专利名称：禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测的制作方法
禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测
技术领域：
本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性基因频率的高 通量分子检测方法，可用于监测苯并咪唑类杀菌剂抗药性禾谷镰孢菌群体发展动态，进行 抗药性小麦赤霉病的流行预测和早期预警。
背景技术：
小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一种世界性 病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的 复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应 用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀 菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制， 他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化 性，作用位点单一，加上施用频率高，使用多年后许多植物病原真菌群体就会出现抗药性优 势生理小种，使药剂防治完全失去效果。经过近几年的努力，南京农业大学杀菌剂实验室 研究发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由于禾谷镰孢菌β 2-微管蛋白基因 (FGSG_06611. 3)突变造成，该基因编码167位氨基酸的密码子突变(由苯丙氨酸Phe突变 为酪氨酸Tyr，碱基由TTT — TAT,为单碱基突变)引起该菌对多菌灵的抗药性，该基因型在 田间抗药性的赤霉病菌群体中占97%以上。由于病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例很低时(1 5% ) 即可引起抗药性病害流行，使药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在 含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。这种对药剂的敏感性测定 方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限；当抗药性基因频率在以下时难 以发现。因此，传统的抗药性监测方法只能核实药剂防治失败是否由于抗药性造成，不能早 期预警。早期检测病原群体中抗药性生理小种/抗药性基因的频率，及早实施抗药性治理 策略和实施早期预警，是抗药性治理最有效的措施。在抗药性机制研究基础上，根据基因点 突变的原理，应用常规的核酸技术如ASO-PCR技术等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类 杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测样本，但一个PCR反应体系只能检测一个菌株对多菌 灵杀菌剂的敏感性，而且也只能在整个PCR反应体系结束之后通过电泳检测获得所测定的 单个菌株对多菌灵敏感性。实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法则改变了 病原菌对杀菌剂敏感性的检测只能单个样本进行检测的现实，它具有(1)检测的高通量， 即在一个反应体系中，可以对所有待检样品对杀菌剂的敏感性测定；(2)检测结果的实时 性，在PCR反应进行中可以了解样品中抗药性菌株亚群体的大小；(3)高效性，经典的平皿 法(至少两周以上才能获得结果)、常规的ASO-PCR等技术测定抗药性菌株只能进行单个对 杀菌剂的敏感性的测定，而这种方法则同时对大量样品进行测定，耗时仅为6小时，可以准 确了解当年的抗药性菌株亚群体发生、发展、流行的态势，有效的指导当年用药。⑷使在早 期检测低频率的抗药性基因成为可能。
该发明采用实时定量PCR方法检测禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性基因频率，包括 样品的前处理、基因组DNA的提取、实时定量PCR扩增的过程。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种对禾谷镰孢菌多菌灵抗药性基因频率的快 速检测方法。该技术首次利用Cycling probe Real time PCR，根据抗性菌株基因型，优化 反应条件，实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)能在小麦赤霉病发病期和前期进 行大量、快速和简便的抗药性亚群体的诊断和检测，检测准确率达到96%以上，对及时采取 有效措施控制当季抗药性病害流行具有实用价值。技术方案禾谷镰孢菌抗多菌灵的基因检测基于β 2_微管蛋白基因 (FGSG_06611. 3)其编码第167位氨基酸密码子发生点突变，TTT(Phe) — TAT(Tyr)。禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法，共分三步(1)采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和 待测样品的核基因组DNA。(2)运用引物和设计的特异性Cycling Probe进行实时定量PCR反应，分别建立抗 药性菌株和敏感菌株检测的标准曲线。禾谷镰孢菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术的关键是用于实时定 量PCR的Cycling probe具有特异性，设计的依据是抗药性菌株在β2-微管蛋白第167位 由 Phe (TTT) — Tyr (TAT)。①扩增禾谷镰孢菌β 2_微管蛋白基因片断的引物对Codonl67F 5' AAGCCATTGATGTTGTTCG 3'Codonl67R 5' CATGACGGTAGAAATCAGGTAG 3'②特异性 Cycling probePl 5，-(FAM)CATAACGGAA @AGG(Eclipse)-3，P2 5，-(HEX)CATAACGGAA 因AGG(Eclipse)_3，实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序反应体系10XCycleavePCR BufferdNTP Mixture (各 2. 5mM)Mg Solution(25mM)Codonl67F(10yM)Codonl67R(10yM)Ρ1(5μΜ)P2 (5 μ Μ)TliRNase H ΙΙ(200υ/μ 1)TaKaRa Ex Taq HS (5U/ μ 1)dH20(灭菌蒸馏水)DNA 模板 *_
5 2. 5μ L 3μ L 5 μ L 0. 5μ L 0. 5μ L 0. 6μ L 1 μ L 0. 5μ L 0· 25 μ L 9. 15 μ L 2. 0μ L
总体积25iiL*DNA模板敏感和抗性菌株各加入1 P L。扩增条件预变性95°C30s|变性95°C5s退火55°C20s延伸72°C31s40个循环(3)待测样品运用上述体系和条件进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两 个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量及抗药性菌株在禾谷镰孢菌总量 中的比例。有益效果本发明禾谷镰孢菌抗多菌灵亚群体的检测方法，与现有技术相比，1.实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法改变了病原菌对杀菌剂敏感 性的检测只能进行单个样本检测，与常规的平皿检测和AS0-PCR分子检测相比，具有如下 优点和积极效果。(1)检测的高通量，即在一个反应体系中，可以对所有待检样品对杀菌剂的敏感性 测定；(2)检测结果的实时性，在PCR反应进行中可以了解样品中抗药性菌株亚群体的 大小；(3)检测高效性，经典的平皿法、常规的AS0-PCR等技术测定抗药性菌株只能进行 单个对杀菌剂的敏感性的测定，而这种方法则同时对大量样品进行测定，耗时仅为6小时， 可以准确了解当年的抗药性菌株亚群体发生、发展、流行的态势，有效的指导当年用药。(4)使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。(5)本发明是国际上首次利用Cycling probe实时定量PCR技术检测禾谷镰孢菌 抗多菌灵杀菌剂的抗药性亚群体。(6)与普通的SYBR GREEN I染料法相比，该技术可以同时检测出抗性和敏感菌株， 无须分管，实现多重检测。2、目前国内外研究单位均采用菌丝生长法检测禾谷镰孢菌抗药性，但该方法涉及 采样、分离培养需要3 5天和室内大量的药剂敏感性测定实验至少要6天，周期较长。目 前尚未有成熟的抗多菌灵小麦赤霉病菌分子检测技术应用。实时定量PCR则可以在一个反 应体系里将全部待测样品对多菌灵抗药性水平检测出来，在PCR反应的进行中即可知道该 反应的动态结果。这种方法具有高通量、快速、节本。这对及时了解抗药性病原菌亚群体的 发展动态，及时、合理地指导科学用药，有效治理抗药性，以及降低成本和减少环境污染具 有现实意义。3、在所测定的100株禾谷镰孢菌中约有4%的菌株对多菌灵具有抗药性，这个实 时定量PCR测定结果与传统菌落直径法测得的结果(4.02%)相吻合。四
图1敏感探针(P2)的扩增曲线图2抗性探针(P1)的扩增曲线图3定量PCR特异性检测演示 4 引物对 Codonl67F/Codonl67R 的 PCR 扩增条件图5敏感探针(P2)的标准曲线图6抗性探针(P1)的标准曲线
五具体实施例方式实施例ICycling Probe荧光染料定量PCR体系优化1. 1退火温度的优化为了保证检测的稳定性和可靠性，实验选用了宝生物工程 (大连)有限公司的CycleavePCR Core Kit DCY501试剂盒。PCR反应过程中，退火温度Tm值是反应特异性的重要保证，如果退火温度过低就 会产生非特异性产物。本发明中由于探针具有较强的特异性，对引物要求较低，只需其保证 有足够高的反应效率。参考引物Tm值，从50 60°C进行梯度PCR，结合试剂盒推荐退火温 度，确定了定量PCR检测的最适退火温度为55°C。1. 2探针浓度优化此步骤的目的是确定获得最适的探针浓度。探针的浓度高低， 会影响荧光信号的高低。当探针浓度过低，PCR产物过量，则无法得到正确的标准曲线。并 且为了防止两个荧光基团在同一体系的相互干扰，得调整两条探针的浓度。实验中25iU 反应体系中将加入探针(5iiM)从0. liU 2iU以0. 1 ill递增，以确定最佳探针浓度 Pl(5uM)0. 6u l,P2(5uM)lu 1。实施例2Cycling Probe荧光染料定量PCR的灵敏度标准品要求纯度高、均一、稳定。本实验中选取将纯化的PCR产物片段克隆到载体 上作为标准品。敏感菌株ZF43标准品拷贝数为1. 33X 106 1. 33X 102个，抗性菌株ZF52 标准品拷贝数为1. 78X 106 1. 78X 102个，均为10倍梯度稀释。对标准品进行扩增，分别 得到两组扩增曲线(图1，图2)，由此可知该技术最低检测拷贝数为102数量级，灵敏度至 少是普通PCR检测方法的10 100倍，亦比一般的SYBR GREEN I染料法灵敏度要高。实施例3Cycling Probe荧光染料定量PCR的特异性验证以敏感菌株ZF43、抗性菌株ZF52为模板分别进行定量PCR检测，反应具有很好的 特异性。当模板为ZF43时，在HEX通道下，P2探针有信号，检测出敏感菌株ZF43，而P1探 针没有信号(图3A)；此时在FAM通道下两个探针均无信号。当模板为ZF52时，仅在FAM通 道时能检测到信号(图3B)。实施例4Cycling Probe荧光染料定量PCR的标准曲线建立以敏感菌株ZF43、抗性菌株ZF52梯度稀释的标准品为模版，进行定量PCR反应。 实时定量PCR反应体系和条件反应体系lOXCycleave PCR Buffer 2. 5 u LdNTP Mixture (各 2. 5mM)3 u LMg Solution(25mM)5u L
Table 1 Results of test by Real time PCR
权利要求
禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real time quantitative PCR)技术检测病样中禾谷镰孢菌群体对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的基因频率。该检测方法共分三步(1)采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA。(2)运用引物和设计的特异性Cycling Probe进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和敏感菌株检测的标准曲线。实时定量PCR(Real time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序反应体系10×CycleavePCR Buffer 2.5μLdNTP Mixture(各2.5mM)3μLMg Solution(25mM)5μLCodon167F(10μM) 0.5μLCodon167R(10μM) 0.5μLP1(5μM) 0.6μLP2(5μM) 1μLTliRNase H II(200U/μl) 0.5μLTaKaRa Ex TaqTM HS(5U/μl) 0.25μLDNA模板(敏感和抗性菌株各加入1μL)2.0μLdH2O(灭菌蒸馏水) 补足至总体积25μL 扩增条件预变性95℃ 30s ↓变性95℃ 5s退火55℃ 20s延伸72℃ 31s40个循环(3)待测样品运用上述体系和条件进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在禾谷镰孢菌总量中的比例。
2.根据权利要求1，禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量实时检测技术其特 征在于用于实时定量PCR的Cycling探针具有特异性。设计的依据是抗药性菌株β 2-微 管蛋白基因的第167位氨基酸密码子发生突变，由TTT(Phe) — TAT(Tyr)。①扩增禾谷镰孢菌β2_微管蛋白基因片断的引物对 Codonl67F 5' AAGCCATTGATGTTGTTCG 3' Codonl67R 5' CATGACGGTAGAAATCAGGTAG 3'②特异性Cycling探针Pl 5，- (FAM) CATAACGGAA @ AGG (Eclipse) -3， P2 5，- (HEX) CATAACGGAA @ AGG (Eclipse) -全文摘要
本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法，可用于小麦赤霉病菌的抗药性监测和抗药性病害流行的早期预警。本发明基于97％以上的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性基因型属于β2-微管蛋白基因167位点突变的研究基础建立起来的一种抗药性高通量检测技术。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取已知敏感和抗药性菌株及待测样品的基因组DNA；(2)进行特异性实时定量PCR反应，建立标准曲线；(3)对照标准曲线求出测定样品中的抗药性基因频率。该方法具有高通量、快速、准确的特点。抗药性基因频率检出灵敏度可达万分之一至十万分之一，准确率达96％以上。
文档编号C12Q1/68GK101985652SQ20101024700
公开日2011年3月16日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者周明国, 王建新, 罗卿权, 陈长军 申请人:南京农业大学