专利名称：一种用于检测抗Bt小菜蛾的引物序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗Bt小菜蛾的特异性标记引物，以及利用该引物对小菜蛾进行 Bt抗性的检测方法。
背景技术：
小菜蛾(Plutella xylostella (L.))是十字花科蔬菜主要害虫，寄主多达40种以 上，已成为世界范围内蔬菜的重要害虫。小菜蛾主要以幼虫在十字花科蔬菜的整个生长期 危害叶片，大大降低了蔬菜的产量和质量，严重发生时减产超过90%，甚至绝产。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种在芽孢形成期间产 生杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性细菌。自20世纪30年代以来，Bt作为杀虫剂被用于害虫防 治。由于其毒力强，对人畜无害，对环境安全等优点，成为世界上应用最广的一类微生物杀 虫剂。在小菜蛾防治中发挥重要作用。编码Bt杀虫蛋白的基因也被转入到了多种重要的 粮棉作物中。尽管Bt使用了很长时间，并且实验室筛选发现许多昆虫可对Bt产生抗药性， 但至今田间只发现小菜蛾对Bt产生了抗药性(Tabashnik et al. ,2003 ；Heckel et al.， 2004 ；Sarfraz，2004 ；Sarfraz and Keddie，2005)，而且其抗性有发展的势头。Tabashnik等于1989年检测到田间种群对Bt制剂(kurstaki亚种)产生了 25倍 的抗药性，首次报道了田间小菜蛾对Bt杀虫剂产生了抗药性。Tang等(1996)测定弗罗里达 州田间小菜蛾对Bt制剂(BtK NRD12)的抗药性大于1500倍。Wright等(1997)报道马来西 亚田间小菜蛾种群在室内筛选饲养7代后对BtA和BtK制剂的抗药性分别为330倍和160 倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等国家和地区也有抗Bt小菜蛾的报道(Morishita et al. , 1992 ；Perez and Shelton,1997 ；Diaz-Gomez et al. ,2000 ；Mohan and Gujar,2003)o 2000年Zhao等报道从美国南卡罗尼那州田间采集的对CrylC有31倍抗性的小菜蛾抗性品 系，在实验室先用CrylC原毒素继续汰选，然后用表达高剂量的CrylC毒素的转基因花椰菜 汰选，26代后，该品系对CrylC毒素抗性高达63100倍(2龄幼虫)。国内，冯夏等(1996)报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗药性为 17. 2-30. 2倍。李建洪等(1998)通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现 小菜蛾对苏云金芽孢杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8. 9,6. 5,2. 1倍。周程 爱等(2000)报道长沙地区的小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由1. 1-4. 1倍 发展到2000年的6. 2倍的低水平抗药性。余德亿等(2000)报道福建地区田间种群的小菜 蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由1997年的2. 1倍和3. 1倍上升到1999年的8. 2倍 和10. 1倍。郭世俭等(2003)报道浙江省杭州、萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还 没有产生抗药性。王崇利等(2006)报道广东惠州田间小菜蛾种群对CrylAb和CrylAc的 抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中抗水平；对CrylAa和Cry2Aa具有低水平 抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群对CrylAb、CrylAc具有低至中等水 平抗性(8-28倍)，对Btk制剂具有低水平抗性(3. 5-7倍)。小菜蛾抗药性的上升导致了农业生产中杀虫剂施用量的加大，而这些过量的杀虫剂不但对其它生物造成危害，同时也大量地杀死了小菜蛾的天敌。这些天敌生物在对小菜 蛾的自然控制中起着重要的作用，其种群数量的下降直接影响了生态系统的平衡，使得小 菜蛾种群的制约因子受到抑制，这时所施加的杀虫剂反而帮助小菜蛾消灭了天敌，使其种 群可以持续繁衍，杀虫剂的使用往往起到适得其反的作用。小菜蛾的抗性如此突出，因此为 了更有效的使用Bt生物农药防治小菜蛾，建立一种简便、快速、可靠的抗Bt小菜蛾检测技 术尤为迫切。昆虫抗药性的监测技术主要有生物测定技术、生化检测技术、分子标记技术等。生物测定技术杀虫剂生物测定(bioassay of insecticides)，又称毒力测定，是 度量或测定杀虫剂对昆虫或部分节肢动物所产生的效应大小的生物测定技术，通常是测定 供试昆虫对不同药剂剂量或浓度所产生的效应强度。抗药性监测在传统上是比较田间和实 验室昆虫种群的LD5tl，LD90值或剂量-反应曲线的斜率(徐洪富，2003)。然而，传统的生物测定方法有一些缺点一、方法比较繁琐，操作起来比较复杂； 二、标准性不强，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化；三、传统的方法从LD-p线求 出的LD5tl和LD9tl值的重复性和精确性较低；四、传统的生物测定方法对供试昆虫测得的抗 性水平往往具有滞后性。有鉴于此，黎云根(1982)等提出用区分剂量(Discrimination Dosage)来区分RS和SS以及RS和RR个体。此技术的关键是建立SS品系。虽然应用单对 交配技术可以获得SS品系，但这项技术的应用比较困难，对大多数应用单位还存在一定的 难度。生化检测技术用于昆虫抗药性研究的生化测定方法主要包括两种一种是应用 模式底物检测不经处理的昆虫勻浆中酶的活性，另一种是应用特异性酶抗体检测导致抗药 性的酶的活性。第一类方法的应用范例是研究羧酸酯酶的升高和乙酰胆碱酯酶的不敏感性。 α-乙酸萘酯水解作用的增强已广泛应用于检测羧酸酯酶或总酯酶活性的升高，例如 Sawicki R Μ(1980)等利用该方法对桃蚜(Myzus persicae)进行了研究，类似的研究也在 多种岐类上进行(Pasteur N et al.，1981 ；Brogdon W G et al.，1983)。但是，需要强调 的是，这类底物水解作用的增强并不是抗药性的充分证据，除非证明酶的变化与抗药性有 关。而乙酰胆碱碘化物也已经作为模式底物被广泛使用，如Devonshire A L和Moores G D(1984)即用该方法对家蝇等昆虫个体的乙酰胆碱酯酶活性进行检测。微板击倒计数器 的发明则使这一技术更为精确，使其能在家蝇不同乙酰胆碱酯酶株系中快速准确地确定基 因型，甚至能够确定供试昆虫后代中不同抗性等位基因的相应组合(Moores G D et al., 1983)。在蚊类(Moores G D et al.，1983)，蚜虫类和粉虱类(Ffrench-Constant R J et al. ,1988)的抗药性检测中，也都曾用到过这一技术。应用特异性酶抗体检测导致抗药性的酶的活性的方法在昆虫抗药性研究中被应 用。Devonshire A L等(1986)利用该方法对桃蚜中羧酸酯酶的活性变化进行了研究，而 Mouches C等(1987)也利用此技术对库蚊的酯酶进行了检测。但生化测定技术并不能完全 代替生物测定技术。由于昆虫种类的不同以及农药类型的差异，在昆虫的抗药性中存在着 不同的抗性机理，在抗性监测中把生化法和生测法结合应用才能得到较好结果。分子标记技术与形态标记(Morphological markers)、细胞标记(Cytological markers)和生化标记(Biochemical markers)等相比，具有稳定性高、受环境条件影响小、信息含量高、不同层次和类群之间广泛可比等优越性。近年来分子标记技术在昆虫抗药性的研究中也得到了应用。综合文献报道，主要 进行了以下方面的研究一是应用分子标记技术对抗性昆虫品系抗性基因突变进行了分子 检测。Stcichcn等(1994)首次利用PASA技术成功检测了环戊二烯类杀虫剂抗性黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) Y _ 氨基丁酸受体 A (GABAa)基因外显子 7 的点突变。Coustau 等(1995)首先应用SSCP技术来检测昆虫对环戊二烯类杀虫剂的抗性。研究了黑腹果蝇、 埃及伊蚊(Aedes albopictus)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等昆虫中与靶标抗性有 关的基因一抗狄氏剂基因(resistant to dieldrin，Rdl)。Zhu等(2003)采用等位基因 特异性PCR技术(PASA)对抗Bt印度古螟的ASP185 — GluD185E)的突变进行了分子检测 和分析。二是对抗性昆虫品系进行了遗传分化分析和寻找与抗性有关的分子标记。 Ffrench-Constant R H等(1993)采用PCR-REN技术成功分离鉴定了敏感、抗性和抗性杂合 子果蝇品系。Heckel等(1995)对小菜蛾抗Bt品系和敏感品系的基因组DNA进行了 RAPD 标记研究，获得了 118条抗性品系特有扩增带。朱昌亮等(1998)用RAPD-PCR法对淡色库蚊 (Culex pipiens pallens)抗溴氰菊酯品系和敏感品系的基因组DNA进行了分析鉴别。结果 表明在两品系中各扩增出170条可分辨带，其中抗性品系特异带12条，敏感品系特异带9 条。这些特异片段可望作为抗性的分子标记用于抗性品系的鉴定以及进一步研究。David G 等(1999)利用双等位基因连锁技术，构建了小菜蛾抗Bt杀虫剂、Bt毒蛋白的遗传图谱，并 且找到了抗性品系特异性标记。梁革梅等(2000)利用RAPD技术对抗Bt杀虫剂、Bt毒蛋白 和转Bt基因棉的抗性棉铃虫(Helicoverpa armigera)种群进行了研究，结果成功地扩增 得到105条多态性条带，经过聚类分析发现，棉铃虫对Bt产生抗性后在基因水平发生了变 异。程罗根等(2004)采用代表性差异分析(Itepresentational difference analysis,RDA) 方法，以小菜蛾的敏感品系作为对照组，溴氰菊酯抗性近等基因系(nearisogenicline)作 为测试组，通过三轮消减杂交得到大小为150-300bp的差异扩增带，并证明测序片段可能 是与抗性相关的新基因序列或调控序列。张海等(2004)运用代表性差异分析方法对抗杀 虫双品系小菜蛾在分子水平上进行抗药性机理分析，结果在抗杀虫双品系的RDA序列中找 到了一些与人的K离子通道相关的序列，以及一条与家蚕(Bombyxmori) p450cDNA高度相关 的序列。周晓梅等(2005)采用AFLP技术对抗Bt棉铃虫进行了研究，认为BtR与AFLP标 记EaaMcta02连锁，位于第2条连锁群上EaaMcta02和EaaMcta03两个标记之间。在抗药性面前，人们仍缺少有效的办法。唯一可行的是通过采取积极的抗性治 理对策，尽可能地延缓抗性产生的速度。而这种积极有效的抗性治理策略需依赖于快速、 灵敏、准确的抗性监测技术。分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立 与成熟，为发展简便、快速、准确的小菜蛾抗性检测技术提供了有效手段。一些基于PCR 的分子标记技术如RAPD (Random Amplifide Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、 AFLP(Amplifide Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)已经用于小 菜蛾抗性相关基因的寻找上，但这些标记并未直接用于小菜蛾抗性检测。SCAR(SeqUence Characterizde Amplified Region,特征性片段扩增区域)标记是1933年由Paran和 Michelmore在RAPD技术上提出的，它基于对特异RAPD或AFLP片段的测序，根据两端序列 设计一对18 24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性十分稳
5定的分子标记，在应用上就有迅速、简便、低成本的特点。毫无疑问，小菜蛾早期抗药性高通 量分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药性风险预警提供技术 手段，在减少害虫危害损失、减少农药对环境的污染、保障蔬菜产品的质量和保障人民身体 健康等方面具有重要的意义。
发明内容
本发明目的是建立抗Bt小菜蛾的SCAR分子标记，提供抗Bt小菜蛾的特异性标记 引物，以及利用该引物对小菜蛾进行有关Bt抗性的早期快速检测方法，该方法具有检测时 间短，所需人力少，所需样品量少，检测样品量大，准确性高等特点。本发明提供的技术方案是一种用于检测抗Bt小菜蛾的引物对，其上游引物核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所述，即5，-GAGACATAAGATTCAGATTCCAGT-3，；其下游引物核苷酸序 列如 SEQ ID No. 2 所述，即:5，-CACACCCACCATATAGAA-3，。该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用AFLP标记从Eaaa/Mcta连锁 群里获得抗Bt小菜蛾的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所 设计的特异引物，以该引物对小菜蛾抗Bt种群进行PCR扩增，可获得283bp大小的特异性 片段。本发明还提供一种检测抗Bt小菜蛾的试剂盒，其包含上述的引物对。所述的试剂盒，还包含PCR Buffer缓冲液、dNTP、MgCl2, TaqDNA聚合酶和ddH20。本发明还提供一种用所述的引物对检测抗Bt小菜蛾的方法，该方法是提取待测 小菜蛾群的基因组DNA作为模板，以上述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产 物进行检测，若出现283bp的DNA条带，则待测小菜蛾群对Bt具有抗性。上述的方法，其中，从待测小菜蛾群中随机选取10-50头小菜蛾，提取其基因组 DNA作为模板。上述的方法，其中，PCR扩增采用降落PCR扩增，其反应条件如下94°C预变性 5min 后；94°C变性 30sec, 70°C退火 30sec (每个循环降 0. 5°C )，72°C 延伸lmim，共30个循环；94°C再变性30sec，55°C再退火30sec，72°C再延伸lmim，共10个 循环；最后于72°C补平7min，终止温度为8°C。本发明还提供一种利用所述引物对检测抗Bt小菜蛾的PCR反应体系，其包括PCR Buffer终浓度为 1XdNTP1. Ommol/LMgC 122. 5mmol/LTaqDNA 聚合酶2. 5U上、下游引物各Ι.ΟμΜ模板 DNA60ng余量为H2O。优选地，上述PCR反应体系，以总体积20ul计，其包括10XPCR Buffer2. 0 μ L10. Ommol/L dNTP2. 0 μ L25. Ommol/L MgCl22. 0 μ L
5. OU/ μ L TaqDNA 聚合酶0. 5 μ L10. 0μ M上、下游引物各LOyL20. Ong/ μ L 模板 DNA3. O μ L余量为ddH20。PCR Buffer终浓度为IX，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与 IXPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的IOXPCR Buffer。IOXPCR Buffer 成分为100mM Tris-HCl (pH 8.5)、500mM KCl、25mM MgCl2 和 1· 0% Triton-X 100， 溶剂为ddH20。具体地，本发明所述对抗Bt小菜蛾进行检测的方法如下(1)从待测小菜蛾群中随机选取10-50头小菜蛾幼虫，提基因组DNA ；(2)以步骤(1)提基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引 物，进行PCR扩增，PCR反应体系每20 μ L组成如下10XPCR Buffer2. 0μ L
10.Ommo1/L dNTP2. 0μ L
25. Ommo 1/L MgCl22. 0μ L
5. OU/ μ L TaqDNA 聚合酶0. 5μ L
10. 0μ M上、下游引物各 1· 0μ L
20. Ong/ μ L 模板 DNA3. 0μ L
ddH20补足至20 μ L
降落PCR反应条件如下
94°C预变性 5min 后；94°C变性 30sec, 70°C退火 30sec (每个循环降 0. 5°C )，72°C
延伸lmim，共30个循环；94°C再变性30sec，55°C再退火30sec，72°C再延伸lmim，共10个 循环；最后于72°C补平7min，终止温度为8°C ；(3)取步骤⑵扩增产物5. 0 μ L，与1. 0 μ L6X上样缓冲液混勻，点样于1. 0%的 琼脂糖凝胶中，于IXTAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后于自动凝胶成像系统上 照相，若电泳结果出现283bp的DNA条带，则待测小菜蛾群为对Bt具有一定抗性的种群。本发明具有以下有益效果采用本发明方法，可快速、大批量的早期检测待测小菜蛾。本发明检测方法与常规 生测检测方法相比，具有检测时间短，所需人力少，所需样品量少，检测样品量大，准确性高 等特点。本发明检测时间只要10小时左右，每检测一个种群只需要10-50头小菜蛾，且不 必考虑小菜蛾的龄期，只需一个人就可以完成对几个甚至十几个种群的检测；而传统生测 的方法则至少需要3天，若不能一次性采集足够的同龄期的小菜蛾幼虫，则需经过至少一 代(约两周时间)的饲养再进行测定，且每检测一个种群至少同时需要200-300头二、三龄 幼虫，检测一个种群就需要多人协作才能完成。
图1为对小菜蛾cryIAc抗性种群(DBMlAc-R)和汰选2种群(T2-R)进行PCR扩 增的结果；M为DNA分子量标准；编号1 11代表小菜蛾cryIAc抗性种群DBMlAc-R的个 体，编号12 22代表汰选2种群T2-R的个体。
图2为对上海汰种群(SH-R)进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准。图3为对小菜蛾cryIAc敏感种群(DBMlAc-S)进行PCR扩增的结果；M为DNA分 子量标准；CK是对小菜蛾cryIAc抗性种群(DBMlAc-R)进行PCR扩增的结果。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。实施例1用于检测小菜蛾抗Bt特性的特异PCR引物序列设计一、序列获得利用AFLP对小菜蛾CrylAc抗性种群(DBMlAc-R)、汰选2种群(T2-R)和上海汰种 群(SH-R)进行多态性分析发现引物组合Eaaa/MCta(E表示EcoRI引物，aaa表示选择性 碱基；M表示MseI引物，cta表示选择性碱基)在对BtCrylAc据有抗性的小菜蛾CrylAc抗 性种群(DBMlAc-R)、对BtCrylAc据有抗性的汰选2种群(T2-R)和对Bt据有抗性的上海汰 种群(SH-R)中，扩增出一条共有的特异条带，而在对BtCrylAc敏感的小菜蛾CrylAc敏感 种群(DBMlAc-S)中则没有此特异条带。对此条带进行回收连接载体，并进行测序，得到序 列。二、方法通过Primer5软件对得到的特异序列设计引物。三、引物设计原则1、两引物中G+C碱基对的百分比尽量相似；2、引物内部避免具有明显的二级结构；3、两引物之间不应有互补序列，避免形成“引物二聚体”；4、引物与靶DNA片段的配对须精确、严格，尤其3’末端；5、特异引物应具有一定的退火温度(不低于50°C )和一定的长度(不少于20个 bp)。四、结果根据以上得到的特异序列设计引物，引物序列为上游引物序列如SEQ ID No. 1 所述，即5，-GAGACATAAGATTCAGATTCCAGT-3，；下游引物序列如SEQ ID No. 2 所述，即5，-CACACCCACCATATAGAA-3，。该引物的优点扩增的条带清晰，且扩增稳定，重复性好。实施例2PCR引物序列用于检测小菜蛾抗Bt特性一、材料小菜蛾cryIAc抗性种群(DBMlAc-R)室内以转cryIAc基因甘蓝选育约300代， 之后以CrylAc毒素蛋白继代选育；汰选2种群(T2-R)田间采集小菜蛾，在室内用Bt毒素CrylAc蛋白浸叶汰选70 代；上海汰选种群(SH-R)在上海田间，采集小菜蛾，在实验室用Bt制剂浸叶进行抗 性选育60代。小菜蛾cryIAc敏感种群(DBMlAc-S)室内用干净无虫的甘蓝苗饲养多年，期间从 未施用过任何杀虫剂；上述四个小菜蛾种群在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中(R = 10cm, L
8=40cm)，笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一 个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温 度是25士 1°C，相对湿度为60% -70%，光周期为光照黑暗=16h 8h。二、方法1、小菜蛾基因组DNA的提取挑选老熟幼虫各10-50头，用70% NaCl清洗；将洗净的单头幼虫加入含有 200 μ 1细胞核裂解液(其中裂解液190. 5μ l，25mM EDTA 9. 5 μ 1)的1. 5ml离心管中，预 热5min，充分勻浆，再加入5 μ 1蛋白酶K，在55°C水浴下过夜，裂解细胞；冷却至室温，加入 RNaseA 1 μ 1，颠倒混勻后37°C温育50min，去除RNA，冷却5min至室温；在裂解物中加入 200 μ 1蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混勻25秒；再冰浴5min ；将混合物在 13，OOOrpm下离心5min，取上清到一新的1. 5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，轻柔颠倒 30次混勻或直到出现絮状白色DNA沉淀；再次13，OOOrpm离心5min，弃上清，留沉淀；加入 Iml 70%乙醇后，颠倒漂洗DNA沉淀，12，OOOrpm离心2min，弃上清；加入Iml无水乙醇，颠 倒漂洗DNA沉淀，12，OOOrpm离心2min，弃上清；倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙 醇；晾干后，加入40μ 1 DNA溶解液重新水化溶解DNA沉淀，轻弹管壁混勻，在65°C水浴lh， 中间不时轻弹管壁助溶。提取的基因组DNA先用1. 0%琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/ RNA紫外分光光度计定量检测。DNA提取物于-20°C存储备用。2、设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物序列如SEQ ID No. 1所 述，即 5，-GAGACAT AAGATTCAGATTCCAGT-3，；和下游引物序列如 SEQ ID No. 2 所述，即: 5，-CACACCCACCATATAGAA-3，，均由 Invitrogen 公司合成。3、SCAR分子标记的 PCR扩增10XPCR Buffer2. 0 μ L，10. Ommo 1/L dNTP 2. 0 μ L, 25. Ommo 1/L MgCl2 2. 0 μ L, 5. OU/ μ L TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L，10. 0 μ M 上、下游引物各 1. 0 μ L，20. Ong/μ L模板DNA 3. 0 μ L, ddH20补足至20 μ L。反应条件如下94°C预变性 5min后；94°C变性30sec, 70°C退火30sec (每个循环降0. 5°C )，72°C延伸lmim,共30个循 环；94°C再变性30sec，55°C再退火30sec，72°C再延伸lmim，共10个循环；最后于72°C补平 7min，终止温度为8°C。4、电泳检测取步骤(3)扩增产物5. 0 μ L，与1. 0 μ L6 X上样缓冲液混勻，点样与 1.0%的琼脂糖凝胶是哪个，于IXTAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后于自动凝 胶成像系统上照相。按照上述方法，分别对多种小菜蛾(图1编号1 11代表小菜蛾cryIAc抗性种 群DBMlAc-R的个体，编号12 22代表汰选2种群T2-R的个体；图2编号1 10代表上 海汰种群SH-R的个体)进行检测，以小菜蛾cryIAc敏感种群DBMlAc-S (图3编号1 10 代表小菜蛾cryIAc敏感种群DBMlAc-S的个体)为阴性对照，电泳结果见图1、图2、图3，其 中，图1编号1 22和图2编号1 10为小菜蛾抗Bt种群，扩增出分子量为283bp的特 殊DNA条带，其余编号为敏感种群，未见有283bp的DNA条带。
权利要求
一种用于检测抗Bt小菜蛾的引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测抗Bt小菜蛾的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包含PCRBuffer缓冲液、dNTP、 MgCl2、TaqDNA 聚合酶和 ddH20。
4.一种用权利要求1所述的引物对检测抗Bt小菜蛾的方法，其特征在于提取待测小 菜蛾群的基因组DNA作为模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增， 对扩增产物进行检测，若出现283bp的DNA条带，则待测小菜蛾群对Bt具有抗性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于从待测小菜蛾群中随机选取10-50头小 菜蛾，提取其基因组DNA作为模板。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增为降落PCR扩增反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述降落PCR扩增反应条件如下 94°C预变性5min后；94°C变性30sec，70°C退火30sec，每个循环降0. 5°C，72°C延伸lmim，共30个循环；94°C再变性30sec，55°C再退火30sec，72°C再延伸lmim，共10个循环； 最后于72°C补平7min，终止温度为8°C。
8.一种利用权利要求1所述引物对检测抗Bt小菜蛾的PCR反应体系，其包括 PCR Buffer终浓度为1 XdNTP1. Ommol/LMgCl22. 5mmol/LTaqDNA 聚合酶2. 5U上、下游引物各Ι.ΟμΜ模板 DNA60ng余量为H20。
9.根据权利要求8所述的PCR反应体系，以总体积20ul计，其包括 10XPCR Buffer2. 0 μ L 10. Ommol/L dNTP 2. 0 μ L 25. Ommol/L MgCl2 2. 0 μ L5. OU/ μ L TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L 10. ομ M上、下游引物各l.OyL，20. Ong/ μ L 模板 DNA3. 0 μ L余量为ddH20。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测抗Bt小菜蛾的特异性标记引物，以及利用该引物对小菜蛾进行有关Bt抗性的早期检测的方法。所述引物序列为上游引物5’-GAGACATAAGATTCAGATTCCAGT-3’，下游引物5’-CACACCCACCATATAGAA-3’。采用本发明方法，利用本发明引物，可知是否具有此分子标记，并可快速、大批量的早期检测待测小菜蛾。本发明检测方法与常规生测检测方法相比，具有检测时间短，所需人力少，所需样品量少，检测样品量大，准确性高等特点。
文档编号C12N15/11GK101899523SQ20101025250
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者吴青君, 夏吉星, 张友军, 徐宝云, 朱勋, 杨中侠, 杨峰山, 王俊华, 王少丽, 秦悦, 郭兆将, 陈得峰, 雷妍圆 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所