专利名称：一种可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工程菌及制备方法
技术领域：
本发明涉及啤酒酿造技术领域，尤其涉及一种可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工 程菌及其制备方法和应用。
背景技术：
酵母分泌的蛋白酶以及对泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴 趣，尤其在国内纯生啤酒超高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A(PrA)的活性问题 更引起人们重视。纯生啤酒由于其口味、营养等方面的优点已越来越受到消费者的青睐，啤酒泡沫 稳定性是衡量啤酒质量的重要指标，但是目前纯生啤酒在贮存过程中，存在泡沫稳定性下 降等问题，原因主要是由于纯生啤酒中残留的酵母蛋白酶A对啤酒泡沫蛋白的降解作用所 致。目前主要通过调整发酵工艺来改善啤酒泡沫性能，这些手段包括使用糖蛋白含量 高的小麦辅料；调整制麦、糖化、麦汁过滤与煮沸工艺；控制发酵温度与贮酒条件；适当添 加泡沫稳定剂或添加酵母PrA抑制剂。采取这些手段所要求的工艺条件较复杂，而添加剂 又存在安全隐患，不为消费者接受，因此都不能从根本上提高啤酒泡沫性能。β-葡聚糖的消极影响也是影响啤酒品质的重要因素，虽然制麦过程中麦芽会形 成专一性降解β-葡聚糖的内β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但这种内源性β-葡聚糖酶热稳定 性差，其最适温度为40-45°C，55°C时即开始失活，在糖化温度(65°C)下5min酶活性仅存 1%。而且我国大麦与国外优质大麦相比，β-葡聚糖含量高且内源性β-葡聚糖酶水平低， β-葡聚糖的消极作用更明显。目前啤酒生产工业中主要通过培育低β-葡聚糖的大麦品种以及添加耐高温的 外源性葡聚糖酶来消除或降低葡聚糖的影响。但即使培育出低葡聚糖的大麦 品种作原料，在啤酒酿造时也仍然要添加外源性β “葡聚糖酶，因此并没有从根本上简化 啤酒生产的操作工艺。
发明内容
本发明提供了一种啤酒酵母工程菌，利用该菌株进行啤酒发酵解决了传统酵母发 酵制得的啤酒残留蛋白酶A对啤酒泡沫性能和高含量β _葡聚糖对啤酒过滤和稳定性带来 不利影响的问题。一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒 酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，所述的重组序列包括β -葡 聚糖酶基因表达单元。所述的β -葡聚糖酶基因表达单元由依次连接的3-磷酸甘油酸激酶基因启动子 序列(PGKlp, Gebank登录号CAA42329)、信息素α -因子分泌信号序列(MFa ls, Gebank登 录号ΑΑΑ18405)、β -葡聚糖酶基因序列(bglS，SEQ ID NO. 3)和乙醇脱氢酶基因终止子序列(ADH1T，Gebank 登录号 CAY86205)组成。所述的重组序列包括来自质粒PUG6的卡拉霉素抗性基因序列(KanMX)。所述的选用来自酿酒酵母的PGKl强启动子具有增强表达外源酶基因的特性，所 选用的来自酿酒酵母的信息素α-因子分泌信号序列具有较好的引导外源酶基因在酵母 细胞的分泌和表达的能力，而所选用的来自酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因终止子序列具有优 异的准确转录和翻译功能，上述的表达单元与酵母基因组的同源性可在一定程度上增加同 源重组整合的机率，有助于ΡΕΡ4基因的替换和β-葡聚糖酶基因的整合。而所采用的来自 质粒PUG6的卡拉霉素抗性基因不仅具有作为筛选同源重组子的筛选标记，而且在分子重 组酵母传代繁殖过程中具有自动丢失功能，以获得无抗性基因的分子重组酵母菌。所述的蛋白酶A被替换序列是从第686个碱基到第1987个碱基的序列。本发明将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PRAD保藏在位于北京市朝阳 区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏日期为2009年04月14日，保藏号为CGMCC No. 3010。上述保藏菌株的主要生理生化特征细胞为椭圆形，短轴5 7微米，长轴7 9 微米，短长轴之比为1 1.2 1.3，细胞呈单个或成对排列，单个出芽为主，极少形成芽 簇；菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。生长最适PH为5. 5。最适生长温 度 25-30 0C ο本发明提供了一种上述啤酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤在重组序列 两端连接同源臂序列，转化到感受态出发菌株中进行同源重组得到。连接重组序列上游的同源臂序列如SEQ NO. 1所示。连接重组序列下游的同源臂序列如SEQN0. 2所示。本发明又提供了上述啤酒酵母工程菌在制备纯生啤酒中的应用。本发明啤酒酵母工程菌通过将外源枯草芽孢杆菌β -葡聚糖酶基因表达单元通 过同源重组技术将工业酿酒酵母染色体上ΡΕΡ4基因的部分序列或全部序列替换，蛋白酶A 活性显著降低，而能稳定表达葡聚糖酶。由于同源重组效率和亲缘性差异较大的外源 基因在酿酒酵母中重组表达，因此给同源重组替换带来的是重组效率问题，而本发明设计 的来自酿酒酵母的信号肽序列、强启动子序列和终止子序列可以高效实现外源β-葡聚糖 酶基因序列在酿酒酵母中的重组表达。通过遗传稳定性和中试发酵试验证明，该构建的啤 酒酵母工程菌不仅遗传稳定性良好，而且具有优于出发菌株的啤酒酿造品质，如啤酒泡沫 稳定性提高，β “葡聚糖降解率提高，啤酒过滤速度改善，而且生理性能和生化特性并无明 显差异。
图1为片断PGKlP、MFa Is在质粒pUC18中的克隆，形成质粒pUC18_PM示意图；图2为片断bglS、ADHlT在质粒pUC18中的克隆，形成质粒pUC18-BT示意图；图3为bglS基因表达单元PGKlp-MF a ls_bglS_ADHlT的形成示意图；图4为bglS基因表达单元与KanMX连接形成质粒pUC18_KPMBT示意图；图5为重组质粒YEPlac 181-KPMBT PCR的扩增鉴定凝胶电泳图谱；图6为重组质粒YEPlac 181-KPMBT的双酶切鉴定凝胶电泳图谱，泳道1为SmaI+EcoR I双酶切结果，泳道2为BamH I+EcoR I双酶切结果；图7为PCR扩增到的用来转化并替换PEP4的片断的凝胶电泳图谱(3732bp，1-8 为平行扩增)；图8为重组酿酒酵母菌PRAD的PCR鉴定凝胶电泳图谱(1. PEP4-Pl+KanMX-P2产 物；2. bglS-Pl+PEP4-P2 产物；3· PEP4-P1+PEP4-P2 产物)；图9为重组酿酒酵母菌PRAD的遗传稳定性PCR检测凝胶电泳图谱，泳道1_4模板 分别为重组酿酒酵母RPPD、WZ65以及第十代重组酿酒酵母PRAD。
具体实施例方式1、出发菌株选用工业酿酒酵母WZ65(温州英博双鹿啤酒有限公司)作为出发菌株，经过刚果 红-β -葡聚糖选择性平板检验和液体发酵监测，证明该酿酒酵母不表达β “葡聚糖酶活， 同时该工业酵母经过染色体分离和孢子分离试验，证明其为二倍体。2、bglS同源重组表达质粒载体Y印Iac 181-KPMBT的构建及其酶切验证2. 1、同源重组各表达单元的克隆获得(l)bglS基因的获得及其验证 ! . 古胃 $ 包 ff 胃(B. Subtilis) ZJF-1A5 (Construction ofrecombinantindustrial Saccharomyces cerevisiae strain with bglS gene insertion into PEP41ocus by homologous recombination. Journal of Zhejiang University Science B，2008，9 (7) 527-535)的基因组为模板，设计下列引物 Agls-P1 =GG AAGCTTCGGCTCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG,引入 HindIII 位；bgls_P2 GGGGTACCGCATTATTTTTT TGTATAGCGCACCCJIA KpnI位点；PCR扩增该枯草芽孢杆菌中bglS基因，该菌株中的bglS 基因总长度为729bp，如SEQ ID N0. 3所示，其中前84bp为其信号肽编码序列，信号肽断裂 位点发生在丙氨酸(28)处，本实施例删掉编码β _葡聚糖酶信号肽前26个氨基酸的78bp 碱基，最终序列如SEQ ID N0. 4所示，该序列也可人工合成。PCR扩增β-葡聚糖酶基因序列，PCR反应条件为94°C预变性5min，然后 940C 45s, 500C 45s，72°C lmin,30循环；最后72°C延伸lOmin。的琼脂糖电泳显示扩增 得到了 650bp左右基因片断，与设计结果相符。(2) PGKlp的扩增及其获得提取工业酿酒酵母WZ65基因组为模板，设计以下引物对PGK Ip-P 1 :CC/GGATCC/CATATG/CTTCAACTCAAGACGCACAG 上游加 BamH I 和 NdeI ；PGK 1P-P2 :GG/TCTAGA/TGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG 下游加 Xba I。扩增PGKlp, PCR 条件为94°C变性 5min ；94°C 45s, 50°C 45s, 72°C lmin, 30 循环； 最后72°C延伸lOmin。大小与预期结果相符(778bp)。 (3) MF α Is的扩增及其获得提取酿酒酵母WZ65基因组为模板，设计下列引物MF α Is-Pl :G/TCTAGA/AGAATGAGATTTCCTTC，引入 XbaI 位点；MF α 1 S_P2 GGCC/AAGCTT/CAGCCTCTCTTTTATC 引入 HindIII 位点；扩增MF α Is 片断，扩增条件为 94°C变性 5min ；94°C 45s，50°C 45s，72°C 30s，30 循环；最后72°C延伸lOmin。大小为273bp，电泳结果显示跟设计相符。(4) ADHItW扩增及其获得以工业酿酒酵母WZ65的基因组为模板，设计引物对ADHIt-PI :GG/GGTACC/GCGAATTTCTTATG，引入 Kpn I 位点；ADH 1T-P2 :GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG，引入 EcoR I 位点；扩增ADHIt 终止子片断，条件为94°C变性 5min ；94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30sec, 30循环；最后72°C延伸lOmin。电泳显示扩增得到250bp左右的基因片断，与理论值相符。
(5) KanMX的扩增及其获得以质粒pUG6为模板，设计引物对KanMX-Pl GGGGATCCCAGCTGAAGCTTCGTACGC,弓 I 入酶切位点 BamHI ；KanMX~P2 :CCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG,引入酶切位点 Sma I。扩增KanMX 片断，条件为94°C变性 5min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 90s, 30 循环； 最后72°C延伸IOmin02. 2、同源重组表达单元的构建及其验证以质粒pUC18为克隆载体，按照pUC18以及设计的引物上的酶切位点，将各片断 分步双酶切后连接进行克隆，最终在PUC18上连接成bgls基因在酿酒酵母中的表达单元 PGKlp-MF α ls_bglS_ADHlT。每一次连接的程序为酶切IOh后凝胶电泳回收；另一酶酶切IOh后凝胶电泳回收；按载体片断= 1 5连接过夜后转化大肠杆菌感受态；涂加氨苄的LB平板后37°C培养16h;挑取平板上 生长出的菌落到5mL加氨苄的LB液体培养基，200rpm 37°C水浴振荡培养12h后提质粒；对 提取的质粒进行琼脂糖电泳比对大小，然后进行PCR及双酶切鉴定。(1)片断PGKlP、MFa Is在质粒pUC18中的克隆如图1所示，用BamH I和Xba I分步酶切质粒pUC18和片断PGKlp,连接形成质粒 pUC 18-P;对质粒pUC 18-P以及MF a Is进行Xba I和HindIII分步双酶切后连接形成质 粒 pUC18-PM。(2)片断bglS、ADHlT在质粒pUC18中的克隆如图2所示，HindIILKpn I分步双酶切质粒pUC18和片断bglS，连接形成质 粒pUC18-B ；Kpn I、EcoR I分步双酶切质粒pUC18_B和终止子片断ADH1T，连接形成质粒 PUC18-BT。(3) bglS 基因表达单元 PGKlp-MF α ls-bglS_ADHlT 的形成如图3所示，Nde I、HindIII双切质粒pUC18_PM后回收小片断，跟Nde I,HindIII 双切PUC18-BT后的大片断相连，形成质粒pUC18-PMBTl，质粒含方向一致的表达单元片断 PGKlp-MF α ls_bglS_ADHlT。(4) bglS基因表达单元与KanMX的连接以构建的重组质粒pUC18-PMBTl为模板，设计引物(EX-PI、EX-P2，分别位于重组 质粒PUC18-PMBT1中的bglS基因表达单元的PGKl启动子上游和ADHl终止子下游)EX-Pl :CCCCCGGGCTTCAACTCAAGACGCACAG，引入酶切位点 Sma I ；EX-P2 :GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG，引入酶切位点 EcoR I ；
扩增上下游分别带有Sma I和EcoR I位点的bglS表达单元片断，经Sma I和EcoR I双酶切后与经同样双酶切的质粒PUC18连接，形成质粒pUC 18-PMBT.以质粒pUG6为模板，设计引物KanMX-Pl GGGGATCCCAGCTGAAGCTTCGTACGC,弓 I 入酶切位点 BamHI ；KanMX~P2 :CCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG,引入酶切位点 Sma I，扩增两端带有IoxP位点的KanMX片断。经BamHI和Sma I双酶切后与同样双酶 切(BamHI 和 SmaI)的质粒 PUC18-PMBT 相连，形成质粒 pUC 18-KPMBT。(5)bglS基因酿酒酵母表达载体的形成将重组质粒pUC 18-KPMBT 中的 KanMX-PGKlp-MF α ls_bglS_ADHlT 片段用内切酶 BamHI和EcoR I切下回收，然后与经同样双酶切的穿梭载体YEPlacl81相连，形成bglS基 因在酿酒酵母中的表达载体YEPlacl81-KPMBT。2. 3重组表达质粒载体YEPlac 181-KPMBT的PCR、酶切和酶表达验证(I)PCR 验证以质粒 YEPIac 181-KPMBT 为模板，分别用 KanMX-Pl+KanMX-P2、 PGK1p-P1+ADH1t-P2、KanMX-Pl+ADHlT_P2 进行 PCR 扩增 KanMX、bglS 表达单元、KanMX+bglS 表达单元，结果如图5所示(理论值分别为1613、1976、3589bp)。(2)双酶切验证分别以Sma I+EcoR I、BamH I+EcoR I 对重组质粒 YEPlacl81_KPMBT 进行双酶切 鉴定。酶切鉴定结果如图6所示，理论值分别为1976+7355bp，3589+5726bp，酶切鉴定结果 与理论值相符。将构建好的重组质粒YEPlac 181-KPMBT送上海生物工程技术有限公司测 序，测序结果与设计一致。(3)表达单元的转化及其酶活验证提取重组质粒YEPlacl81_KPMBT，转化酿酒酵母，然后涂布含200 μ g/mL的YEPD平 板。60h后随机挑取生长出的酵母菌落进行保存，在原生长平板上缓慢倒入5mL琼脂-地衣 多糖，30°C放置3h后染色，在酵母菌落的周围观察到明显的透明圈，随即挑取重组酵母菌 在IOmL YEPD培养基中200r/min、30°C培养24h，然后按1/100的接种量转接于IOOmL新的 YEPD培养基中，相同条件培养，每隔8h取样测定酶活，培养的上清液为粗酶。结果显示，在 转接后很长的一段时间内测不到酶活，测得的较明显的酶活是在转接后的36h开始，然后 酶活迅速上升，60h时达到最高值最高，然后下降，72h后基本稳定。该步转化试验证明所构 建的表达单元正确的表达了枯草芽孢杆菌β -葡聚糖酶基因，并实现了正确的分泌表达， 为下一步同源重组替换蛋白酶A基因提供了准确的表达单元。3、同源重组表达单元替换酿酒酵母WZ65中ΡΕΡ4基因构建获得酿酒酵母工程菌株 PRAD及验证3. 1酿酒酵母PRAD的转化构建以构建获得的同源重组质粒pUC18-KPMBT为模板，用a、b引物(见表1)进行PCR 扩增，得到转化DNA片段。50 μ 1反应体系中，加1 μ lpUC18_KPMBT，四种dNTP各200 μ Μ, 引物各为0. 2μΜ，1. 2mM MgCl2,10XPCR缓冲液5 μ 1及2. 5U的Taq DNA聚合酶。反应条 件94°C始变性5min ；循环30个周期，每个周期为94°C变性40s，58°C退火lmin，72°C延伸 3min ；最后72°C终延伸IOmin0
表1基因替换以及重组菌株检测中所采用的引物
权利要求
一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，其特征在于所述的重组序列包括β 葡聚糖酶基因表达单元。
2.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的葡聚糖酶基因表 达单元由依次连接的3-磷酸甘油酸激酶基因启动子序列、信息素α-因子分泌信号序列、 β-葡聚糖酶基因序列和乙醇脱氢酶基因终止子序列组成。
3.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的重组序列包括卡拉霉 素抗性基因序列。
4.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的ΡΕΡ4基因被替换的部 分为第686个碱基到第1987个碱基的序列。
5.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于命名为酿酒酵母PRAD，保藏号 为 CGMCC No. 3010。
6.权利要求1 5任一所述的啤酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤在重组序 列两端连接同源臂序列，转化到感受态出发菌株中进行同源重组得到。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于连接重组序列上游的同源臂序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于连接重组序列下游的同源臂序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
9.权利要求1 5任一所述的啤酒酵母工程菌在制备纯生啤酒中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该酿酒酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，所述的重组序列包括β-葡聚糖酶基因表达单元。本发明啤酒酵母工程菌通过将外源β-葡聚糖酶基因表达单元通过同源重组技术将工业酿酒酵母染色体上PEP4基因的部分序列或全部序列替换，蛋白酶A活性显著降低，而能稳定表达β-葡聚糖酶。该构建的啤酒酵母工程菌不仅遗传稳定性良好，而且具有优于出发菌株的啤酒酿造品质，啤酒泡沫稳定性和β-葡聚糖降解率提高，啤酒过滤速度改善，而且生理性能和生化特性并无明显差异。
文档编号C12N1/19GK101955891SQ20101025793
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者何国庆, 张强, 阮晖, 陈启和 申请人:浙江大学