诺酮化合物半抗原是按照如下方法制备得到的1、将每320mg喹诺酮化合物与 143 μ L 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亚砜中，再加入700mg碳酸钾和30mg碘化钠， 70°C回流提取3天，再静置1天；II、用乙酸乙酯对步骤I得到的产物进行萃取，取有机相， 将有机相干燥，得固体残留物；III、将固体残留物加到2mL IM氢氧化钠水溶液和500μ L乙 醇中，70°C反应8h，得到喹诺酮半抗原。
7.根据权利要求1-6中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于所述量子点标记抗抗体为量子点QD650标记羊抗鼠抗抗体；所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；所述喹诺酮类化合物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、 噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依诺沙星。
8.—种检测喹诺酮类化合物的方法，包括以下步骤1)样品前处理将每Ig动物组织勻浆后，加入4mL乙腈-0. IM氢氧化钠混合溶液，混勻；以3000g的速 度离心IOmin ；取2mL上清液氮气吹干，加入ImL复溶液溶解干燥的残留物，再加入ImL正 己烷充分混合，3000g离心5min，取下层溶液用复溶液稀释2倍获得样本溶液，所述动物组 织为猪肉或鸡肉；所述乙腈-0. IM氢氧化钠混合溶液是由体积比为84 16的乙腈和浓度 为0. IM氢氧化钠水溶液混合得到；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为 7. 4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；2)利用权利要求1-7中任一所述的检测喹诺酮类化合物的量子点荧光免疫试剂盒检 测步骤1)中的样本溶液；所述喹诺酮类化合物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、 噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依诺沙星。
9.由保藏号为CGMCCNo. 3779的对11种喹诺酮类化合物都有交叉反应的诺氟沙星单 克隆杂交瘤细胞株QNs分泌的喹诺酮类化合物单克隆抗体。
10.保藏号为CGMCCNo. 3779的对11种喹诺酮类化合物都有交叉反应的诺氟沙星单克 隆杂交瘤细胞株QNs。
全文摘要
本发明公开了一种检测喹诺酮类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒。本发明提供的检测喹诺酮类化合物的量子点荧光免疫试剂盒，包括喹诺酮类化合物特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为喹诺酮类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物。本发明的实验证明，本发明的试剂盒具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。
文档编号C12R1/91GK101915844SQ20101024408
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者史为民, 吴聪明, 张素霞, 曹兴元, 汤树生, 沈建忠, 王战辉, 程林丽 申请人:中国农业大学