专利名称：激发水稻产生抗病反应的avrXa23蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种激发水稻产生抗病反应的avrXa23蛋白及其 编码基因(病原菌无毒基因)，具体涉及一种从水稻白叶枯病原菌中分离到的与水稻寄主 抗病基因互作的无毒基因。
背景技术：
水稻是我国的重要粮食作物，约60%的人口以稻米为主食，水稻生产的可持续发 展直接关系到我国的粮食安全。水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是世界水稻生产中 的主要病害之一，最早于1884年在日本福网地区发现，从50年代开始，发病范围不断扩大， 目前白叶枯病的发生范围已遍及世界各水稻产区。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞 杆菌水稻变种(Xannthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起的一种维管束病害，一般情况 下可以造成水稻减产20% 30%，严重时甚至绝收。实践证明，利用水稻品种的抗病性是防治水稻白叶枯病最经济和有效的途径，所 以自20世纪60年代，发掘和利用抗白叶枯新基因一直是国内外研究的热点之一。目前已 报道的水稻抗白叶枯病基因达36个，但它们大多数抗谱狭窄或抗性持久性差，在生产上被 有效利用的只有Xa3、Xa4、Xa7和Xa21等少数几个。由于病原菌致病性的变异，少数抗白叶 枯病基因的长期广泛利用总是面临抗性丧失的风险。为了长期控制水稻白叶枯病的危害， 目前国内外一般采取两个策略一是从野生稻等水稻资源中寻找具育种利用价值的抗白叶 枯病新基因，另一个是深入研究植物抗病的分子机理，以期开发出可使更多抗病基因持久 利用的新途径。随着分子生物学的飞速发展，特别是近年对多种植物病原菌及其寄主植物基因 组的测序以及对多种突变体的分析，大大促进了人类关于植物免疫系统的认识。目前已 知植物的免疫系统总体上包括两道防线第一道被称为病原相关分子模式(Pathogen/ microbe-associated molecular patterns, PAMPs/MAMPs)诱发免疫(PAMPs triggered immunity, PTI)，即植物通过其细胞表面的模式识别受体(Patternrecognition receptors, PRRs)对病原菌的PAMPs分子的准确感知并防卫；第二道防线被称为病原菌效 应子诱发免疫(Effector triggered immunity, ΕΤΙ)，这是由于一些病原菌能够通过产生 效应子(Effectors)来抑制PTI，从而突破植物的第一道防线，于是植物就通过新的分子受 体(例如R基因编码的NBS-LRR蛋白质)来侦察这些效应子并启动防卫反应。通常讲的基 因对基因抗性就属于第二道防卫机制的范畴。几亿年来，病原菌的袭击和植物的防卫交替 进行，从而促进了病原菌和植物基因组的共进化。水稻白叶枯病是研究重要粮食作物与病原细菌互作的理想系统，已成为国际上的 一个研究热点，并推进了关于寄主与病原互作分子机理的研究。国内外已先后克隆了水 稻的抗病(R)基因Xal、xa5、xal3、Xa21、Xa23、Xa26和Xa27等和白叶枯病菌的无毒基因 avrXa3、avrxa5、avrXa7、avrXalO、avrXa21 (Ax21)禾口 avrXa27。业已证明:avrXa21 (Ax21) 编码一个194个氨基酸的蛋白，是黄单胞菌的一个PAMP分子，因而证明Xa21是水稻的一个模式识别受体PRR，其抗性反应属于植物抗病的第一道防线。而avrXa3、avrxa5, avrXa7、avrXalO和avrXa27均属于avrBs3基因家族成员，它们编码转录因子类效应子 (Transcription activator-like effectors, TAL effectors)，这种效应子蛋白含有细胞 核定位序列(NLS)和基因转录激活区(AD)，它们通过病原菌III型分泌系统(TTS system) 注入寄主植物细胞，然后由核质转运蛋白importina和importini 协助输入细胞核并调 控寄主的基因表达，所激发的抗性反应属于植物抗病的第二道防线。过去的研究还揭示，TAL effector效应子蛋白中含有不同数目的由34个氨基酸 组成的重复区(例如AvrBs3含有17. 5个重复单元)，每一个重复单元的34个氨基酸几乎 完全相同，只是其中的第12和13个氨基酸是高度可变的。Boch等和Moscou等研究发现， AvrBs3的每一个重复单元识别一个特异的DNA碱基，当AvrBs3的每一个重复类型(每个重 复单元的第12和第13氨基酸)对应到寄主被调控基因启动子的UPA box中去时，特定的 重复类型与目标DNA上的特异碱基相对应。通过分析许多TAL effector效应子蛋白重复 类型以及受其诱导的基因启动子区的UPA box的对应关系，构建了 TAL effectors不同重 复类型识别目标DNA特异性的分子模型，从而揭示了 TAL effector蛋白特异性识别寄主基 因DNA的分子密码。尽管近年关于植物抗病分子生物学研究的进展很大，但由于植物免疫反应非常复 杂，目前人类关于寄主植物与病原菌在分子水平上互作的认识仍然非常有限。其中关于PTI 和ETI分子互作的结果主要来自拟南芥与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)互作系 统，目前急需有更多的来自其它病原菌_寄主植物互作系统研究结果，这样才更有利于揭 示病原菌-寄主植物分子互作的全景。具体到黄单胞杆菌TAL effectors与寄主植物R-基 因的分子互作研究，虽然第一个编码TAL effector的基因avrBs3早在20年前就被克隆， 但其结果主要来自辣椒与X. campegtris pv. vesicatoria的互作系统，其普遍性尚需要更 多研究结果验证，而且TAL Effector蛋白与靶基因DNA碱基的识别过程仍然是个未解之 谜。可以预计，在未来10年内，关于寄主植物与病原菌在分子水平上的识别与互作，将仍然 是国际上的研究热点之一，并有可能通过揭示植物抗病的分子机理，开发出防治作物病害 的新技术。水稻黄单胞杆菌PX099a是迄今发现的致病性最强、致病谱最广的菌株，除对几个 抗性基因品种如 IRBB5(含有抗性基因 xa5)、IRBBlO(XalO)、IRBB21 (Xa21)、CBB23 (Xa23) 外，几乎对所有的水稻品种致病。发明人所在的实验室曾从我国普通野生稻中鉴定发掘出 一个对白叶枯病广谱高抗的显性基因Xa23，它能抵抗中国、菲律宾和日本所有的代表菌系。 对来自越南、韩国、孟加拉等国的能使Xa4、Xa21致病的20多个菌株，Xa23均表现为高抗，至 今尚未发现能克服Xa23抗性的天然菌株。如果找到能激发Xa23基因表达的蛋白及其编码 基因，将为水稻抗白叶枯病抗病分子育种提供基因资源，有利于防治水稻白叶枯病的危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种激发水稻产生抗病反应的avrXa23蛋白及其编码基因。本发明提供的蛋白质，来源于水稻黄单胞杆菌，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激发水稻产生抗病反应相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激发水稻产生抗病反应相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码激发水稻产生抗病反应相关蛋白的 DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码激发水稻产生抗病反应相 关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pHMl载体 的多克隆位点插入权利要求2或3所述基因得到的重组Cosmid质粒。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为包含于保藏 号为CGMCC No. 4049的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pHMl/L-2中的重组Cosmid质粒 pHMl/Lo
7.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) pHMl/L-2，它的保藏号为 CGMCC No. 4049。
全文摘要
本发明公开了一种激发水稻产生抗病反应的avrXa23蛋白及其编码基因。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激发水稻产生抗病反应相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明获得的avrXa23蛋白的编码基因可作为水稻抗白叶枯病抗病育种的基因资源，将基因导入水稻白叶枯病菌XM81菌株后，可使含Xa23抗病基因的水稻产生抗病性反应，使白叶枯病菌难以有效侵染水稻。本发明有助于研究植物与病原菌之间典型的特异性互作关系，有助于阐明白叶枯病菌的广谱致病性机理。
文档编号C12N5/10GK101974079SQ20101025633
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者徐安毕, 杨兵, 樊颖伦, 王春连, 赵开军, 高英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所