专利名称：一种推断cyp3a4基因表达量的方法
技术领域：
本发明涉及一种推断CYP3A4基因表达量的方法。
背景技术：
不同的人对同一种药物的吸收、运输和代谢有很大的差异，同一处方剂量的药物对不同病人的治疗效果和毒副作用的差异很大，因此，长期以来，药物作用的个体差异一直是临床治疗中影响药物疗效的一个重要因素。药效个体差异的一个主要原因是药物代谢能力的差异，药物的代谢主要是由一系列药物代谢酶来执行的，因而，对药物代谢酶基因多样性的研究是了解药效个体差异原因的基础。细胞色素P4503A4 (Cytochrome P4503A4，简写为CYP3A4)是人体内第一大药物代谢酶，约占成人肝脏CYP450酶总量的25%，能够代谢超过50 %的临床常用药物，到目前为止，共有20个等位基因被报道。CYP3A4的活性与其在人体肝脏中的表达量相关，其表达水平能够决定药物的疗效和安全性，但是，由于CYP3A4基因在人体内的表达存在很大的个体差异，因此，个人对CYP3A4相关药物代谢能力也就存在相当大的差异，这给临床安全有效用药带来了困难。目前，对大部分的药物代谢相关基因的研究，主要是通过检测其基因序列的多态性是否关联到药物代谢相关基因的表达量或其编码的蛋白活性的改变来进行的，但大部分的基因多态性只在某些研究或某些特定人群中具有意义，在另一些研究中可能得到相反的结果。同时，由于CYP3A4在人群中的频率极低，因此，目前尚无法通过SNP(Single nucleotide polymorphism，单一核苷酸多态性)检测来解释CYP3A4的表达量和其活性在人群中所存在的相当大的差异。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种推断CYP3A4基因表达量的方法，它可以用来解释CYP3A4相关药物药效的个体差异，指导临床合理用药。为解决上述技术问题，本发明的推断CYP3A4基因表达量的方法，通过检测个体 DNA的CYP3A4基因的一个CpG位点的甲基化程度，推断该个体的CYP3A4基因的表达量。所述CpG位点的甲基化程度通过下列步骤进行检测(1)抽取受试者外周血样本的DNA ；(2)用亚硫酸氢盐处理DNA样本；(3)用特异性BSP引物扩增步骤(2)得到的DNA样本；(4)纯化步骤(3)的扩增产物；(5)将步骤(4)得到的产物与T载体连接，转化0冊3感受态菌，然后筛选出阳性克隆；(6)对步骤(5)中筛选出的阳性克隆，用通用引物进行原位菌落PCR，并测定产物的碱基序列；
(7)判断步骤(6)中测得的碱基序列在该CpG位点是否发生了 C — T的碱基变化， 计算不发生C —T碱基变化的克隆数量，该克隆数量与步骤(5)中筛选出的克隆总数的比率，即为该CpG位点的甲基化程度。所述CpG位点是SEQ ID NO 1中第159位胞嘧啶碱基。所述步骤(3)中的引物包括正向引物和反向引物，该正向引物具有SEQ IDNO :2所示的序列，该反向引物具有SEQ ID NO: 3所示的序列。所述步骤(5)中筛选出的阳性克隆的数目至少为20个。所述甲基化程度> 95%时，推断该个体的CYP3A4基因的表达量低；所述甲基化程度彡95%时，则推断该个体的CYP3A4基因的表达量高。本发明通过检测人体血液DNA位点的甲基化程度，获得CYP3A4基因在人体内的表达信息，进而推断出个体对相关药物代谢能力的差异，以及由此造成的药效个体差异，从而能够指导临床合理用药，提高用药的安全性和有效性，避免不良反应，减少药物治疗的费用和风险，实现个体化治疗的目标。
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明附图是本发明实施例1的SEQ ID NO :1第159位碱基的甲基化程度与CYP3A4表达量的相关示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1收集73例正常肝脏的病理活检样本，每例约50 200mg。前述样本采集后立刻浸入ImL RNALater中，4°C过夜，待样本被RNALater充分浸透后，转移至-70°C保存。样本经过勻浆之后，利用Qiagen公司的AllPr印DNA/RNA Mini试剂盒抽取DNA和RNA。利用PrimeScript 1st Strand cDNA 合成试剂盒，反转录生产 cDNA。以人类基因组DNA(Promega，Catalog No. G152A)作为标准品，ACTB基因作为参照基因，在ABI7900HT仪器上通过荧光实时定量PCR检测CYP3A4在各个肝脏样本中的相对表达量。定量PCR的引物为正向GCTCTTCAAGAAATCTGTGCCTG(SEQ ID N0:4)，反向 TCTACACAGACAATGAGAGAGCTCAA(SEQ ID NO :5)，反应体系为 20 μ 1 IX QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，0. 3 μ M引物，2 μ 1用双蒸水20倍稀释的反转录产物cDNA，循环参数为95°C变性15分钟，94°C变性15秒，57°C退火30秒，72°C延伸30秒，共40个循环。在73例样本中，挑选CYP3A4高表达8例，低表达8例。用亚硫酸氢钠处理这16 例样本DNA，然后用特异性BSP引物扩增，引物为正向GTAGTTTGATTTTAGATTGTTGTG(SEQ ID NO 2)；反向 TAACCCCTCCTCTACATTCTATT(SEQ ID NO :3)。扩增产物使用 Qiagen 公司的Qiaquick PCR Purification kit进行纯化后，利用T4DNA连接酶与pMD18_T载体连接，转化入Dffia感受态菌，蓝白筛选不少于20个阳性克隆，然后用载体通用引物T7和SP6进行原位菌落PCR，产物直接测序。根据测序结果，计算CYP3A4基因上游，距离CYP3A4基因最近的CpG岛中位点的甲基化程度，每个位点的甲基化程度由该位点甲基化的克隆数除以总的克隆数得到。通过t 检验，发现在CYP3A4低表达的样本中，第159位碱基的甲基化程度高；在CYP3A4高表达的样本中，第159位碱基的甲基化程度低，P值为0.014。附图显示了 SEQ ID NO :1第159位碱基的甲基化程度与CYP3A4表达量的关系，图中横坐标“mRNA level”表示基因CYP3A4在肝脏中的表达量大小，纵坐标“SlOmethylation status”表示SEQ ID NO :1中第159位碱基的甲基化程度(甲基化比非甲基化所得的比率，最大为1)，从该图中可以看出，当位点完全被甲基化时，CYP3A4表达量降至0. 67以下；当甲基化程度为95%及以下时，CYP3A4的表达量明显上升到1. 53以上，差异达到显著性。实施例2上述实施例1验证了 CYP3A4基因序列第159位碱基的甲基化程度与CYP3A4基因在人体中的表达量相关，据此，可以通过检测受试者的CYP3A4基因序列第159位碱基的甲基化程度，来推断CYP3A4基因在该受试者体内的表达情况。具体方法如下收集受试者外周血血液样本，抽取DNA。DNA样本经亚硫酸氢钠处理后，用特异性 BSP 引物扩增。引物为正向 GTAGTTTGATTTTAGATTGTTGTG(SEQ ID NO :2)；反向 TAACCCCTCCTCTACATTCTATT (SEQ ID NO :3)。扩增产物使用 Qiagen 公司的 Qiaquick PCR Purification kit进行纯化后，利用T4DNA连接酶与pMD18_T载体连接，转化Dffia感受态菌，蓝白筛选不少于20个阳性克隆。然后用载体通用引物T7和SP6进行原位菌落PCR，产物直接测序。判断测得的碱基序列在SEQ ID NO 1序列的第159位是否发生了 C — T (胞嘧啶变为胸腺嘧啶)碱基变化，计算不发生C — T碱基变化的克隆数量在筛选出的克隆总数中的比率，得到CpG位点的甲基化程度。若位点甲基化比率大于95%，就认为该受试者的CYP3A4 基因表达量低；反之，若所得甲基化比率小于或等于95%，则认为该受试者的CYP3A4基因
表达量高。由于CYP3A4基因的表达量与CYP3A4酶的活性相关，因此，本发明的方法可用以解释CYP3A4基因对药物代谢的效能，从而确定药效个体差异的遗传基础，为指导临床合理用药，提高用药的安全性和有效性，避免不良反应，减少药物治疗的费用和风险，最终实现个体化治疗等目标提供方法和手段。
权利要求
1.一种推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于通过检测个体DNA的CYP3A4基因的一个CpG位点的甲基化程度，推断该个体的CYP3A4基因的表达量。
2.如权利要求1所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述CpG位点的甲基化程度通过下列步骤进行检测(1)抽取受试者外周血样本的DNA；(2)用亚硫酸氢盐处理DNA样本；(3)用特异性BSP引物扩增步骤(2)得到的DNA样本；(4)纯化步骤(3)的扩增产物；(5)将步骤⑷得到的产物与T载体连接，转化Dffia感受态菌，然后筛选出阳性克隆；(6)对步骤(5)中筛选出的阳性克隆，用通用引物进行原位菌落PCR，并测定产物的碱基序列；(7)判断步骤(6)中测得的碱基序列在该CpG位点是否发生了C —T的碱基变化，计算不发生C —T碱基变化的克隆数量，并用该克隆数量除以步骤(5)中筛选出的克隆总数，计算该CpG位点的甲基化程度。
3.如权利要求1或2所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述CpG位点是SEQ ID NO 1中第159位胞嘧啶碱基。
4.如权利要求2所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述步骤(3)中的引物包括正向引物和反向引物，该正向引物具有SEQ ID NO :2所示的序列，该反向引物具有SEQ ID NO 3所示的序列。
5.如权利要求2所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述步骤(5)中的T载体为pMDIS-T载体。
6.如权利要求2所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述步骤(5)中采用蓝白斑筛选方法筛选阳性克隆。
7.如权利要求2所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述步骤(5)中筛选出的阳性克隆的数目至少为20个。
8.如权利要求1或2所述的推断CYP3A4基因表达量的方法，其特征在于所述甲基化程度> 95%时，推断该个体的CYP3A4基因的表达量低；所述甲基化程度< 95%时，则推断该个体的CYP3A4基因的表达量高。
全文摘要
本发明公开了一种推断CYP3A4基因表达量的方法，通过检测人体血液DNA样本中CYP3A4基因的一个CpG位点的甲基化程度，来推断CYP3A4基因在该人体内的表达信息。该方法可以推断出人体中的CYP3A4酶的活性，从而可用以解释药效的个体差异性，指导临床合理用药。
文档编号C12Q1/68GK102344958SQ201010245428
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者寿维华, 施锦绣, 王大志, 黄薇 申请人:上海人类基因组研究中心