专利名称：一种富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖饲料添加剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖饲料添加剂的制备方法，属于应用 微生物饲料添加剂技术领域。
背景技术：
现今动物生产的经营方式已经从供给消费者所能生产的动物产品转移到生产消 费者想要的动物产品上来，越来越多的消费者希望不使用促生长抗生素的产品。主要是担 心使用抗生素来提高动物产品的产量和饲料利用效率最终会导致人产生对抗生素的耐药 性。为了保证消费者的要求，政府正在通过立法严格限制或完全禁止使用促生长抗生素。欧 盟经过激烈的辩论，关于在动物饲料中添加四种抗生素的禁令已经生效。美国的食品和药 物管理署正考虑在食用动物的生产中限制使用饲料级抗生素。如何寻找抗生素的替代品已 是各国动物营养学家最为关注的问题。其中具有作为抗生素替代品潜力的天然饲料添加剂 葡甘露低聚糖已逐渐被各国动物营养学家关注。大量研究表明，葡甘露低聚糖提供的富含 甘露糖的吸附源能结合细菌，避免它们吸附在肠壁上，能与被吸附的病原菌一起通过肠道， 防止它们在肠道内集结；葡甘露低聚糖具有免疫原性，刺激机体免疫应答，发挥免疫调节作 用，减缓抗原的吸收，增加抗原的效价，从而增强动物体的细胞和体液免疫反应；葡甘露低 聚糖能调控动物的胃肠道微生态环境，促进有益菌的生长和繁殖，抑制有害物质在肠道的 粘附和定植，维持正常的肠道群。葡甘露低聚糖在提高动物的生产性能的同时，作为一种天 然的饲料添加剂，不会带来污染、耐药性和残留等问题，作为抗生素饲料添加剂的替代品， 将有广阔的应用前景。酿酒酵母用作饲料补充料可促进反刍动物生长，随着畜牧业的日益 发展，酵母菌被开发成多种形式的产品，目前饲料酵母作为良好的蛋白原料被应用于各种 动物。葡甘露聚糖是魔芋块茎的主要成分，目前，虽然研究者对如何从魔芋精粉中酶法 提取甘露寡糖的制备方法进行了研究，但由于酶解需要的β -甘露聚糖酶活力较低，生产 成本高，不能大规模的用作饲料添加剂，而且生产的葡甘露寡糖需要经过后续精制，工艺繁 琐，没有充分利用酶解过后所产生的葡萄糖和甘露糖，同时生产甘露寡糖和酿酒酵母，将其 应用于饲料添加剂领域。
发明内容
本发明目的是，利用魔芋精粉这种富含葡甘露聚糖的廉价原料，应用微生物酶工 程技术，酶法生产甘露寡糖，然后利用酿酒酵母对葡甘露低聚糖生产过程中产生的葡萄糖 和甘露糖进行发酵，最后将发酵液冷冻干燥，得到即含葡甘露低聚糖又含酿酒酵母的新型 的饲料添加剂，应用于畜禽养殖业，替代抗生素，具有优良效果。本发明的方法通过对现有 过程中的一些方法和实验参数加以改进，可以不需要购买额外昂贵的化学试剂就可以进行 大规模的工厂化生产，节约了成本，提高了生产效率；同时化学添加试剂的减少增强了饲料 的环保作用，降低这些化学试剂对动物可能存在潜在的不利影响，本发明几乎用纯生物制作工艺完成，几乎不会对动物体产生不利的影响。本发明目的通过以下技术方案得以实现。一方面，本发明提供一种动物饲料添加剂，它包括质量含量大于20%以上的葡 甘露低聚糖；5X105cfu/g以上的酿酒酵母。另一方面，本发明提供一种生产富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖饲料添加剂的制备 方法，该方法包括以下步骤(a)、黑曲霉MA-56酸性β -甘露聚糖酶粗酶液的制备称取固体酶样1份，加入 16-20份蒸馏水，40-50°C水浴抽提1-池，过滤，得到酸性β -甘露聚糖酶粗酶液，适当稀释， 使酶活力达100IU/mL。其中酸性β-甘露聚糖酶固体酶的制备可采用已有技术，如2009年 7月15日公开的CN101481674A说明书第5页。该专利作为全部应用作为本发明的一部分。 黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56，本申请人于2008年10月M日保藏于北京市朝 阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No. 2722。(b)、魔芋精粉酶解液的获得，它包括以下步骤(1)、pH3. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制称取磷酸氢二钠21. 74g，柠檬酸 14. 63g，加入800mL蒸馏水加热溶解，最后用容量瓶定容至1000mL。(2)、魔芋精粉水溶液的配制将步骤(1)的缓冲液加热到50-60°C，加入魔芋精粉 (过40-140目筛)配制100-180g/L的魔芋精粉溶液，期间用高速搅拌机100-120r/min不 断搅拌，避免魔芋精粉结成包块。(3)、葡甘露低聚糖酶解样品的制备将β -甘露聚糖酶粗酶液加入步骤O)的魔 芋精粉溶液，加酶量为30-40IU/g魔芋精粉，酶解水浴温度为50-65°C，酶解时间为4_6h。获 得魔芋精粉酶解液。酶解过后，酶解液的糖中既含有20-25%的葡萄糖和甘露糖单糖，也含 有75-80%葡甘露低聚糖。(c)、酿酒酵母发酵液的获得。酿酒酵母于2010年7月购自中国工业微生物菌种 保藏管理中心，保藏编号CICC31015。它包括以下各级培养基的配制①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH，经 0. IMpa 灭菌 20min ；②酿酒酵母斜面种子制备将酿酒酵母划线接种在步骤(4)①斜面种子培养基 上，于下恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用；(d)、发酵培养。包括以下步骤；①酵母菌发酵培养基的制备将步骤(b)中获得的魔芋粉酶解液不添加任何其他 营养成分，自然pH，经0. IMpa灭菌20min。②酵母菌发酵生产将步骤②中斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为IXlO7-IO8 个/ml的细胞悬浮液，按2-5% (ν/ν)接种比例接入③中的菌种发酵培养基中，置摇床 200r/min，培养时间 16h。(e)、冷冻干燥制成成品将步骤(d)得到的发酵液装入浅盘中，用保鲜膜封口， 置_70°C冰箱预冷2h，于托盘式冷冻干燥机中冷冻干燥48h。最后，把富含酿酒酵母的葡甘 露低聚糖样品经高压液相色谱检测和菌落计数，将葡甘露低聚糖含量达到20%以上，酿酒 酵母5X105cfu/g以上的样品包装、封口即成本发明产品。
在一个优选的方式中，还可以在步骤(d)后对发酵液进行薄层层析检测以葡萄 糖做为标准品，将魔芋精粉酶解液经酿酒酵母发酵前后的样品进行薄层层析，结果发现未 经过发酵的样品中的葡萄糖和甘露糖等单糖经酿酒酵母发酵后几乎已被酵母菌利用完全， 发酵后的样品中糖类为100%的葡甘露低聚糖。本发明的有益效果是(1)集酶工程技术和发酵工程技术于一体，发明产品具有活菌制剂和双岐因子的 双重功能。葡甘露低聚糖含量20-25%，酿酒酵母菌含量5-6X105cfu/g。(2)酿酒酵母的发酵，直接利用魔芋粉酶解液，即充分利用了酶解过程产生的单 糖，又提高了葡甘露低聚糖的含量，还可以使产品中富含酿酒酵母活菌。(3)另外，整个生产过程无需添加其他价格昂贵的试剂，使生产成本较低；特别适 合大规模生产。在本发明的方法中，特别在制备酵母菌发酵培养基的步骤中，不需要添加其 它价格昂贵的辅助化学成分就可以获得纯度较高的制备葡甘露低聚糖，同时除去产品中的 单糖。(4)同时，冷冻干燥出来的产品可作为饲料添加剂直接添加使用，无需增加后提取 工艺，更进一步降低了生产成本。
图1为葡萄糖作为标准品，将葡甘露低聚糖酶解液经酿酒酵母发酵前后的样品进行薄 层层析图，其中ι为葡萄糖样品；2为发酵前样品；3为发酵后样品。
具体实施例方式通过以下具体实施例，对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限止。实施例1 β -甘露聚糖酶粗酶液的生产制备本例β -甘露聚糖酶按以下步骤制备(1)黑曲霉菌株 MA_56 (黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 MA-56，于 2008 年 10 月24日保藏于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 2722)各级培养基的配制包括，①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经 0. IMpa 灭菌 20min ；②固体种子培养基300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份 80 19 1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1 1比例加入自来水，搅拌均 勻，经 0. IMpa 灭菌 30min ；③固体生产培养基先将麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份75 23 3比例配制成 固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1 1.3比例加水并搅拌均勻装入布袋中，经 0. IMpa灭菌30min，冷却后均勻置于曲盘中，发酵物料厚度为2-3cm ；(2)斜面种子制备将黑曲霉菌株MA-56划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基 上，于观°C下恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用；(3)固体种子制备将步骤( 斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为IXlO7-IO8 个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基中，于下恒温培养3d，再与无菌蒸馏水按重量1 100比例搅拌混合后，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到 浓度为IX IO7-IO8个/ml固体种子孢子悬浮液，待用；(4)发酵生产将步骤(3)固体种子孢子悬浮液与步骤(1)③固体生产培养基按 重量份20 100比例混合均勻后，置曲房中发酵培养5 得饲用β-甘露聚糖酶酶 曲；(5)酶曲的后处理与质量检测将步骤(4)酶曲置40°C鼓风条件下烘干10h、粉 碎、过80目筛，得酶干曲；将经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到IX IO5-L 3 X 105U/g的酶 干曲包装、封口即成产品。(6)称取步骤(5)中的固体酶样1份，加入18份蒸馏水，45°C水浴抽提池，板框过滤，得到酸性β-甘露聚糖酶粗酶液，适当稀释，使酶活力达100IU/mLo实施例2 富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖的生产制备1本例富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖按以下步骤制备(1)ρΗ3. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制称取磷酸氢二钠21. 74g，柠檬酸 14. 63g，加入800mL蒸馏水加热溶解，最后用容量瓶定容至1000mL。(2)魔芋精粉水溶液的配制将步骤(1)的缓冲液加热到50°C，加入魔芋精粉配制 100g/L的魔芋精粉溶液，期间用高速搅拌机lOOr/min不断搅拌，避免魔芋精粉结成包块。(3)葡甘露低聚糖酶解样品的制备将β -甘露聚糖酶粗酶液(实施例1中的步 骤6获得的)加入步骤O)的魔芋精粉溶液，加酶量为30IU/g魔芋精粉，酶解水浴温度为 50 0C，酶解时间为4h。酶解过后，经高压液相色谱检测，酶解液单糖中含有21 %的葡萄糖和 甘露糖，79%的葡甘露低聚糖(质量百分比)。(4)酿酒酵母(酿酒酵母于2010年7月购自中国工业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号CICC310M)各级培养基的配制包括，①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/L，蔗 糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH，经0. IMpa灭菌20min ；②菌种发酵培养基魔芋精粉酶解液 不添加任何其他营养成分，自然PH，经0. IMpa灭菌20min。(5)酿酒酵母斜面种子制备将酿酒酵母划线接种在步骤(4)①斜面种子培养基 上，于观 30°C下恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用。(6)酵母菌发酵生产将步骤( 斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1 X IO7个 /ml的细胞悬浮液，按2% (ν/ν)接种比例接入(4)②中，置摇床200r/min，培养时间 16h。(7)薄层层析检测以葡萄糖作为标准品，将葡甘露低聚糖酶解液经酿酒酵母发 酵前后的样品进行薄层层析，结果发现样品中的单糖经酿酒酵母发酵后已基本利用完全， 样品中为100%的葡甘露低聚糖。(见图1 ;1为葡萄糖样品；2为发酵前样品；3为发酵后 样品)(8)冷冻干燥制成成品将步骤(6)得到的发酵液装入浅盘中，用保鲜膜封口， 置_70°C冰箱预冷2h，于托盘式冷冻干燥机中冷冻干燥48h。最后，把富含酿酒酵母的葡甘 露低聚糖样品经高压液相色谱检测和菌落计数，获得的葡甘露低聚糖含量为20% (质量百 分比)，酿酒酵母菌含量5. 2X105cfu/g的样品包装、封口即成本发明产品。实施例3 富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖的生产制备)
其余工艺步骤按实施例2 ；本例中与实施例2中的不同在于步骤( 魔芋精粉水溶液的配制将步骤(1)的缓冲液加热到60°C，加入魔芋精 粉配制180g/L的魔芋精粉溶液，期间用高速搅拌机120r/min不断搅拌，避免魔芋精粉结成 包块。步骤( 葡甘露低聚糖酶解样品的制备将β -甘露聚糖酶粗酶液加入步骤(2) 的魔芋精粉溶液，加酶量为40IU/g魔芋精粉，酶解水浴温度为65°C，酶解时间为他。酶解 过后，酶解液单糖中含有23%的葡萄糖和甘露糖，77%的葡甘露低聚糖。步骤(6)酵母菌发酵生产将步骤(5)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为 IX IO8个/ml的细胞悬浮液，按5% (ν/ν)接种比例接入(4)②中，置摇床200r/min， 培养时间16h。最后经过检测发现25%的葡萄糖和甘露糖全部转换成葡甘露低聚糖。最后获得的混合物质中葡甘露低聚糖含量为23% (质量百分比)，酿酒酵母菌含 量为 6. 0X105cfu/go实施例4 富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖的生产制备其余工艺步骤按实施例2 ；本例中与实施例2中的不同在于步骤( 魔芋精粉水溶液的配制将步骤(1)的缓冲液加热到55°C，加入魔芋精 粉配制140g/L的魔芋精粉溶液，期间用高速搅拌机120r/min不断搅拌，避免魔芋精粉结成 包块。步骤( 葡甘露低聚糖酶解样品的制备将β -甘露聚糖酶粗酶液加入步骤(2) 的魔芋精粉溶液，加酶量为40IU/g魔芋精粉，酶解水浴温度为65°C，酶解时间为他。酶解 过后，酶解液单糖中含有25%的葡萄糖和甘露糖，75%的葡甘露低聚糖。步骤(6)酵母菌发酵生产将步骤(5)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为 IX IO8个/ml的细胞悬浮液，按5% (ν/ν)接种比例接入(4)②中，置摇床200r/min， 培养时间16h。最后经过检测发现25%的葡萄糖和甘露糖全部转换成葡甘露低聚糖。最后获得的混合物质中葡甘露低聚糖含量为23%，酿酒酵母菌含量为 5. 0X105cfu/g。
权利要求
1.一种动物饲料添加剂，其特征在于，它包括质量含量大于20%以上的葡甘露低聚 糖；5X105cfu/g以上的酿酒酵母。
2.如权利要求1所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的葡甘露低聚糖的质量含量大 于 25%。
3.—种生产权利要求1所述的饲料添加剂，包括以下方法(a)、制备酶活力100IU/mL的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶粗酶液(b)、魔芋粉酶解液的制备，它包括以下步骤(1)ρΗ3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 的配制称取磷酸氢二钠21. 74g，柠檬酸14. 63g，加入SOOmL蒸馏水加热溶解，最后用容量 瓶定容至IOOOmL ；⑵魔芋粉水溶液的配制将步骤(1)的缓冲液加热到50-60°C，加入魔 芋粉配制100-180g/L的魔芋粉溶液，期间用高速搅拌机100-120r/min不断搅拌，避免魔芋 粉结成包块；C3)葡甘露低聚糖酶解样品的制备将步骤(a)中的甘露聚糖酶粗酶液加 入步骤( 的魔芋粉溶液，加酶量为30-40IU/g魔芋粉，酶解水浴温度为50-65°C，酶解时间 为 4-6h ；(c)、酵母菌发酵培养基的制备将步骤(b)中获得的魔芋粉酶解液不添加任何其他营 养成分，自然PH，经0. IMpa灭菌20min ；(d)、将酵母菌种子用无菌蒸馏水制备成浓度为IXIO7-IO8个/ml的细胞悬浮液，按 2-5% (ν/ν)接种比例接入(c)中的菌种发酵培养基中，置摇床200r/min，培养时间 16h ；(e)、冷冻干燥制成成品将步骤(d)得到的发酵液装入浅盘中，用保鲜膜封口， 置-70°C冰箱预冷2h，于托盘式冷冻干燥机中冷冻干燥48h ；最后，把富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖样品经高压液相色谱检测和菌落计数，将葡甘 露低聚糖含量达到20%以上，酿酒酵母5X105cfu/g以上的样品包装、封口即成明产品。
4.如权利要求3所述的方法，其中黑曲霉为包藏号为CGMCC2722的菌株。
5.如权利要求3所述的方法，其中酵母菌为保藏编号CICC31015的菌株。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其中，步骤(a)还包括以下步骤(1)、黑曲霉各级培养基的配制包括，①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/l，蔗糖 20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0. IMpa灭菌20min ；②固体种子培养基300ml三角瓶中装入 由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份80 19 1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量 1 1比例加入自来水，搅拌均勻，经0. IMpa灭菌30min;③固体生产培养基先将麸皮、豆 粕和魔芋粉按重量份75 23 3比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量 1 1.3比例加水并搅拌均勻装入布袋中，经0. IMpa灭菌30min，冷却后均勻置于曲盘中， 发酵物料厚度为2-3cm ；O)、斜面种子制备将黑曲霉菌株MA-56划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于下恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用；(3)、固体种子制备将步骤( 斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为IXlO7-IO8A/ ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基中，于下恒温培养3d，再 与无菌蒸馏水按重量1 100比例搅拌混合后，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为 1 X IO7-IO8个/ml固体种子孢子悬浮液，待用；份20 100比例混合均勻后，置曲房中发酵培养5 得饲用β-甘露聚糖酶酶曲；(5)、酶曲的后处理与质量检测将步骤(4)酶曲置40°C鼓风条件下烘干10h、粉碎、过 80目筛，得酶干曲；将经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到IX IO5-L 3 X 105U/g的酶干曲 包装、封口即成产品；(6)、称取固体酶样1份，加入18份蒸馏水，45°C水浴抽提池，板框过滤，得到酸性 β -甘露聚糖酶粗酶液，适当稀释，使酶活力达100IU/mL。
全文摘要
本发明提供一种动物饲料添加剂，其特征在于，它包括质量含量大于20％以上的葡甘露低聚糖；5×105cfu/g以上的酿酒酵母。在一个优选的方式中，所述的葡甘露低聚糖的质量含量大于25％。同时本发明一种生产富含酿酒酵母的葡甘露低聚糖饲料添加剂的制备方法。本发明集酶工程技术和发酵工程技术于一体，发明产品具有活菌制剂和双岐因子的双重功能，同时该方法生产成本低廉、简单；另外采用冷冻干燥出来的产品可作为饲料添加剂直接添加使用，无需增加后提取工艺，更进一步降低了生产成本。
文档编号C12P19/14GK102048029SQ20101025143
公开日2011年5月11日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者李艳丽, 柳永, 许少春, 许尧兴 申请人:浙江省农业科学院