专利名称：一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用基因工程手段获得的一种普鲁兰酶编码基因及其应用，属于微生 物、酶工程技术领域。
背景技术：
淀粉质原料是迄今最为广泛应用的工业原料之一，淀粉是由直链淀粉和支链淀 粉构成的混合物，其中直链淀粉由葡萄糖通过α-1，4-糖苷键连接形成，而支链淀粉还含 有分支链，连接分支处的是α-1，6_糖苷键。淀粉水解酶是能对淀粉质原料进行水解利用 的一类酶，以α-淀粉酶和糖化酶最为常用，这两种酶均作用于淀粉分子的α-1，4_糖苷 键。由于工业上使用的淀粉一般都含有一定量的支链，因此要将淀粉分子彻底水解就需要 使用一类能专一性切开支链淀粉分支点α-1，6-糖苷键的酶，这种酶一般称为解支酶，以 普鲁兰酶和异淀粉酶最为常用，两者都能水解支链淀粉中的α-1，6-糖苷键，而只有前者 能水解普鲁兰分子中的α-1，6_糖苷键。普鲁兰酶与α-淀粉酶和糖化酶配合使用能使淀 粉分子彻底水解为葡萄糖，提高淀粉质原料利用率，因此在淀粉制糖、燃料酒精生产等行业 有重要的用途和良好的市场前景。另外普鲁兰酶在直链淀粉制备，高果糖浆、高麦芽糖浆 等的生产中也有广泛的应用。本发明从自然界中筛选到一株具有普鲁兰降解能力的芽孢 杆菌，其编号为Bacillus sp.042。该细菌已被江南大学中国高校工业微生物资源与信息 中心(http:// www. cicim-cu. Jiangnan. edu. cn)收藏，其收藏编号为 Bacillus sp. CICIM B4312。利用基因工程技术从Bacillus sp. 042基因组DNA中克隆了一条普鲁兰酶编码基 因pulA042，功能鉴定证实pulA042编码I型普鲁兰酶。
发明内容
本发明要解决的技术问题是主要利用基因重组技术从普鲁兰酶产生菌基因组 DNA中克隆胞外普鲁兰酶编码基因并确认其功能，为利用基因重组技术生产普鲁兰酶提供 基因资源。本发明的技术方案一种来源于芽孢杆菌Bacillus sp. 042的胞外普鲁兰酶编码 基因，命名为PU1A042，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1，其编码的普鲁兰酶原酶的氨基酸序 列为SEQ ID NO :2，基因pulA042与克隆载体pMD18_T Simple组成的重组质粒pMD_PA的 大肠杆菌转化子，分类命名为JM109/pMD-PA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO :M 2010200。所述普鲁兰酶编码基因pulA042的获得方法如下(1)从自然界筛选产普鲁兰酶的芽孢杆菌从自然界采集土样，采用高温处理杀 死营养体细胞，富集芽孢杆菌。在以普鲁兰为唯一碳源的培养基上富集产普鲁兰酶细菌。进 一步通过摇瓶培养和普鲁兰酶酶活检测筛选产胞外普鲁兰酶的细菌。用16s rDNA基因序 列分析确认所筛选微生物属于芽孢杆菌属。此轮工作选定芽孢杆菌Bacillus sp.042为普 鲁兰酶基因克隆研究的出发菌。
(2)Bacillus sp. 042普鲁兰酶基因的克隆第一步根据细菌普鲁兰酶基因保守区设计引物，以Bacillus sp. 042染色体DNA 为模板PCR获得普鲁兰酶基因部分片段。序列分析获得该片段核苷酸序列，并根据所获DNA 序列设计一对反向PCR引物。第二步利用反向PCR技术获得普鲁兰酶编码基因的完整序列。利用上一步设计的一对反向PCR引物，通过PCR获得普鲁兰酶编码基因编码区完 整DNA片段，该片段与克隆载体pMDIS-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉 素的LB平板上筛选转化子。从获得的转化子中提取质粒测序，获得普鲁兰酶编码基因编码 区完整序列，所获普鲁兰酶编码基因命名为PU1A042，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1。第三步获得Bacillus sp. 042普鲁兰酶编码基因根据SEQ ID NO :1再设计一对引物以扩增Bacillus sp. 042普鲁兰酶编码区完 整基因，以Bacillus sp. 042染色体DNA为模板，PCR扩增获得一 2. 5kb左右的DNA片段， 扩增片段纯化后与克隆载体PMD18-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素 的LB平板上筛选转化子。其编码的普鲁兰酶原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :2。基因 pulA042与克隆载体pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD_PA的大肠杆菌转化子，其分类命 名为JM109/pMD-PA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号CCTCC NO =M 2010200。普鲁兰酶编码基因pulA042的应用普鲁兰酶编码基因pulA042能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用 于分解淀粉和糊精分子中α-1，6糖苷键。材料和方法普通分子生物学方法除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分 子克隆实验手册)。除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等 1989分子克隆实验手册)。DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。克隆载体pMD18-T Simple为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D506A。反向PCR 技术参照文献进行[Ochman H, Gerber AS and Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120:621-623]。大肠杆菌JM109，大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌表达载体pET28a均由中国高校工 业微生物资源与信息中心(http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。DNA操作使用的酶和试剂盒除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝 生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品Ex Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时 附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶 中回收DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A。其他试剂普鲁兰为Sigma公司产品，红色普鲁兰为Megazyme公司产品，糯米淀粉和玉米淀 粉均为浙江菱湖淀粉厂产品，酵母氮基为Difco公司0/0型酵母氮基，该产品不含碳源和氨 基酸。红色普鲁兰、糯米淀粉和玉米淀粉溶液均采用10mM、pH 6. O的磷酸缓冲液配制，磷酸 缓冲液使用双蒸水配制。诱导大肠杆菌基因表达使用的IPTG为宝生物工程有限公司产品， 产品编号为D9030A。培养基LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。以普鲁兰为唯一碳源的固 体培养基酵母氮基lg/L，普鲁兰2g/L，琼脂粉15g/L，用双蒸水配制；发酵培养基酵母氮 基lg/L，普鲁兰2g/L，(NH3)2SO4O. lg/L，用双蒸水配制。摇瓶培养均采用500mL三角瓶，在 37°C条件下按220r/min条件在恒温摇瓶柜中进行。碘溶液按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京轻工业出版社]中第 398页“稀碘液”配制。细菌的16s rDNA基因序列分析按文献进行[陈源源，牛丹丹，王正祥.一种快速鉴定细菌的方法.食品与发酵工 业，2007，33 (5) :29-31]。普鲁兰酶活力测定普鲁兰酶酶活测定按文献报道的方法进行[Bibel M, Brett C, Gosslar U， et al. Isolation and analysis of amylolytic enzymes of the hyperthermophi1ic bacteriumThermotoga maritime. FEMS Microbiol Lett, 1998,158 :9 15]本发明的有益效果本发明实施后获得的普鲁兰酶编码基因编码的普鲁兰酶在淀 粉加工中具有分解淀粉和糊精中α-1，6糖苷键的功能，利用本发明获得的普鲁兰酶编码 基因构建重组微生物可实现普鲁兰酶的高效率生产。生物材料样品保藏基因pulA042与克隆载体pMD18_T Simple组成的重组质粒 PMD-PA的大肠杆菌转化子，分类命名为JM109/pMD-PA，已保藏在中国典型培养物保藏中 心，保藏日期2010年8月11日，保藏编号CCTCC NO :M2010200。
图lpulA042基因表达产物对红色普鲁兰的降解。图1中A:BL21(DE3)/pET28a破碎液与红色普鲁兰的反应液经酒精沉淀后上清液 为无色，显示红色普鲁兰没有被分解。图1中B :BL21(DE3)/pET-PA破碎液与红色普鲁兰的 反应液经酒精沉淀后的上清液为红色，显示有部分红色普鲁兰被降解。图2pulA042基因表达产物与糯米淀粉的反应。图2中A :BL21 (DE3) /pET-PA破碎液与糯米淀粉的混合液在反应后与碘反应的颜 色由紫红色转变为深蓝色，显示糯米淀粉的支链被切断，淀粉的支链含量下降。图2中B BL21 (DE3)/pET28a破碎液与糯米淀粉的混合液在反应后与碘反应的颜色仍为紫红色，显示 糯米淀粉的支链没有被切断。
图3pulA042基因表达产物与玉米淀粉的反应。图3中A 重组菌BL21 (DE3) /pET28a的破碎液与玉米淀粉的混合液在反应后与碘 反应的颜色仍为深蓝色；B 重组菌BL21 (DE3)/pET-PA破碎液与玉米淀粉的混合液在反应 后与碘反应的颜色同样仍为深蓝色，显示玉米淀粉没有发生明显变化。
具体实施例方式通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。实施例1 产普鲁兰酶芽孢杆菌Bacillus sp. 042的获得从自然界筛选产普鲁兰酶的芽孢杆菌从云南省腾冲县腊幸温泉附近采集PH 4 左右的酸性土样，在保鲜袋中常温保存。在实验室中，将上述土样放入烧杯中，加5倍双蒸 水，混勻后在100°C保温1小时。取少量上述混合液涂布以普鲁兰为唯一碳源的固体培养 基平板，37°C培养三天，共获得308个菌落，显微镜观察确定其中187株为杆状细菌。将上 述杆状细菌的菌落分别划线分离后以单菌落接种发酵培养基，摇瓶培养2天后取上清液检 测普鲁兰酶酶活，其中3株菌培养液中检测到明显的普鲁兰酶活性。分别进行细菌的16s rDNA基因序列分析，其中编号为042的细菌的16s rDNA基因部分序列为SEQ ID NO :3，利 用BLAST软件将SEQ ID NO :3与美国国家生物技术信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov，简称 NCBI)收录的基因序列进行比对，结果显示SEQID NO 3与腊状芽孢杆菌PCSBB的16s rDNA 基因序列(NCBI登录号HM449698. 1)最为接近，相似性为96%。根据以上实验结果，042细 菌应属于芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp. 042。Bacillus sp. 042被用于下一步实验。实施例2 =Bacillus sp. 042普鲁兰酶基因的克隆第一步获得Bacillus sp. 042普鲁兰酶基因的部分核苷酸序列根据细菌普鲁兰酶基因保守区设计一对简并引物5，-TGGGG (A, T, C, G) TA (T, C)AA(T, C)CC_3，(SEQ ID NO 4)5，-GG(A, G) TT (A, G) TA(A, T, G, C) CCCCA-3' (SEQ ID NO 5)以Bacillus sp. 042染色体DNA为模板进行PCR扩增获得一 0. 8kb左右的扩增片 段。将扩增产物纯化后与克隆载体PMD18-T Simple连接，获得的重组质粒进行序列分析， 结果显示所获PCR产物全长860bp，其核苷酸序列与Bacillus acidopullulyticus来源的 普鲁兰酶基因的部分序列相似性高达50%，这一结果显示，上述PCR获得的片段是普鲁兰 酶编码基因的一部分。第二步获得Bacillus sp. 042普鲁兰酶编码基因的完整序列根据第一步所获Bacillus sp. 042普鲁兰酶编码基因部分片段核苷酸序列设计一 对反向PCR引物5，-CTGAAAGTGGCATTAAACAG-3，(SEQ ID NO 6)5，-TAATTTATCAAACTCTTCGC-3‘ (SEQ ID NO 7)利用反向PCR技术克隆Bacillus sp. 042普鲁兰酶基因完整编码区。取Bacillus sp. 042染色体DNA约10 μ g，溶于100 μ L双蒸水中。在上述DNA溶 液中加入IlyL酶切缓冲液和IyL限制性内切酶Hind III，37°C酶切2小时后用柱式DNA 片段回收试剂盒回收经酶切的DNA片段。取上述回收的含DNA片段的溶液44 μ L，加入连接 反应缓冲液5 μ L，连接酶1 μ L，16°C连接过夜。以上述连接产物为模板，利用反向PCR引物进行PCR扩增，电泳结果显示，反向PCR获得一 3kb左右的扩增片段，将上述扩增片段分离 后与克隆载体PMD-18T Simple连接，重组质粒进行序列分析，并将所获序列与已经获得序 列的片段比对，获得普鲁兰酶编码基因的完整序列，即SEQ ID N0:1。第三步获得Bacillus sp. 042普鲁兰酶编码基因根据SEQ ID NO :1序列再设计一对引物以扩增Bacillus sp. 042普鲁兰酶编码区 完整基因，引物序列如下5，-GTGCAAATTACAAAAAAATTAAT-3，(SEQ ID NO 8)5' -TTATTTAATCGGTTTCTCTGTT-3，(SEQ ID NO 9)以Bacillus sp. 042染色体DNA为模板，PCR扩增获得一 2. 5kb左右的DNA片段， 扩增片段纯化后与克隆载体PMD18-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素 的LB平板上筛选转化子。从获得的转化子中提取质粒测序，获得普鲁兰酶编码基因编码区 完整序列，该基因命名为PU1A042，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1，其编码的普鲁兰酶原酶的 氨基酸序列为SEQ ID NO :2。基因pulA042与克隆载体pMD18-T Simple组成的重组质粒 PMD-PA的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pMD-PA，已保藏在中国典型培养物保藏中 心，保藏编号 CCTCC NO :M 2010200。实施例3 普鲁兰酶基因的表达及重组酶功能分析以含有pulA042基因的重组质粒pMD_PA为模板，用引物5 ‘ -AATGAATCGTTTCAAATTCAAAAACAAC-3 ‘ (SEQ ID NO 10)5’-AATAAGCTTTTATTTAATCGGTTTCTCTG-3，(SEQ ID NO 11)进行PCR扩增，获得pulA042基因的成熟肽编码区，用限制性核酸内切酶EcoRI和 Hind III酶切后与经相同酶切的大肠杆菌表达载体pET28a连接，构建重组质粒pET-PA， 重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组大肠杆菌BL21 (DE3) /pET-PA。重组大肠杆菌 BL21 (DE3) /pET-PA在LB液体培养基中摇瓶培养至培养液浑浊度为OD6tltl = 0. 8时加入IPTG 至终浓度为0. 5mg/mL，继续培养4小时后培养液用超声波处理破碎细胞。作为对照，用空质 粒pET28a转化大肠杆菌BL21 (DE3)获得的重组菌BL21 (DE3) /pET28a也同样培养并进行细 胞破碎。对细胞破碎液检测普鲁兰酶活力，结果显示重组菌BL21 (DE3) /pET-PA的细胞破碎 液有明显的普鲁兰酶活力，酶活约为6U/mL。而重组菌BL21 (DE3)/pET28a的细胞破碎液普 鲁兰酶活力为0。可见，基因pulA042成熟肽编码基因的表达产物具有普鲁兰降解活性。为进一步验证pulA042成熟肽编码基因表达产物的功能，将上一节中制备的重组 菌BL21 (DE3)/pET-PA及BL21 (DE3)/pET28a的细胞破碎液分别与红色普鲁兰、糯米淀粉、玉 米淀粉进行反应。细胞破碎液与红色普鲁兰的反应结果如图1所示。取0. ImL 重组菌 BL21 (DE3)/pET-PA 及 BL21 (DE3)/pET28a 的细胞破碎液分别与 0. 3mL 0. 5%的红色普鲁兰溶液混合，37°C反应约1小时后加入ImL酒精，混勻后8，OOOr/ min离心lOmin。由于红色普鲁兰为高分子化合物，与酒精混合生成沉淀。如果红色普鲁兰 被降解，则形成小分子，与酒精混合不会形成沉淀。由图1中A可见，BL21(DE3)/pET28a破 碎液与红色普鲁兰的反应液经酒精沉淀后上清液为无色，红色普鲁兰沉淀集中在离心管底 部，显示红色普鲁兰没有被分解。图1中B可见，BL21(DE3)/pET-PA的破碎液与红色普鲁 兰的反应液经酒精沉淀和离心后上清液仍为红色，而离心管底部的沉淀很少，显示大部分红色普鲁兰被降解为小分子。由图1可见，PU1A042成熟肽编码基因表达产物具有普鲁兰 降解能力。糯米淀粉是一类支链含量较高的淀粉，由于支链含量高，糯米淀粉与碘反应显紫 红色而不是以直链为主的淀粉的深蓝色。糯米淀粉与专一分解淀粉中α-1，6糖苷键的酶 接触，其支链将被切断，再与碘混合，反应液表现为深蓝色。细胞破碎液与糯米淀粉的反应 结果如图2所示。将0. 2mL 重组菌 BL21 (DE3)/pET-PA 及 BL21 (DE3)/pET28a 的细胞破碎液分别与 ImL 0.3%的糯米淀粉溶液混合，37°C反应1小时后加入等体积碘溶液，混合。由图2中 A可见BL21 (DE3)/pET-PA破碎液与糯米淀粉的混合液在反应后与碘反应的颜色由紫红 色转变为深蓝色，显示糯米淀粉的支链被切断，淀粉的支链含量下降。由图2中B可见 BL21 (DE3) /pET28a破碎液与糯米淀粉在反应后与碘反应的颜色仍为紫红色，显示糯米淀 粉的支链没有被切断。由图2可见，pulA042成熟肽编码基因表达产物具有分解支链淀粉 α-1，6糖苷键的功能。玉米淀粉是一类以直链为主的淀粉，与碘反应显深蓝色。玉米淀粉的α -1，4糖苷 键被分解，形成糊精，再与碘反应则表现为红色或紫红色。细胞破碎液与玉米淀粉的反应结 果如图3所示。将0. 2mL 重组菌 BL21 (DE3)/pET-PA 及 BL21 (DE3)/pET28a 的细胞破碎液分别与 ImL 0.3%的玉米淀粉溶液混合，37°C反应约6小时后加入等体积碘溶液，混合。由图3 可见重组菌BL21 (DE3)/pET28a及BL21 (DE3)/pET-PA的破碎液与玉米淀粉的混合液在 反应后与碘反应的颜色同样都为深蓝色，显示玉米淀粉没有发生明显变化。由图3可见， PU1A042成熟肽编码基因表达产物不具有分解α _1，4糖苷键的功能。综合上述实验可见，pulA042成熟肽编码基因表达产物具有分解普鲁兰和支链淀 粉中α-1，6糖苷键的能力，不分解α-1，4糖苷键，符合I型普鲁兰酶的特点。这一类普鲁 兰酶在淀粉加工中可用于淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷键的分解。本实施例采用大肠杆 菌表达pulA042成熟肽编码基因，但pa042基因的表达方式显然不局限于这一种。
权利要求
一种来源于芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.042的胞外普鲁兰酶编码基因，命名为pulA042，其核苷酸序列为SEQ ID NO1。
2.权利要求1所述基因pulA042编码的普鲁兰酶原酶的氨基酸序列为SEQIDNO :2。
3.权利要求1所述基因pulA042与克隆载体pMD18-TSimple组成的重组质粒pMD_PA 的大肠杆菌转化子，分类命名为JM109/pMD-PA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编 号 CCTCC NO :M 2010200。
4.权利要求1所述基因pulA042的应用，其特征在于利用普鲁兰酶编码基因pulA042构建的重组微生物表达产生的重组普鲁兰酶具有分 解普鲁兰的能力，能降解淀粉中α-1，6糖苷键，不降解α_1，4糖苷键，是一种I型普鲁兰 酶，利用基因PU1A042生产的重组普鲁兰酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中的 α-1，6糖苷键。
全文摘要
一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用，属于微生物、酶工程技术领域。本发明筛选到一株具有普鲁兰分解能力的芽孢杆菌Bacillus sp.042，利用反向PCR技术克隆了普鲁兰酶编码基因pulA042编码区完整序列，序列分析显示该基因编码区全长2571碱基，编码一856个氨基酸残基的多肽链，多肽链N端32个氨基酸残基组成一典型的信号肽，因此基因pulA042编码一种胞外普鲁兰酶。Bacillus sp.042普鲁兰酶基因pulA042的表达产物具有分解普鲁兰和红色普鲁兰的活性，能降解淀粉中α-1，6糖苷键，不降解α-1，4糖苷键，是一种I型普鲁兰酶。利用基因pulA042生产的重组酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷键。
文档编号C12N1/21GK101974543SQ20101025628
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者沈微, 王正祥 申请人:江南大学