专利名称：病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系、其使用方法、用途和相关试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及原代细胞分离技术领域，特别涉及肿瘤组织源性原代细胞分离技术领域，具体是指一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系、其使用方法、用途和相关试剂盒。
背景技术：
在生物医药行业，尤其是原代细胞培养在药物研发的应用产业，利润空间大，能源消耗小，技术水平高，是中国国家改革与发展委员会确定的政策扶持性行业，已经列入国家改革与发展委员会2010年之前中国重点发展行业指导名录。各省政府等地方政府对该类项目，均列入关键技术、重大项目进行扶持，在人力、财力上享受特别的优惠待遇。肿瘤组织源性原代细胞指从机体肿瘤组织经特殊技术方法处理后，而获得肿瘤组织源性单个细胞并在体外培养进行，完全正确的模拟机体肿瘤组织生物学功能，这种细胞称为肿瘤组织源性原代细胞。培养第1-10代以内的肿瘤组织源性原代细胞统称为肿瘤组织源性原代细胞培养。肿瘤组织源性原代细胞的基本生物学特征1、与机体肿瘤组织源性细胞生长的生物学特征完全一样。2、能完全正确的反映肿瘤组织生物学特征。3、能完全正确的反映机体肿瘤组织对检测实验的结果。4、能完全正确的反映机体肿瘤组织对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药理学分析、对药物治疗性判断。5、肿瘤组织源性原代细胞生物学特征与肿瘤组织细胞系(或株)有明显地差异性，如细胞遗传学、DNA结构、蛋白质成分等等。目前，国内外市场上在生物医药行业的药物研发中，细胞水平上研发绝大多数是使用肿瘤细胞系，这类细胞最大缺点是与肿瘤组织源性原代细胞有明显地差异性，不能正确地反应机体组织生物学特征和生理学功能。肿瘤组织源性原代细胞的分离和培养一直是一难点，其原因是细胞消化酶应用问题使分离后的原代细胞不易体外成活。用肿瘤组织源性原代细胞评估药物研发一直是生物医药行业热点和难点。因此，需要提供一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的试剂，其能高特异地、高灵敏度地分离病人肿瘤组织源性原代细胞，分离的原代细胞可用于对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药物治疗性判断。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系、其用途和相关试剂盒，该多酶体系设计合理，能高特异地、高灵敏度地分离病人肿瘤组织源性原代细胞，分离的原代细胞成活率高、纯度高、易于冻存和复苏，可用于对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药物治疗性判断，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系，其特点是，包括0. 02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶 I-IV(CollagenaseI-IV)、0· 001-0· 01% (重量)透明质酸酶(Hyaluronidase)、0· 01-0. 1% (重量)胰蛋白酶 CTrypsin)、0· 02-0. 2 % (重量)中性蛋白酶(Neutral Protease)、 0. 001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶 I(Deoxyribonuclease I)、5_50U/ml 弹性蛋白酶 (Elastase)。在本发明的第二方面，提供了一种病人肿瘤组织源性肿瘤原代细胞分离方法，其特点是，采用上述的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系对病人肿瘤组织源性肿瘤原代细胞进行三步消化处理第一步消化使用0.02-0.2% (重量)胶原蛋白酶I-IV、0.001-0.01% (重量) 透明质酸酶；第二步消化使用0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶；第三步消化使用0. 001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5_50U/ml弹性蛋白酶。在本发明的第三方面，提供了上述的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系在分离病人肿瘤组织源性原代细胞中的应用。较佳地，所述病人肿瘤组织源性原代细胞为病人肝癌组织源性原代细胞、肺癌组织源性原代细胞、乳腺癌组织源性原代细胞、前列腺癌组织源性原代细胞。在本发明的第四方面，提供了一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒，其特点是，包括装有上述的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系的试剂容器。本发明的有益效果在于1、本发明提供了一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系，包括胶原蛋白酶I-IV、透明质酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I和弹性蛋白酶，其特点是(1)对肿瘤组织源性原代细胞分离的特异性；(2)肿瘤组织源性原代细胞分离后培养成活率高；(3)肿瘤组织源性原代细胞分离后培养纯度高；(4)肿瘤组织源性原代细胞易于冻存和复苏。适于大规模推广应用。2、本发明提供的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系的最大优点是(1) 肿瘤组织源性原代细胞是由多种类型细胞组成，应用多种酶消化组织，可使肿瘤组织源性原代细胞分离更为彻底；(2)每种酶的用量少，对组织分离的肿瘤组织源性原代细胞损伤小；(3)组织分离后的肿瘤组织源性原代细胞体外培养易于存活；(4)分离的肿瘤组织源性原代细胞保持源性组织生物学特性。该病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系设计合理、质量稳定可靠。3、本发明采用上述病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系对对病人肿瘤组织源性肿瘤原代细胞进行三步消化处理第一步消化使用0. 02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶I-IV、0.001-0.01% (重量)透明质酸酶；第二步消化使用0.01-0.1% (重量)胰蛋白酶、0.02-0.2% (重量)中性蛋白酶；第三步消化使用0.001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。可以高特异地、高灵敏度地分离病人肿瘤组织源性原代细胞，分离的原代细胞成活率高、纯度高、易于冻存和复苏，可用于对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药物治疗性判断，适于大规模推广应用。4、本发明提供了包括病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系的试剂盒，使得使用者简单、快速、且高特异地、高灵敏度地分离病人肿瘤组织源性原代细胞，分离的原代细胞成活率高、纯度高、易于冻存和复苏，可用于对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药物治疗性判断，适于大规模推广应用。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系，该多酶体系包括胶原蛋白酶I、II、III、IV、透明质酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I和弹性蛋白酶。在此基础上形成了病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒，用于分离病人肿瘤组织源性原代细胞(例如病人肝癌组织源性原代细胞、肺癌组织源性原代细胞、乳腺癌组织源性原代细胞、前列腺癌组织源性原代细胞)。在此基础上完成了本发明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1分离肝癌组织源性原代细胞病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒的多酶体系0. 02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶、0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶、0.001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。对病人肿瘤组织源件原代细胞采用三步法消化分离技术，第一步消化使用 0. 02-0.2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶第二步消化 使用0.01-0.1% (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶第三步消化使用 0. 001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。分离肝癌组织源性原代细胞纯度97%、培养成活率94%、冻存后复苏培养成活率 75%。分离的肝癌组织源性原代细胞的生物学特性具有粘附性、迁移性、浸润性和转移性。实施例2分离肺癌组织源性原代细胞病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒的多酶体系0. 02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶、0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶、0.001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。对病人肿瘤组织源件原代细胞采用三步法消化分离技术，第二步消化使用 0. 02-0.2% (重量)胶原蛋白酶I-IV、0· 001-0. 01% (重量)透明质酸酶第二步消化 使用0.01-0.1% (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶第三步消化使用 0. 001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。分离肺癌组织源性原代细胞纯度92 %、培养成活率90 %、冻存后复苏培养成活
5率 71%。分离的肺癌组织源性原代细胞的生物学特性具有粘附性、迁移性、浸润性和转移性。实施例3分离乳腺癌组织源性原代细胞病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒的多酶体系0. 02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶、0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶、0.001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。对病人肿瘤组织源性原代细胞采用三步法消化分离技术，^^itiil:使用 0. 02-0.2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶第二步消化 使用0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶第三步消化使用 0. 001-0.01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。分离的乳腺癌组织源性原代细胞纯度95%、培养成活率93%、冻存后复苏培养成活率73%。分离乳腺癌组织源性原代细胞的生物学特性具有粘附性、迁移性、浸润性和转移性。实施例4分离前列腺癌组织源性原代细胞病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒的多酶体系0. 02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶、0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶、0.001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。对病人肿瘤组织源件原代细胞采用三步法消化分离技术，第一步消化使用 0. 02-0.2% (重量)胶原蛋白酶I-IV、0.001-0.01% (重量)透明质酸酶第二步消化 使用0.01-0.1% (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶第三步消化使用 0. 001-0.01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。分离前列腺癌组织源性原代细胞纯度90%、培养成活率89%、冻存后复苏培养成活率69%。分离的前列腺癌组织源性原代细胞的生物学特性具有粘附性、迁移性、浸润性和转移性。本发明提供了分离病人肿瘤组织源性原代细胞的多酶体系和三步法消化分离技术，病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系是本发明人经过多年的研究开发的高特异性、高灵敏度的肿瘤组织源性原代细胞分离多酶体系，在此基础上发明了新一代病人肿瘤组织源性原代细胞多酶体系分离试剂盒，用于对病人肿瘤组织源性原代细胞进行分离。本发明的特有优势和最大优点是(1)组织是由多种类型细胞组成，应用多种酶消化组织，可使肿瘤组织源性原代细胞分离更为彻底；( 每种酶的用量少，肿瘤组织源性原代细胞损伤小；(3)组织分离后的肿瘤组织源性原代细胞体外培养易于存活；(4)分离的肿瘤组织源性原代细胞保持源性组织生物学特性。该组织源性原代细胞分离的多酶体系设计合理、质量稳定可靠；(5)分离的肿瘤组织源性肿瘤原代细胞可用于对药物实验性评估、 对药物毒性测试、对药理学分析、对药物治疗性判断，适于大规模推广应用。由于中国对生命科学研究和生物医药企业的重视，本发明人专门对病人肿瘤组织源性原代细胞分离使用的多酶体系进行了研究，有了新的认识，病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒不但将被生命科学研究市场普遍接受，也将深受中国生物医药企业的研发和应用领域的普遍关注，将会得到广泛使用。类似本发明的产品目前在市场尚未出现。采用本发明，病人肿瘤组织源性原代细胞分离的特异性、敏感性和准确性有了巨大的提高，能够准确地对病人肿瘤组织源性原代细胞60种进行分离。因此本项目具有显著的社会价值、经济效益和技术先进性，符合国家和地方的产业扶持政策。综上，本发明的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系设计合理，能高特异地、高灵敏度地分离病人肿瘤组织源性原代细胞，分离的原代细胞成活率高、纯度高、易于冻存和复苏，可用于对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药物治疗性判断，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图
应被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系，其特征在于，包括0.02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶Ι- ν、0·001-0·01% (重量)透明质酸酶、0.01-0. (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶、0.001-0. 01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5_50U/ml 弹性蛋白酶。
2.一种病人肿瘤组织源性肿瘤原代细胞分离方法，其特征在于，采用根据权利要求1 所述的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系对病人肿瘤组织源性肿瘤原代细胞进行三步消化处理第一步消化使用0.02-0. 2% (重量)胶原蛋白酶I-IV、0.001-0.01% (重量)透明质酸酶；第二步消化使用0.01-0.1% (重量)胰蛋白酶、0.02-0. 2% (重量)中性蛋白酶；第三步消化使用0.001-0.01% (重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系在分离病人肿瘤组织源性原代细胞中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病人肿瘤组织源性原代细胞为病人肝癌组织源性原代细胞、肺癌组织源性原代细胞、乳腺癌组织源性原代细胞、前列腺癌组织源性原代细胞。
5.一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离试剂盒，其特征在于，包括装有根据权利要求 1所述的病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系的试剂容器。
全文摘要
本发明涉及一种病人肿瘤组织源性原代细胞分离的多酶体系，包括0.02-0.2％(重量)胶原蛋白酶I-IV、0.001-0.01％(重量)透明质酸酶、0.01-0.1％(重量)胰蛋白酶、0.02-0.2％(重量)中性蛋白酶、0.001-0.01％(重量)脱氧核糖核酸酶I、5-50U/ml弹性蛋白酶，还涉及上述多酶体系的使用方法、应用和形成的试剂盒，本发明的多酶体系设计合理，能高特异地、高灵敏度地分离病人肿瘤组织源性原代细胞，分离的原代细胞成活率高、纯度高、易于冻存和复苏，可用于对药物实验性评估、对药物毒性测试、对药物治疗性判断，适于大规模推广应用。
文档编号C12N9/22GK102373186SQ20101025475
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘东旭 申请人:刘东旭