专利名称：一种精子细胞膜完整性及活力检测方法
技术领域：
本发明涉及医学临床上使用的检测方法，确切地说是一种精子细胞膜完整性及活 力检测方法。
背景技术：
精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关，测定精子膜 功能可以准确地反映精子功能并预测精子潜在受精能力。自1984年建立精子尾部低渗肿 胀试验(HOS)测定人精子膜功能以来，HOS已成为目前不多的几个评价精子膜功能的检测 方法之一，越来越广泛地运用于男性生殖避孕的基础研究和不育的临床诊治中。细胞的物 质交换和新陈代谢活动依靠细胞膜进行，精子在男、女性生殖道中极易受到各种化学物质 影响，精子膜对这些物质的传递能力直接影响精子的活力和新陈代谢，从而关系到能否获 能，完成受精的全过程。因此，评价精子膜功能在精子功能检测中具有重要意义。但是，现 有的精子尾部低渗肿胀试验仅可显示精子尾膜是否完整，而无法显示精子头膜是否具有完 整性，使得人们无法全面地评价精子膜功能，从而也难以准确地检测精子活力。而目前可显 示精子头膜完整性的试验方法，由于试验本身存在精子头膜显示不清楚，精子核和顶体不 易区分的问题，因此，难以有效地起到鉴别精子头膜是否完整，以及精子头膜破坏的具体部 位的作用。
发明内容
本发明的目的，是提供了一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，它可解决现上 述技术存在的问题，既可确定一个精子的尾部是否完整，又可清楚地鉴别其头部膜是否被 破坏。并且，在伊红染液中加入吉姆萨染料对精子染色，可使精子染色程度加重，精子膜显 示更加清晰，精子核染色加深，顶体易于区分，从而，更易于鉴别精子膜完整性破坏的部位。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种精子细胞膜完整性及活力检测方 法，其步聚如下
+ 制备低渗液
低渗液为每IOOml蒸馏水中含0. 735g柠檬酸钠和1. 35g果糖，渗透压是150m0sm的溶
液；
制备伊红-吉姆萨染液
向每IOOml的0. 9%的生理盐水中加入0. 5g伊红和0. Ig吉姆萨混勻，使其充分溶解， 配置成染液，再用双层滤纸将所述染液过滤，所得滤液即伊红_吉姆萨染液，伊红_吉姆萨 染液置于22°C室温内保存备用；
3)将0. Iml精液加入Iml步骤①中所述的低渗液中，混勻；①将盛有步骤 中所述的低渗液和精液的混合溶液的容器置于水温37°C的水中水浴 30分钟；
⑤向步骤③所述的混合溶液中加入0. Iml步骤 中所述的伊红-吉姆萨染液，混勻制
成精液-HOS-EG混合液；
静置2分钟后取50 μ 1步骤③中所述的精液-HOS-EG混合液置于清洁载玻片上，加
盖22mmX 22mm盖玻片，湿片封片，在显微镜下观察每条精子头部着色和尾部肿胀情况，随 机计数200条精子，计算4种类型精子的百分率。为进一步实现本发明的目的，还可以采用以下技术方案实现步骤 中所述的蒸
馏水是双蒸水。步骤 中所述显微镜是光学显微镜，其参数是品牌01ympUS，型号IX51，
产地Japan，最大放大倍数400倍。步骤 中所述显微镜是高级数码生物显微镜，其参数 是品牌=Leica,型号DM4000B，产地Germany，最大放大倍数1000倍。所述吉姆萨是由 天青和伊红按1 :1重量配制而成。步骤！)中所述的低渗液的离子强度为0. 15。本发明的有益效果在于它将精子低渗肿胀实验和精子伊红_吉姆萨染色实验有 机地结合起来，在伊红染液中加入吉姆萨染料，改进了伊红染液的成分，从而可使实验更易 观察，结果是在普通光学显微镜下分析，共测定42例正常生育男性得出与单独应用精子低 渗肿胀实验不同的结论，即精子在低渗溶液里进行肿胀实验后，接着进行伊红-吉姆萨染 色实验，得到的精子形态变化共有4种类型(A-D)，其中A型精子是头膜尾膜均完整的精子， 精子是具有活动能力或是活的，B型精子是头未染色而尾部未肿胀的精子，我们观察到这种 精子是有活动能力的精子；如果单纯用精子低渗肿胀实验判断，结果这种B型精子就是死 的或没有活动能力的精子；而C型精子是尾部肿胀而头部染色的精子，这种精子在单纯HOS 实验里就判断为活动的精子，因为精子尾膜是完整的，即肿胀，但实际上其头膜已损伤是死 精子。我们的实验结果证实了单纯精子低渗肿胀(HOS)实验对于判断精子活动能力和膜 的完整性是不完全的，对于A型精子和D型精子，单纯低渗肿胀实验和低渗肿胀实验/伊 红_吉姆萨染色结合实验判断结果是一致的，即A型精子是活动的和头膜_尾膜完整的精 子，D型精子是头膜-尾膜均损伤的精子，是死亡的精子，但对B型精子，单纯HOS实验只能 判断其为死精子，实际上这种精子是活精子，而对C型精子的判断，单纯HOS实验则判断为 活精子，实际上这种精子是死精子，应用HOS与伊红_吉姆萨(EG)结合实验，就能对这些精 子做出正确判断。
42例ιΗ常牛育男件单纯H0S、单纯伊红染饩、单纯伊红-吉姆萨染饩及HOS/伊红-吉 姆萨剂和ti^精子形杰学夺化(+χ)_
HOS/伊红吉姆萨-69. 3 士 8. 8. 1 士 1. 5 10. 1 士 1.7 12. 5 士 4. Ijg_
注* P<0.01，** P<0. 001，与单纯HOS实验精子尾部肿胀的比较及单纯伊红染色及 单纯伊红_吉姆萨染色精子头部着色比较；(H0S+)=低渗肿胀实验精子尾部肿胀(阳性)， (H0S-)=低渗肿胀实验精子尾部未肿胀(阴性)。图1是在400X高倍镜下观察到的精子单纯精子低渗肿胀实验，即HOS实验的图 像，仅可分辨精子尾部是否肿胀的精子；图2是在400 X高倍镜下观察到的单纯伊红Y染 色实验，精子头部着红色的图像；图3是精子低渗肿胀/伊红-吉姆萨结合实验的图像，即 H0S/EG结合实验的图像，图中三个精子均是A型精子，即精子头膜和尾膜都未损伤的精子， 标注为(H0S+)-(EG_)；图4是在明视野1000X油镜下观察到的A型精子进行H0S/EG结 合实验后的图像；图5是在明视野1000X油镜下观察到的B型精子，即尾膜损伤而头膜 完整的精子，标注为(HOS-)-(EG-)，进行H0S/EG结合实验后的图像；图6是在明视野 1000X油镜下观察到的C型精子，即精子头膜损伤的精子，标注为(HOS+)--(EG+)，进行 H0S/EG结合实验后的图像；图7是在明视野1000X油镜下观察到的D型精子，即精子头 膜尾膜均损伤的精子，标注为0105-) —伍6+)，进行!105序6结合实验后的图像。
具体实施例方式本发明所述的一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于其步聚如 下
Φ制备低渗液
低渗液为每IOOml蒸馏水中含0. 735g柠檬酸钠和1. 35g果糖，离子强度为0. 15，渗透 压150m0sm的溶液；
S)制备伊红-吉姆萨染液
向每IOOml的0. 9%的生理盐水中加入0. 5g伊红和0. Ig吉姆萨混勻，使其充分溶解， 配置成染液，再用双层滤纸将所述染液过滤，所得滤液即伊红_吉姆萨染液，伊红_吉姆萨 染液置于22°C室温内保存备用；所述伊红可以是美国希格玛(Sigma)公司生产的型号为 E6003,伊红粉剂，所述吉姆萨可以是美国希格玛(Sigma)公司生产的型号为G4507的吉姆 萨粉剂；
将0. Iml精液加入Iml步骤①中所述的低渗液中，混勻；
①将盛有步骤 中所述的低渗液和精液的混合溶液的容器置于水温37°C的水中水浴 30分钟；
⑤向步骤③所述的混合溶液中加入0. Iml步骤 中所述的伊红-吉姆萨染液，混勻制
成精液-HOS-EG混合液；
静置2分钟后取50 μ 1步骤③中所述的精液-HOS-EG混合液置于清洁载玻片上，加
盖22mmX 22mm盖玻片，湿片封片，在显微镜下观察每条精子头部着色和尾部肿胀情况，随 机计数200条精子，计算4种类型精子的百分率。四种精子类型的判断标准
A型尾肿胀(H0S+)-头未染红色(EG-)，判断为尾膜一头膜均完整的精子。B型尾不肿胀(H0S-)--头未染红色(EG-)，判断为尾膜损伤--头膜完整的精子。C型尾肿胀(H0S+)-头红染(EG+)，判断为尾膜完整一头膜损伤的精子。D型尾不肿胀(H0S-)--头红染(EG+)，判断为尾膜一头膜均损伤的精子。步骤①中所述的蒸馏水是双蒸水。步骤》 中所述显微镜是光学显微镜，其参数是品牌01ympUS，型号IX51，产地 Japan，最大放大倍数400倍。步骤 中所述显微镜是高级数码生物显微镜，其参数是品牌Leica，型号 DM4000B,产地Germany,最大放大倍数1000倍。所述吉姆萨是由天青和伊红按1 :1重量配制而成，S卩，原来单纯伊红染色剂中加 入吉姆萨染料，可使精子头部着色更深。步骤①中所述的低渗液的离子强度为0. 15，显微镜下可以同时观察一条精子头膜 和尾膜是否完整。本发明未详尽描述的技术内容均为公知技术。
权利要求
一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于其步聚如下①制备低渗液低渗液为每100ml蒸馏水中含0.735g柠檬酸钠和1.35g果糖，渗透压是150mOsm的溶液；②制备伊红 吉姆萨染液向每100ml的0.9%的生理盐水中加入0.5g伊红和0.1g吉姆萨混匀，使其充分溶解，配置成染液，再用双层滤纸将所述染液过滤，所得滤液即伊红 吉姆萨染液，伊红 吉姆萨染液置于22℃室温内保存备用；③将0.1ml精液加入1ml步骤①中所述的低渗液中，混匀；④将盛有步骤③中所述的低渗液和精液的混合溶液的容器置于水温37℃的水中水浴30分钟；⑤向步骤④所述的混合溶液中加入0.1ml步骤②中所述的伊红 吉姆萨染液，混匀制成精液 HOS EG混合液；⑥静置2分钟后取50μl步骤⑤中所述的精液 HOS EG混合液置于清洁载玻片上，加盖22mm×22mm盖玻片，湿片封片，在显微镜下观察每条精子头部着色和尾部肿胀情况，随机计数200条精子，计算4种类型精子的百分率。
2.根据权利要求1所述的一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于步骤 ①中所述的蒸馏水是双蒸水。
3.根据权利要求1所述的一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于步骤 ⑥中所述显微镜是光学显微镜，其参数是品牌01ympUS，型号IX51，产地Japan，最大放 大倍数400倍。
4.根据权利要求1所述的一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于步 骤⑥中所述显微镜是高级数码生物显微镜，其参数是品牌Leica，型号DM4000B，产地 Germany,最大放大倍数1000倍。
5.根据权利要求1所述的一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于所述 吉姆萨是由天青和伊红按1:1重量配制而成。
6.根据权利要求1所述的一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其特征在于步骤 ①中所述的低渗液的离子强度为0. 15。
全文摘要
本发明公开了一种精子细胞膜完整性及活力检测方法，其步聚如下①制备低渗液；②制备伊红-吉姆萨染液；③将精液加入步骤①中所述的低渗液中，混匀；④将盛有步骤③中所述的低渗液和精液的混合溶液的容器水浴30分钟；⑤向步骤④所述的混合溶液中加入0.1ml步骤②中所述的伊红-吉姆萨染液，混匀制成精液-HOS-EG混合液；⑥静置2分钟后取50μl步骤⑤中所述的精液-HOS-EG混合液置于清洁载玻片上，加盖22mm×22mm盖玻片，湿片封片，在显微镜下观察每条精子头部着色和尾部肿胀情况。它可解决现上述技术存在的问题，既可确定一个精子的尾部是否完整，又可清楚地鉴别其头部膜是否被破坏。
文档编号C12Q1/02GK101906460SQ20101024976
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者王磊光, 邱毅 申请人:山东省计划生育科学技术研究所