专利名称：一种诱导玉米小孢子形成胚状体的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，属于遗传育种领域。
背景技术：
玉米是我国主要粮食作物之一，由于是异花授粉作物，通过常规育种选育一个自 交系需要5 6年的时间，耗费了大量的人力和物力，有时还不能保证其纯合性。单倍体育 种不仅能缩短育种年限，而且能提高纯度，具有极大的应用价值。通过花药培养获得纯合双 单倍体植株已广泛应用于作物的品种改良，在花药培养基础上发展起来的小孢子培养技术 正引起许多研究者的极大兴趣。小孢子是高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要的阶段，包括四分体 解离后至第一次核有丝分裂时期的细胞。小孢子培养是指把小孢子从花药中分离出来，通 过人工培养，改变其形成花粉管和精子的发育途径，诱导形成单倍体植株。它的理论依据是 植物细胞的全能性和体细胞有丝分裂的均等性。小孢子具有单倍体和单细胞两个特性，分 化再生力较强，是研究胚胎发生机理较为理想的工具，是进行离体诱变育种，单倍体原生质 体培养和细胞杂交的良好材料，更是遗传转化的理想受体。小孢子培养在具有花药培养优 点的同时，有更多的优越性首先，可以消除花丝、药壁等二倍体组织的干扰，获得的植株 完全由单倍体单细胞发育而来，避免了嵌合体的发生；其次游离小孢子具有天然的分散性， 数量大，发育整齐，容易获得。小孢子培养技术在作物的遗传育种、遗传转化以及细胞分化发育研究中发挥着重 要作用，小孢子培养的研究工作主要在十字花科芸薹属作物上得以成功地应用和发展。禾 本科作物小孢子的培养技术开展的比较晚，而且还不是很成熟，曾有报道关于玉米小孢子 的培养(Isolatedmicrosporecultureofmaize effectsofisolationtechnique, reducedte mperature, andsucroselevel. PlantCellR印，1990，8:628-631 )，但是需要用到专门的仪器 (WaringMC-2)，操作步骤复杂，还增加了污染的机会，不利于该技术的推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效简便地诱导玉米小孢子形成胚状 体的方法。本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案是 一种诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，依次包括如下步骤
1)在玉米长到大喇叭口时期(大约50天左右)，选取生长健壮，处于单核晚期的雄穗，用 保鲜膜包裹，于5 8°C冷处理7 14天；
2)将雄穗上的小穗剥下进行表面消毒后，转移到离心管中，加入预冷至3 5°C的提取 液，挤压小穗获得小孢子悬浮液，经100目不锈钢筛过滤，滤液离心处理后，倒掉上清液，然 后加诱导培养基，所获得的小孢子经镜检计数后，以10，000 20，000个/毫升的密度接种到培养器皿内，用封口膜封口 ；
3)将培养器皿放到32 36°C的烘箱热激处理24 48h，再置于25 28°C的培养室， 在摇床上进行暗培养20 25天，形成胚状体。上述方案中，步骤1中所述处于单核晚期的雄穗，其花药长3. 9 4. 3mm，颜色为黄 绿色。具有附加技术特征的进一步的技术方案是
上述方案中，步骤1中所述表面消毒过程具体为先浸入75%酒精(体积比)消毒30s，再 用0. l%Hgcl2溶液(质量体积比)消毒lOmin，然后无菌水清洗3次。上述方案中，步骤2中所述的提取液为150mg/l (NH4) 2S04+30 00mg/lKN03+150mg/ lCaCl2 2H20+450mg/lMgS04 7H20+600mg/lKH2P04+60g/l 蔗糖 +2. 5g/13_(N_ 吗啡啉)丙磺 酸，加KOH调节PH为6. 0。上述方案中，步骤2中的离心处理过程具体为在100g下离心3min，重复3次。上述方案中，步骤2中所述的诱导培养基为“正14”培养基+120g/l蔗糖+0. lmg/ 12，3，5-三碘苯甲酸+500mg/l酪蛋白水解物+200mg/l活性碳+16mg/l琼脂糖，加K0H调节 PH 为 6. 0。上面所述的“正14”培养基成分如下(mg/1)
大量元素:(NH4)2S04150、KN033000、CaCl2 2H20150、MgS04 7H20450、KH2P04600 ； 微量元素KIO. 75、H3B033、MnS04 H2010、ZnS04 7H202、Na2Mo04 2H200. 25、 GuS04 5H200. 025、Cocl2 6H200. 025、Na2EDTA37. 3、FeS04 7H2027. 8 ；
有机成分甘氨酸2、盐酸硫胺素10、盐酸吡哆素1、烟酸1、肌醇100、2，4_ 二氯苯氧乙 酸2、6_苄氨基嘌呤1、萘乙酸1。本发明诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，具有成胚率高、培养周期短、操作简单 等优点，为玉米小孢子离体培养提供技术依据。本发明若用于玉米遗传育种中将大大加快 育种进程，显著地提高选择效果，而且该游离小孢子培养胚状体诱导体系是研究玉米细胞 分化发育、遗传转化、物种进化的良好实验体系。
具体实施例方式本发明提供了一种诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，依次包括如下步骤
1)在玉米长到大喇叭口时期(大约50天左右)，选取生长健壮，处于单核晚期的雄穗，用 保鲜膜包裹，于5 8°C冷处理7 14天；
2)将雄穗上的小穗剥下进行表面消毒后，转移到离心管中，加入预冷至3 5°C的提取 液，挤压小穗获得小孢子悬浮液，经100目不锈钢筛过滤，滤液离心处理后，倒掉上清液，然 后加诱导培养基，所获得的小孢子经镜检计数后，以10，000 20，000个/毫升的密度接种 到培养器皿内，用封口膜封口 ；
3)将培养器皿放到32 36°C的烘箱热激处理24 48h，再置于25 28°C的培养室， 在摇床上进行暗培养20 25天，形成胚状体。下面通过具体实施例来详细介绍本发明。实施例1
1) 玉米在田间长到大喇叭口时期(大约50天左右)，选取生长健壮，处于单核晚期的
4雄穗，将雄穗用保鲜膜包裹，于5°C冷处理7天；
2) 将雄穗上的小穗剥下，浸入75%酒精(体积比)消毒30s，再用0. l%Hgcl2溶 液(质量体积比)消毒lOmin，无菌水清洗3次后，转移到离心管中，加4°C左右预冷的提 取液。提取液的成份为 l50mg/l (NH4) 2S04+30 00mg/lKN03+150mg/lCaCl2 2H20+450mg/ lMgS04 7H20+600mg/lKH2P04+60g/l 蔗糖 +2. 5g/13_ (N-吗啡啉)丙磺酸，加 KOH 调节 PH 为 6.0。用玻璃棒挤压小穗获得小孢子悬浮液，经100目不锈钢筛过滤，100g离心3min，倒掉 上清液后再加提取液清洗，离心重复3次。然后加诱导培养基(“正14”培养基+120g/l蔗 糖+0. lmg/12, 3，5-三碘苯甲酸+500mg/l酪蛋白水解物+200mg/l活性碳+16mg/l琼脂糖， 加K0H调节PH为6. 0)，所获得的小孢子经镜检计数后，以10，000个/毫升的密度接种到直 径35mm的培养皿内(每皿约2ml )，用封口膜封口。3) 将培养皿放到32°C的烘箱热激处理24h，再置于25°C的培养室，于40rpm/ min的摇床上暗培养，并定期取样观察，培养20 25天形成胚状体。“正14”培养基成分如下(mg/1)
大量元素:(NH4)2S04150、KN033000、CaCl2 2H20150、MgS04 7H20450、KH2P04600 ； 微量元素KIO. 75、H3B033、MnS04 H2010、ZnS04 7H202、Na2Mo04 2H200. 25、 GuS04 5H200. 025、Cocl2 6H200. 025、Na2EDTA37. 3、FeS04 7H2027. 8 ；
有机成分甘氨酸2、盐酸硫胺素10、盐酸吡哆素1、烟酸1、肌醇100、2，4_ 二氯苯氧乙 酸2、6_苄氨基嘌呤1、萘乙酸1。实验设计3次重复，每次接种20个培养皿，共使用了约2000个花药，统计结果表 明，三次重复共获得了 871个胚，平均诱导频率为43. 55% (诱导频率=胚状体数/总花药 数)。实施例2
1)玉米在田间长到大喇叭口时期(大约50天左右)，选取生长健壮，处于单核晚期的 雄穗，将雄穗用保鲜膜包裹，于8°C冷处理14天；
2)将雄穗上的小穗剥下进行表面消毒(先浸入75%酒精(体积比)消毒30s，再用 0. l%Hgcl2溶液(质量体积比)消毒lOmin)，无菌水清洗3次后，转移到离心管中，加4°C左 右预冷的提取液。提取液为 l50mg/l (NH4)2S04+30 00mg/lKN03+150mg/lCaCl2 2H20+450mg/ lMgS04 7H20+600mg/lKH2P04+60g/l 蔗糖 +2. 5g/13_ (N-吗啡啉)丙磺酸，加 K0H 调节 PH 为 6.0。用玻璃棒挤压小穗获得小孢子悬浮液，经100目不锈钢筛过滤，100g离心3min，倒掉 上清液后再加提取液清洗，离心重复3次。然后加诱导培养基(“正14”培养基+120g/l蔗 糖+0. lmg/12, 3，5-三碘苯甲酸+500mg/l酪蛋白水解物+200mg/l活性碳+16mg/l琼脂糖， 加K0H调节PH为6. 0)，所获得的小孢子经镜检计数后，以20，000个/毫升的密度接种到直 径35mm的培养皿内(每皿约2ml)，用封口膜封口 ；
3)将培养皿放到36°C的烘箱热激处理48h，再置于28°C的培养室，于40rpm/min的 摇床上暗培养，并定期取样观察，培养20 25天形成胚状体。“正14”培养基成分同实施例1。实验设计3次重复，每次接种20个培养皿，共使用了约2000个花药，统计结果表 明，三次重复共获得了 836个胚，平均诱导频率为41. 80% (诱导频率=胚状体数/总花药 数)。
权利要求
一种诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，其特征在于依次包括以下步骤1) 玉米长到大喇叭口时期，选取生长健壮，处于单核晚期的雄穗，用保鲜膜包裹，于5～8℃冷处理7～14天；2) 将雄穗上的小穗剥下进行表面消毒后，转移到离心管中，加入预冷至3～5℃的提取液，挤压小穗获得小孢子悬浮液，经100目不锈钢筛过滤，滤液离心处理后，倒掉上清液，然后加诱导培养基，所获得的小孢子经镜检计数后，以10，000 ～20,000个/毫升的密度接种到培养器皿内，用封口膜封口；3) 将培养器皿放到32～36℃的烘箱热激处理24～48h，再置于25～28℃的培养室，在摇床上进行暗培养20～25天，形成胚状体。
2.如权利要求1所述的诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，其特征在于步骤1中所 述表面消毒过程具体为先浸入75%酒精(体积比)消毒30s，再用0. l%Hgcl2溶液(质量体积 比)消毒lOmin，然后无菌水清洗3次。
3.如权利要求1或2所述的诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，其特征在于步骤2 中所述的提取液成分如下l50mg/l (NH4)2S04+30 00mg/lKN03+150mg/lCaCl2 2H20+450mg/ lMgS04 7H20+600mg/lKH2P04+60g/l 蔗糖 +2. 5g/13_ (N-吗啡啉)丙磺酸，加 KOH 调节 PH 为 6. 0。
4.如权利要求1或2所述的诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，其特征在于步骤2中 的离心处理过程具体为在100g下离心3min，重复3次。
5.如权利要求1或2所述的诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，其特征在于步骤2中 所述的诱导培养基为“正14”培养基+120g/l蔗糖+0. lmg/12, 3，5-三碘苯甲酸+500mg/l 酪蛋白水解物+200mg/l活性碳+16mg/l琼脂糖，加K0H调节PH为6. 0。
6.如权利要求5所述的诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，其特征在于所述的“正 14”培养基成分如下(mg/l):大量元素(NH4) 2S04150、KN0330 00、CaCl2 2H20150、MgS04 7H20450、KH2P04600 ；微量 元素:KI0. 75、H3B033、MnS04 H2010、ZnS04 7H202、Na2Mo04 2H200. 25、GuS04 5H200. 025、 Cocl2 6H200. 025、Na2EDTA37. 3、FeS04 7H2027. 8 ；有机成分甘氨酸 2、盐酸硫胺素 10、盐 酸吡哆素1、烟酸1、肌醇100、2，4_ 二氯苯氧乙酸2、6_苄氨基嘌呤1、萘乙酸1。
全文摘要
本发明涉及一种诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，属于植物育种领域。主要步骤是选取合适的雄穗进行消毒，然后在提取液中挤压小穗、过筛、离心收集小孢子，再接种到诱导培养基中，置于32～36℃的烘箱热激处理24～48h，再置于25～28℃的培养室，在摇床上进行暗培养20～25天，形成胚状体。本发明诱导玉米小孢子形成胚状体的方法，具有成胚率高、培养周期短、操作简单等优点。本发明用于玉米遗传育种,将大大加快育种进程，显著地提高选择效果。
文档编号C12N5/04GK101874473SQ201010248490
公开日2010年11月3日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者何世斌, 张琦, 李慧, 李立家, 谭珺隽 申请人:武汉大学