微生物菌体的保存方法及微生物菌体的混悬液的制作方法

专利名称：微生物菌体的保存方法及微生物菌体的混悬液的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过将具有腈水合酶活性的微生物菌体以规定浓度在菌体混悬液中 保存来稳定地保存该微生物菌体的方法。此外，本发明还涉及以规定浓度含有具有腈水 合酶活性的微生物菌体的菌体混悬液。
背景技术：
微生物产生的酶在很多情况下作为化学转化反应的酶而使用。尤其是通过利用 具有腈基的水合或水解作用的腈水合酶、腈水解酶等，可以廉价地生产在化学工业上重 要的酰胺、羧酸、α-羟基羧酸等。此外，通过利用具有光学特异性的水合能力或光学 特异性的水解能力的上述酶，也可以生产作为医药、农药的生产原料的重要的光学活性 羧酸、氨基酸、α-羟基羧酸等。在将微生物酶作为催化剂的化学转化反应中，有必要将培养及收集的微生物菌 体稳定保存至使用之时。即，在保存时不能出现由于混入杂菌、腐败或是溶菌而使微生 物酶的催化能力失去或降低。因此，一般情况下，通过使用稳定剂、代谢阻碍剂和高浓 度盐类来抑制微生物菌体保存时微生物酶的失活、腐败和溶菌，从而应用于化学转化反 应中。在不添加上述稳定剂的情况下，已知可以通过冻结、冷藏或持续搅拌来维持酶的 活性，同时进行保存。例如，对于具有腈水合酶活性的微生物，已知有在含有高浓度的无机盐类的水 溶液中保存的方法(专利文献1)、通过冻结进行保存的方法(专利文献2)等。参考文献专利文献[专利文献1]日本专利第3163224号[专利文献2]日本特开第2003-219870号公报

发明内容
发明所要解决的课题在这些保存方法中，使用含有高浓度的无机盐类的水溶液的方法因为在后续的 工序中需要进行洗涤等，故有对产品的品质造成影响之虞，且生产方法也繁杂。此外， 通过冻结来保存的方法中，存在冻结、融解操作很繁杂等操作性上的问题，且伴随着此 操作，有酶活性失去或下降之虞。解决课题的手段本发明者们对廉价且稳定地保存培养、收集得到的微生物菌体的混悬液的条件 进行了深入的研究，结果发现通过将菌体浓缩为4 20质量％的范围的浓度，可在目前 通常情况下还基本未考虑的在室温下，且无需搅拌也不引起溶菌和酶失活地稳定保存， 从而完成本发明。即，本发明涉及微生物菌体的保存方法，其特征在于，将具有腈水合酶活性的微生物菌体，以干燥菌体质量为4 20质量％的浓度在分散介质中保存。此外，本发明 还涉及以干燥菌体质量为4 20质量％的菌体浓度含有具有腈水合酶活性的微生物菌体 的微生物菌体的混悬液。发明效果依据本发明，通过将菌体混悬液中含有的微生物菌体的浓度控制在一定范围 内，可以在室温下、即使不搅拌也不出现腐败或酶的劣化而维持腈水合酶等的酶活性的 情况下，长时间保存大量菌体。此外，依据本发明，能够提供在使用微生物菌体时无需 洗涤、可大幅削减现有的保存方法所必需的劳动力和成本、在工业上令人满意的微生物 菌体的保存方法。发明的实施方式以下，对本发明进行详细的说明。以下的实施方式，是用于说明本发明的示 例，但本发明并不仅限于此实施方式。只要不脱离其原理，可以以各式各样的形态来实 施。需要说明的是，本说明书中引用的全部文献和公开公报、专利公报以及其它的 专利文献，均作为参考包含于本说明书中。此外，本说明书包含2009年7月24日提交 的作为本申请优先权主张的基础的日本国专利申请(日本特愿2009-173162号)的说明书 中记载的内容。本发明中的具有腈水合酶活性的微生物菌体，具有生产作为目的的酶催化物并 在菌体内积蓄或分泌至菌体外的性质。此微生物中含有从自然界中分离出的微生物以及 基因重组微生物。作为这样的微生物的代表例，可举例例如具有腈水合酶活性的属于红 球菌属(Rhodococcus) >戈登菌属(Gordona)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌 属(Pseudonocardia)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)的微生物菌体。此外，还可举例引入了 这些微生物的腈水合酶基因的重组微生物菌体。其中，在工业上优选红球菌属、戈登菌 属及引入了这些微生物的腈水合酶基因的重组大肠杆菌及重组红球菌属细菌。例如，作 为红球菌属微生物的具体实例，可举例日本特公平6-55148号公报记载的紫红红球菌J-I 株(Rhodococcus rhodochrous J-1)。该株以委托编号 “FERM BP-1478” 于 1987 年 9 月 18日保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中 央第6(本说明书中下同))中。所谓腈水合酶是指具有水解腈化合物、生成对应的酰胺化合物的能力的酶。 作为编码腈水合酶的核酸及其序列的实例，可举例前述专利文献2记载的例子。这 类核酸通过通常的分子生物学方法即可导入微生物细胞内(有关这些分子学的方 法，参考如下Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning A Laboratory Manual” 2ndEdition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)。以干燥菌体计，保存时的菌体混悬液的浓度为4质量％以上，优选5质量％以 上。现已知在不足4质量％的低浓度的情况时，在室温下的活性降低。考虑其原因，认 为若在菌浓度高达一定程度的液体中的密集状态下，在菌体表面具有抑制其它菌的生长 发育的机能，或是具有某种抑制其它菌体生长发育的物质。在不足4质量％的低浓度的 情况下，不能出现这种效果，混悬液中杂菌易发生增殖，认为由于杂菌生成的氮氧化物 等而使菌体遭受损伤。且在不足4质量％的低浓度的情况下，认为由于粘度较低，因此菌体可以自由地做布朗运动，菌体之间的冲突频发，菌体自身损伤，酶活力下降。因此，通过使菌浓度在4质量％以上，室温下的保存稳定性变得良好，但若超 过20质量％，菌体混悬液的流动性降低，因此作为液体的处理变困难，不适于保存 搬 运。故，以干燥菌体计，保存时的菌体混悬液的浓度为4 20质量％、优选5 15质 量％、更优选5 10质量％。所谓“干燥菌体”是指在实质上不含有水的微生物菌体的干燥物，但某些场合 下含有菌体以外的残存混悬液成分。干燥菌体例如通过使菌体混悬液在120°C的干燥器中 干燥3小时而获得。所谓“干燥菌体浓度(干燥菌体质量(％))”是用菌体混悬液中含有的菌体干 燥质量的比率来表示的，具体而言，从菌体混悬液在120°C的干燥机中干燥3小时的干燥 前后的质量比(百分率(菌体干燥残渣比例“％”))中减去将菌体混悬液分离为微生 物菌体层和实质上不含有菌体的液层时的该液层同样地干燥时的干燥前后的质量比(百 分率上清盐浓度“％” )而求得的。本发明中的“保存”是指在储罐和容器中保管菌体混悬液。此时，为了不使储 罐和容器内的浓度不均勻，可进行搅拌和通气。在不易形成浓度分布的菌体混悬液的情 况下，不进行搅拌和通气，静置即可。在本发明中，因为不需要搅拌和通气，故优选静置。本发明中的“静置”是指不进行搅拌和通气，将菌体混悬液保存在储罐和容器 中。保存可在室温下进行。但为了抑制菌体及酶的腐败 分解，优选在分解介质不冻结 的范围内的较低温。具体而言，指冰点 35°C，优选冰点 30°C，更优选冰点 20°C， 进一步优选冰点 10°C。此处，所谓“冰点”是指菌体混悬液的固体状态和液体状态的 平衡温度，是依照混悬液的组成(分散介质的种类、浓度、菌体的浓度等)和保存容器内 的压力不同而变化的温度。因此，菌体混悬液在冰点以上的温度下保存时，维持不冻结 的状态。保存时间可以为1日以上，但本发明的效果在保存3日以上的情况下比较显著， 故可优选3日以上、更优选5日以上的长期保存。依照本发明的方法保存微生物菌体时，前述微生物菌体的腈水合酶的活性在保 存前后并无实质上的变化。所谓微生物菌体的腈水合酶的活性“在保存前后并无实质 性的变化”是指相对于保存前的腈水合酶的活性，保存后的腈水合酶的活性维持在70% 以上，优选维持在75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、 93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以 上。腈水合酶的活性可以使用本技术领域内公知的任一方法进行测定，例如，可以 通过比较保存开始前和保存后对基质(例如，丙烯腈)的丙烯酰胺生成反应速度等来测定。在本发明中，所谓混悬液的分散介质是指在作为保存对象的微生物菌体的混悬 中所使用的溶液。该分散介质优选有机酸的水溶液。该有机酸水溶液的有机酸浓度是任 意的，但过低时会导致酶活性的降低，另一方面，过高时会导致后续过程中将其除去时 的工序繁杂，故优选10 100mM。
在本发明中的分散介质的组成，只要是不阻碍酶活性的有机酸水溶液即可，并 无特别的规定。作为有机酸，可列举例如，丙烯酸、甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、草酸等 羧酸类，其中，从维持丙烯酰胺的品质这一点考虑，优选丙烯酸。在本发明的混悬液的配制中，具有腈水合酶活性的微生物菌体可以使用该技术 领域内公知的任一浓缩方法进行浓缩，但优选膜分离或离心分离来进行浓缩。使用膜分 离进行浓缩的情况下，优选使用具有0.02 0.45 μ m孔径的膜。此类膜可以为市售的， 可列举例如中空纤维膜组件(Kuraray会社，细孔径0.05 μ m，表面积39000m2)等。此 外，使用离心分离进行浓缩的情况下，优选使用分离板型连续离心分离机。以下，使用实例对本发明的实施方法进行更加详细的说明，但这些实施例的目 的是本发明的示例，而本发明并不仅限于此。在以下的实施例及比较例中的％表示的是 质量％。
实施例实施例1 (室温保存)培养在500ml的三角烧瓶中配制含有葡萄糖2%、尿素1%、蛋白胨0.5%、酵母提取 物0.3%、氯化钴0.05%的培养基(PH7.0) 100ml，通过高压釜于121°C下灭菌20分钟。 在此培养基中接种具有腈水合酶活性的紫红红球菌J-I株(Rhodococcus rhodochrous J-I FERM BP-1478)，在 30°C、230rpm 下培养 66 小时。菌体混悬液的干燥菌体质量测定将培养后的菌体混悬液约Ig采集至铝盘中并称量。并在12000rpm下将菌体缓 冲液离心分离20分钟，用滤膜(Advantec社，细孔径0.45 μ m)过滤上清10g，置于铝盘 中并称量。分别通过干燥器(Yamato科学会社生产，DN63)于120°C下干燥3小时后， 对它们进行称量。对于菌体混悬液和上清，将干燥后的质量用相对于干燥前的质量的百 分率表示，求出干燥菌体质量。保存用菌体混悬液的配制通过离心分离(1200rmp，20分钟)将培养后的微生物菌体沉淀后，使用0.1%的 丙烯酸钠水溶液(PH7.0)再混悬 再离心分离，反复操作3次后，再次使用0.1%的丙烯 酸钠水溶液(pH7.0)将沉淀菌体混悬，得到以干燥菌体质量为8.0%的菌体混悬液(实施 例1)。将此菌体混悬液的一部分用0.1%的丙烯酸钠水溶液稀释，得到干燥菌体质量为 3.4%的菌体混悬液(比较例1)。腈水合酶活性的测定、腈水合酶的活性如下得到使用通过上述方法刚刚配制的菌体混悬液(第0日) 和同样地配制的菌体混悬液在室温(15 20°C )下静置、保存5日而得到的混悬液(5日 后)，通过这些混悬液内含有的菌体引起的丙烯酰胺生成反应速度来计算。将作为基质的 丙烯腈的水溶液添加至菌体混悬液中即可启动反应，10°C下震荡10分钟后，通过菌体的 过滤分离和磷酸的添加而终止反应，用气相色谱仪(GC-14B，岛津制作所)进行分析。 分析条件为使用填充了 Porapack PS (Waters会社)的Im玻璃柱，柱温为210°C，检测器 用 230 °C 的 FID0
本发明中的腈水合酶的酶活性用1分钟内Img菌体产生的丙烯酰胺的量(ymol)来测定，以下以O日的反应速度为100%的相对反应速度比在表1中显示。[表1]
权利要求
1.微生物菌体的保存方法，其特征在于，将具有腈水合酶活性的微生物菌体以干燥 菌体质量为4 20质量％的浓度保存在分散介质中。
2.权利要求1的方法，其中，前述保存方式是在35°C以下且不冻结的状态下静置保存。
3.权利要求1或2的方法，其中，前述分散介质为有机酸水溶液。
4.权利要求3的方法，其中，前述有机酸为丙烯酸。
5.权利要求1 4中任一项的方法，其特征在于，前述微生物菌体的腈水合酶活性在 保存前后并无实质性变化。
6.权利要求1 5中任一项的方法，其中，具有腈水合酶活性的微生物为属于红球菌 属(Rhodococcus)的微生物。
7.权利要求6的方法，其中，具有腈水合酶活性的微生物为紫红红球菌J-I株 (Rhodococcus rhodochrous J-1)(委托编号FERM BP-1478)或紫红红球菌 M8 株(委托 编号VKPM S-926)。
8.微生物菌体的混悬液，其以干燥菌体质量为4 20质量％的菌体浓度含有具有腈 水合酶活性的微生物菌体。
全文摘要
本发明提供提供代替现有技术的廉价且简便的微生物菌体保存用混悬液及保存方法。本发明涉及微生物菌体的保存方法，其特征在于，将具有腈水合酶活性的微生物菌体以干燥菌体质量为4～20质量％的浓度保存在分散介质中。
文档编号C12N1/00GK102010826SQ20101024730
公开日2011年4月13日 申请日期2010年7月26日 优先权日2009年7月24日
发明者竹内雅人 申请人:大野绿水株式会社