专利名称：一种宛氏拟青霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种甲醛降解菌，具体涉及一种宛氏拟青霉H6 (Paecilomyces variotii)及其在降解甲醛方面的应用。
背景技术：
因应用领域的广泛及重要性，关于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究早有报 道。早期人们着手于低浓度降解甲醛的研究，近年来高浓度降解甲醛时有报道。 Adroer 等(1990)分离的 Pseudomonas putida A2 能降解甲醛 250mg · L-1 ； Azachil 等 (1995)分离的 Halomonas sp.MAC 仅能耐受甲醛 75 IOOmg · I/1 ； Doronina 等(1997) 分离的 Pseudomonas.alcaligenes 能降解甲醛 200mg · I/1，菌株 Pseudomonas putida J3 能降 解甲醛 450mg · L-1，Methylobacteriumextorquens 能降解甲醛 500 IOOOmg · I/1 ； 一株 Pseudomonas alcaligenes 培养 3 天后能降解甲醛 2000mg · I/1。Mirdamadi 等(2005)报 道 Methylobacterium extorquens (ESS 禾口 PSS)禾口 四株 Pseudomonas pseudoalcaligenes (LSW, SSW, NSW, OSS)能降解甲醛 1850mg · I/1，其中菌株 Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS 培养 24h 消耗 3700mg · I71 甲醛 100%，培养 72h 消耗 5920mg · I71 甲醛 70%， Methylobacterium extorquens ESS 禾口 Methylobacterium extorquens PSS 还能完全降角军甲酸 2960mg · I71。Bonastre等(1986)报道在C 为2300mg · dm 3的活性污泥做基质的 实验里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧条件下被好氧菌降解；当以甲醛为碳源时降解 甲醛400mg · dm3，在活性污泥厂的废水处理中完全降解甲醛2300mg · dm3和苯酚 2400mg · dm3(Zagomayaetal，1990)。Yamazaki 等(2001)从海水里分离了一株甲醛耐 受细菌，发现它在3%的氯化钠里能降解甲醛400mg · dm3，在Eiroa等(2004)设计的 模型里，指出硝化作用可以降解甲醛，当以甲醛为碳源、甲醇为伴生碳源时，硝化细菌 可以降解甲醛的浓度是30 3890mg · dm3，而反硝化细菌在有甲醛和甲醇存在时可以 降解 1360mg · dm3 甲醛(Eiroaetal，2006)。现有的研究，无论是低浓度降解甲醛还是高浓度降解甲醛，大部分都是关于是 降解甲醛细菌和降解甲醛酵母菌的研究，而关于降解甲醛霉菌的研究报道很少。Kondo 等(2002)从土壤中分离 了一株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomiusIRI013, 它能生长在最高= 0.45%里并把它完全消耗掉。国内这方面的研究近两年来也 渐多，黄赛花等人有一系列技术报道，从家具厂未处理出水口处分离到甲醛降解真菌 (2007)，研究出 3 株甲醛转化霉菌 Trichoderma viride Hl，Penicillium javanicum H2， Aspergillus flavus H4,均能生长在以甲醛为唯一碳源的培养基上，可将甲醛浓度分别由 1047mg/L、1059mg/L 和 1241mg/L 转化至 7.6mg/L、317mg/L 和 4.0mg/L，转化率分别 为99.3%、70.1%和99.7% (2008)，都能利用4种复合碳源(0.1 %甲醛+10%蔗糖，0.1% 甲醛+10%麦芽糖，0.1%甲醛+10%淀粉，0.1%甲醛+10%葡萄糖)并转化甲醛，其转化 率分别在 99.6%、74.9%和 99.3% 以上(2009)。
但是随着甲醛污染的生物处理工程技术日新月异的需求，上述降解甲醛菌数据 库显得非常不足，迫切需要更多关于降解甲醛菌的技术研究成果为甲醛污染的生物处理 工程提供强有力的帮助。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有甲醛降解菌技术的不足，提供一种新的甲醛降解菌，所述甲醛降解菌易培养，甲醛转化效率高。本发明的另一个目的是提供所述甲醛降解菌的应用。本发明的技术方案通过以下技术予以实现提供一种新的甲醛降解菌，为宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)菌株，于2010 年4月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏，保藏号是CGMCCNo.3722，命名为宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6。所述宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6的平板观察特征和显微观察特征如 下H6在察氏培养基上生长速度快，培养7天菌落直径直径6cm，表面土黄色，质 地为松絮状至绳状，反面淡褐色，菌丝老后于表面产生黑褐色的渗出液；在麦芽汁琼脂 上菌落生长快，培养7天菌落直径直径8cm，表面浅黄绿色(与察氏培养基上菌落相比带 绿色调)，质地松絮状至索状；在查氏酵母膏琼脂上，培养7天菌落直径直径8cm，表面 土红色，质地松絮状，反面黄褐色。显微镜下可以观察到分生孢子结构差异大，有单个 的小梗和复杂的多次帚状分枝；分生孢子梗自气生菌丝或绳状菌丝索生出，小梗细长渐
尖常弯曲，8-25D 1.5-2.0μπι，分生孢子椭圆形，4-50 2-3μπι,光滑。所述宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii) H6 的 18Sr DNA 比对序列见 SEQ ID NO 1所示。其18SrDNA序列与宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)同源率达100%。本发明同时提供了所述宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6的甲醛降解特性实
验，通过大量实验证明了 H6的甲醛转化效率很高，可以作为优良的甲醛降解菌应用于甲 醛污染的生物处理方面。本发明的有益效果是本发明提供了 一种新的宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) H6，所述菌株具 有优良的降解甲醛的能力，极大地补充了降解甲醛菌的资料库；所述宛氏拟青霉 (Paecilomyces variotii)H6在自然界中分布范围广，繁殖迅速，生长能力强。本发明提供了宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6在甲醛降解方面的应用，为
甲醛污染的生物处理工程，提供了强有力的技术支持。
图1H6在察氏培养基上菌丝生长情况图2H6在麦芽汁琼脂上菌丝生长情况图3H6在查氏酵母膏琼脂上菌丝生长情况
图4H6显微镜下孢子结构 图5不同甲醛浓度培养基中的H6降解曲线
图6不同甲醛浓度培养基的空白曲线 图7不同甲醛浓度培养基中的H6生长曲线
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1本发明甲醛降解菌一宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6的分离与鉴
定1、培养基配方基本培养基1.0%(w · ν—1)葡萄糖，0.2% (w · NaNO3, 0.1% (w · ν-1) K2HPO4, 0.05 % (w · ν-1) MgSO4 · 7H20, 0.05 % (w · v_1)KCl, 0.001 % (w · FeSO4 · 7H20, 0.01% (w · 酵母膏，0.1% (w · 甲醛(甲醛用市售甲醛标准溶 液)，培养基最终pH为6.0。(如没有特别说明，以下基本培养基均为此配方培养基)察氏培养基配方3.0%(w .ν—1)蔗糖，0.3% (w · NaNO3, 0.1% (w ·丨1) K2HPO4, 0.05 % (w · ν-1) MgSO4 · 7H20, 0.05 % (w · v_1)KCl, 0.001 % (w · FeSO4 · 7H20, 1.5 ~ 2.0% (w · 琼脂。麦芽汁培养基配方2.0% (w · V1)麦芽浸膏，0.1% (w · V1)蛋白胨，2.0% (w · ν—1)葡萄糖，1.5-2.0% (W · V-1)琼脂。查氏酵母膏琼脂配方K2HPO4CU % (w · v—1)，酵母膏0.05% (w · ν—1)，蔗糖 3.0% (w ·丨1)，查氏浓储液 ml(w ·丨1)，1.5 2.0% (w · ν-1)琼脂。pH 自然。 其中查氏浓储液配方NaN0330g，KCl 5g, FeSO4 · 7H200.1g, MgSO4 · 7H20 5g,水 lOOmL。2、分离纯化随机取菜园土 1kg，晾至7 8成干，0.1 % (w · ν—1)的甲醛溶液200mL，用 滴管均勻加入菜园土样中，4 5天后再重复加入一次0.1%的甲醛溶液200mL，3 4 天后混勻取样IOOg左右，在超净工作台上，取IOg经0.1%甲醛驯化的土样置于90mL 无菌水中，振荡15min，放置20秒，取ImL上清液接种于基本培养基中，在摇床上 160r ^miiTiiTC培养5d，生长起来的真菌再多次用PDA培养基平板画线，经多次纯化， 分离到一株霉菌，编号H6。然后将菌株H6分别接种于察氏培养基、麦芽汁培养基、查 氏酵母膏琼脂上，25°C培养8d，观察其菌落特征。同时，显微镜下观察显微结构，并记 录好结构特征。H6在察氏培养基上生长速度快，培养7天菌落直径直径6cm，表面土黄色， 质地为松絮状至绳状，反面淡褐色，菌丝老后于表面产生黑褐色的渗出液，见附图1所 示；H6在麦芽汁琼脂上菌落生长快，培养7天菌落直径直径8cm，表面浅黄绿色， 与察氏培养基上菌落相比带绿色调，质地松絮状至索状，见附图2所示；H6在查氏酵母膏琼脂上，培养7天菌落直径直径8cm，表面土红色，质地松絮 状，反面黄褐色，见附图3所示。显微镜下观察，H6分生孢子结构差异大，有单个的小梗和复杂的多次 帚状分枝；分生孢子梗自气生菌丝或绳状菌丝索生出，小梗细长渐尖常弯曲，8-25 .5-2.0μπι,分生孢子椭圆形，4-5D 2-3μιη，光滑，见附图4所示。提取DNA，检测DNA浓度和纯度，PCR 18S rDNA扩增等一系列的分子鉴定， 所述宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) H6的18& DNA比对序列见SEQ IDNO 1所示， 本发明分离纯化得到的降解甲醛菌的18SrDNA序列与宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) 同源率达100%，其培养特征及显微特征也与宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)最相似。由此可见，本发明筛选到的降解甲醛菌是宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)。实施例2本发明宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) H6对甲醛的降解实验1、一级种子的制取 选取产孢良好的宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6，接种在基本培养基中， 摇床160r · miiT1，30°C培养2 3d，当霉菌进入快速生长期时，定时测定OD475值，当 OD475值快速上升时，此菌液即可作为一级种子。2、实验方案选取大口 150mL三角瓶，配制基本培养基，按约0.1%、0.15%, 0.2%, 0.25% (w - ν"1)加入(C 以实际测量数据为准)，瓶口用无菌封口培养膜封口，培养一 级种子(OD475值为0.915)，除空白外每瓶接入5mL，置摇床上30°C 160r · miiT1培养，并 在接种的第O、24、48、72、96、120、144h分别取样，每次取3瓶，其中一瓶为空白， 取样后先7000 X超低温离心15min、过滤，滤液用AHMT分光光度法检测C甲·，滤纸和 菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重，菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值 作图。OD值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，
菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。结果见附图5 附图7所示。其中，附图5为不同甲醛浓度培养基中的H6降解 曲线，附图6为不同甲醛浓度培养基的空白曲线，附图7不同甲醛浓度培养基中的H6生 长曲线。由附图5 附图7可知4个浓度的空白在144h内的挥发很少，基本可以忽略不计，见附图6所示。当甲醛初始浓度为1245mg/L时，144h下降到87.5mg/L，降解率为93.0%， 快速降解从48h后开始，见附图5所示；菌丝干重也从0.4902g上升到0.5422g，增加了 0.0520g,快速增长从72h后开始，见附图7所示；当甲醛初始浓度为1658mg/L时，144h 下降到451mg/L，降解率为72.8%，快速降解从48h后开始，菌丝干重也从0.4826g上 升到0.5223g，增加了 0.0397g，快速增长从96h后开始；当甲醛初始浓度分别为2376、 2880mg/L时，144h下降到1623、2021mg/L,降解率分别为31.7、29.8%,没有快速降 解期，菌丝干重增加缓慢，没有明显的快速增长。
权利要求
1.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)菌株H6，于2010年4月9日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会，保藏号是CGMCCNo.3722。
2.权利要求1所述宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)菌株H6的序列表。
3.权利要求1所述宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)菌株H6的应用，其特征在于应用于降解甲醛。
全文摘要
本发明公开了一种宛氏拟青霉(Paecilonyces variotii)菌株H6及其应用。所述宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)菌株H6于2010年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号是CGMCC No.3722。所述宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6在自然界中分布范围广，繁殖迅速，生长能力强，本发明提供了宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)H6在降解甲醛方面的应用，为甲醛污染的生物处理工程提供技术支持。
文档编号C12R1/79GK102021120SQ20101025365
公开日2011年4月20日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者刘婷琳, 卢普相, 孙翠香, 彭珏, 陈能场, 高原雪, 黄赛花 申请人:广东省生态环境与土壤研究所