专利名称：一种利用RsTyrDC制备红景天甙的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用RsTyrDC制备红景天甙的方法。
背景技术：
高山红景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)又名库页红景天，是景天科 (Crassulaceae)红景天属(Rhodiola rosea L.)植物，为多年生草本或亚灌木，常具 肉质匍匐根状茎，是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景 天甙(salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，现代药理学研究结果表明红景天甙具 有明显的抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老等功效，对于航天、深 海、沙漠、高原、体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物，同时对高辐射从 业人员、微机使用频繁人员、强脑力劳动者、中老年人群具有积极的滋补保健作用。红 景天甙生物合成最后一步反应机制已经清楚，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶 (UDP-glucosyltransferase,UDPGT,UGTs)以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇为底物催化 合成红景天甙。而酪醇酪醇生物合成则有可能来源于两种不同的途径一是酪醇可能来源 于P-香豆酸的脱羧反应产物，而P-香豆酸来源于苯丙氨酸起始的苯丙烷代谢途径；另一 种可能是酪醇可能来源于4-羟基苯乙醛，而其来自于酪氨酸脱羧反应。有趣的是，苯丙氨 酸和酪氨酸又共同来源于一个前体化合物阿罗酸。由于酪醇分子属于典型的简单酚类化合 物，植物体内的大部分酚类化合物来源于苯丙烷类代谢途径，苯丙烷类代谢途径为酪醇的 生物合成提供了碳架结构非常相似的前体化合物来源。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用RsTyrDC制备红景天甙的方法。本发明提供的一种制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将RSTYRDC蛋白的编 码基因导入目的植物的外植体，得到转基因的愈伤组织；2)从所述转基因的愈伤组织中提 取红景天甙，得到红景天甙；所述RSTYRDC蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述序列2由507个氨基酸残基组成。所述RSTYRDC蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植体；所述RSTYRDC蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主根癌农杆菌得到的重 组根癌农杆菌；所述重组植物表达载体为将所述RSTYRDC蛋白的编码基因插入载体pBRin713的 BgLII和Spe I识别位点间得到的。将所述RSTYRDC蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织的 方法包括如下步骤用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体，再依次进行共培养、抑 菌培养、诱导培养、抗性筛选培养和继代抗性筛选培养。所述用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体的步骤中，所述侵染的时间为9分钟。所述外植体为叶盘。从叶片上通过打孔器打下来的小圆片即为叶盘，可用于转基因转染。所述共培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯，得到所述共培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述共培养所用的培养基 中的浓度为0. 15mg/L,所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培养所用的培养基中的浓度 为 0. 5mg/L ；所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、1-萘乙酸和头孢霉素，得到所述抑菌培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所述抑 菌培养所用的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述抑菌培养所用的培养基中 的浓度为0. lmg/L，所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述诱导培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述诱导培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述诱导培养所用的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述诱导培养所用的培 养基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为2. 5mg/L, 所述头孢霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述抗性筛选培养的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述抗性筛选培养的培 养基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为30mg/L， 所述头孢霉素在所述抗性筛选培养的培养基的浓度为500mg/L ；每IOOOml所述共培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加 入1.5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液和0.5ml 2，4-二氯苯氧乙酸丁酯母液 后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述共培养用的培养基；每IOOOml所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. Omie-苄氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、5. Oml头孢霉素母液后，蒸馏水定容至 1000ml，得到所述抑菌培养所用的培养基；每IOOOml所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. Oml 6-苄氨基嘌呤母液、0. Iml 1_萘乙酸母液、0. 25ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素 母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述诱导培养所用的培养基；每IOOOml所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. Oml 6-苄氨基嘌呤母液、0. Iml 1-萘乙酸母液、0. 3ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素 母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述抗性筛选培养的培养基；所述共培养的时间为3天，所述共培养的温度为25°C，所述共培养为连续光照；所述抑菌培养的时间为5天，所述抑菌培养的温度为25°C，所述抑菌培养为连续 光照；所述诱导培养的时间为3周，所述诱导培养的温度为25°C，所述诱导培养为连续 光照；
所述抗性筛选培养的时间为10周，所述抗性筛选培养的温度为25°C，所述抗性筛 选培养为连续光照。所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下I和II所示步骤进行培养I 在连续光照、25°C，在如下培养基中继代3次培养，I所用的培养基按照如下方 法配制向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到I所用的 培养基；所述6-苄氨基嘌呤在I所用的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在I所 用的培养基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在I所用的培养基中的浓度为20mg/L，所述 头孢霉素在I所用的培养基中的浓度为500mg/L ；II 在连续光照、25°C，在如下培养基中继代2次培养，II所用的培养基按照如下 方法配制向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到II所用 的培养基；所述6-苄氨基嘌呤在II所用的培养基中的浓度为1. Omg/L,所述1-萘乙酸在II 所用的培养基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在II所用的培养基中的浓度为10mg/L，所 述头孢霉素在II所用的培养基中的浓度为500mg/L。I IOOOml所用培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加入 1.0ml6-苄氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、0. 2ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素母液 后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述的I所用培养基；所述步骤I中，所述继代3次按照每 10-13天的间隔进行继代；II IOOOml所用培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加入 1. Omie-苄氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、1. Oml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素母液后， 蒸馏水定容至1000ml，得到所述的II所用培养基；所述步骤II中，所述继代2次按照每15 天的间隔进行继代。所述6-苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置称取50mg6_苄氨基嘌呤用IOmllM的 NaOH水溶液溶解后加水定容到50ml，得到所述6-苄氨基嘌呤母液；所述1-萘乙酸母液按照如下方法配置称取50mgl_萘乙酸用IOmllM的NaOH水 溶液溶解后加水定容50ml，得到所述1-萘乙酸母液；所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置称取20mg2，4_ 二氯苯氧乙 酸丁酯用15ml无水乙醇溶解后加水定容20ml，得到所述2，4_ 二氯苯氧乙酸丁酯母液；所述头孢霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg头孢霉素溶解于水中后，加水 定容到10ml，得到所述头孢霉素母液；所述潮霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg潮霉素溶解于水中后，加水定容 到10ml，得到所述潮霉素母液；所述RsTyrDC蛋白的编码基因为下述1)或2)或3)1)序列表中的序列1的自5，末端第69位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中的序列1的自5’末端第63位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中的序列1。上述序列1由1715个核苷酸组成，其OFR为序列1的自5，末端第69位到第1592 位核苷酸所示的DNA分子。所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，所述双子叶植物优选为景天科植 物，所述景天科植物优选为红景天属植物，所述红景天属植物尤其优选为高山红景天。
本发明的实验证明，将RsTyrDC基因置于植物高效表达载体pBRin713的35S启动 子+Ω增强子下游，通过农杆菌介导法转化高山红景天，获得的转基因高山红景天愈伤组 织中红景天甙含量较野生型对照提高倍4. 3倍。本发明内容为利用高山红景天转基因愈伤 组织系统过表达红景天甙生物合成途径关键酶一酪氨酸脱羧酶(RsTyrDC)提供了具有创 新性和实用性的相关技术方法及应用。
图1为总RNA的电泳结果
图2为RT-PCR扩增结果
图3为基因5，RACE结果
图4为全长cDNA的PCR扩增
图5为RsTyrDC蛋白的结构功能域分析
图6为pBSRsTyrDC表达载体的构建示意图
图7为pBSRsTyrDC表达载体的BgLII和Spe I双酶切鉴定
图8为pBSRsTyrDC表达载体的PCR鉴定
图9为潮霉素对叶片生长状态的影响
图10为RsTyrDC的高山红景天遗传转化过程(农杆菌介导法)
图11为部分转基因高山红景天愈伤组织的PCR检测结果
图12为部分转基因高山红景天愈伤组织的实时荧光PCR检测结果
图13为部分转基因高山红景天的实时荧光RT-PCR检测结果
图14为转基因高山红景天愈伤组织红景天甙含量测定
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、RsTyrDC基因分离用RACE法(rapid-amplification of cDNA ends)成功地从高山红景天组织分离 得到1个新的酪氨酸脱羧酶基因cDNA全序列，命名为RsTyrDC。具体过程如下1、总RNA的提取Trizol法提取高山红景天愈伤组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。2、高山红景天酪氨酸羧酶基因(RsTyrDC)3'端的分离以高山红景天愈伤组织总RNA为模板，以Qt (5，-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTC GAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘)为反转录引物，按照Promega反转录试剂盒说明书 进行cDNA第一链的合成。之后以反转录的cDNA第一链为模板，根据保守区设计合成的 Block T(5，-GAGTTCCAGCACTACCTCGAYGGNRTNGAR-3，)简并引物，与设计的巢式锚定引物 Q0(5‘ -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3‘)组合进行套式PCR扩增，获得一条大小约为770bp特异 条带(图2 :M, DL-2000Marker ；1，PCR扩增结果。)，预期大小与引物设计位置距其它相关 TyrDC基因3’端距离相符
将酶切与PCR鉴定正确的质粒送上海生工公司进行序列测定，对测定结果在NCBI 的GenBank库中进行BLAST P分析后发现，该结果与已注册的植物酪氨酸脱羧酶基因3’端 具有一定的同源性(44% -52% )，说明该序列确为高山红景天酪氨酸脱羧酶基因3’端，而 且是一个新基因。3、RsTyrDC基因5，端序列的克隆参照Invitrogen 5'RACE试剂盒说明书分离5，端序列。根据3，RACE获得的cDNA 序列5’末端设计合成3条5’ RACE实验巢式引物(Tyr5’ -1 :5’ -CGCTAGAGATTGGATTAGG-3’ ； Tyr5' -2 :5，-CACATGAAGCAGCAATCGAG-3，；Tyr5，-3 :5，-CGTTCATGCTGATCGAATCG-3)，经套式 PCR扩增后，在950bp处出现特异条带(图3 :M,DL2000marker ；1，PCR扩增结果。)，该条带 经回收、T载体连接、转化、鉴定、测序、分析测序结果后发现该序列与3’ RACE获得的cDNA 序列5’末端有一段重复序列，同时与其它植物TyrDC同源性较高，说明该序列是该cDNA的 5’端序列。4、RsTyrDC基因全长cDNA的克隆利用DNAman软件对分离的cDNA3’端序列和5’端序列测序结果进行电子合并， 得到全长1715bp的序列(序列表的序列1)。在该序列ORF两端设计全长引物(表1中的 TyrQC5，-l和TyrQC3，_l)，以反转录的cDNA第一链为模板，扩增出大小为1524bp的PCR产 物(图5所示M，DL2000marker ； 1，扩增的RsTyrDC基因全长cDNA片段)，将该PCR产物经 回收、T载体连接、转化、鉴定后测序，该PCR产物具有序列表中序列1的第63-1592位核苷 酸序列，将该PCR产物的基因命名为RsTyrDC，该基因的OFR为序列表中序列1的第69-1592 位核苷酸序列，该基因编码的蛋白命名为RsTyrDC，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。表1 RsTyrDC基因cDNA全长引物(酶切位点用于植物表达载体的构建) 5、RsTyrDC基因的生物信息学分析将获得的基因的全长cDNA序列通过NCBI的Bankit工具递交GenBank (序列接收 号DQ471943)。利用DNAman软件对获得的RsTyrDC基因的全长cDNA序列进行分析(序列 1)。所获得的RsTyrDCcDNA全长1715bp，其中包括1524bp完整的开放阅读框(open reading frame, ORF (序列1自5，末端第69-1592位核苷酸)，推测编码508个氨基酸的多肽，分子 量(MW)为56.88kDa，等电点(pi)值为6. 15 ；同时含有67bp的5，非转译区(5，UTR)和 123bp 3’非转译区(3’ UTR)以及多聚腺苷酸尾。5’ UTR区起始密码子前有1个终止密码 子，且与编码区读码框相吻合，说明实验所获得的cDNA是全长的。
6、RsTyrDC蛋白的结构功能域分析用BLAST 服务器(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)进行结构域分析(图 5)，结果表明RsTyrDC 508个氨基酸序列中含有完整的TyrDC特征性结构域。RSTyrDC基因可通过以上方法获得，也可人工合成。实施例2、转RsTyrDC高山红景天愈伤组织人工合成序列表中序列1所示⑶NA。UpBSRsTyrDC表达载体的构建以上述人工合成的CDNA为模板，用引物TyrQC5’ _1和TyrQC3’ _1进行PCR扩 增，得到的PCR产物用BgLII和Spe I酶切后得到的片段，插入到载体pBRin713 (Ma， L. Q. , Liu, B. Y. , Gao, D. Y. , Pang, Χ. B. , Lu, S. Y. , Yu, H. S. , Wang, H. , Yan, F. , Li, Ζ. Q. , Li , Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印.26，989-999 ；公众可从北京农学院获得。)载体的BgLII 和Spe I识别位点间，构建重组载体，将构建好重组载体经过转化、筛选后进行酶切和PCR 鉴定，用BgLII和Spe I双酶切鉴定，结果如图7 (M，DL15000+2000Marker ；1-2,阳性质 粒。)所示，从图中看出，得到约1.5Kb的DNA片段；用RsTyrDC基因特异引物TyrQC3，-1 和35S-UP引物(5，-TGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG-3，)为引物，以重组载体为模板进行 PCR, PCR鉴定结果如图8(M，DL2000 Marker ；1-8,阳性质粒。)所示，得到约1. 6Kb的DNA 片段；将酶切得到约1. 5Kb的DNA片段和PCR得到约1. 6Kb的DNA片段的重组载体命名为 PBSRsTyrDC，其构建过程如图6所示。将植物高效表达载体pBSRsTyrDC送去测序，结果为 该载体为在pBRin713的BgLII和Spe I识别位点间插入序列1自5，末端第69-1592位核 苷酸(RsTyrDC基因的OFR框)，进一步证明该载体构建正确。将构建好的表达载体pBSRsTyrDC通过冻融法导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (Ma, L. Q. , Liu, B. Y. , Gao, D. Y. , Pang, Χ. B. , Lu, S. Y. , Yu, H. S. , Wang, H. , Yan, F. , Li, Ζ. Q. , Li, Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosy!transferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印.26，989-999 ；公众可从北京农学院获得。)中，得到重组 菌，将该重组菌提取质粒后经过BgLII和Spe I双酶切鉴定，得到约1. 5Kb的DNA片段的重 组菌为阳性重组菌，命名为EHA105/pBSRsTyrDC。2、转RsTyrDC高山红景天愈伤组织的获得选择性标记抗性筛选是获得转基因植物材料的关键。如果筛选压力过高，会造成 转基因材料生长状态低下甚至死亡；反之则会出现大量的假阳性材料，为后续筛选工作增 加难度。本实验所采用的植物表达载体中含有潮霉素磷酸转移酶基因Hpt可分解培养基中 的潮霉素。不同浓度的潮霉素(Hyg)处理对高山红景天叶片外植体的影响见图9。当潮霉 素浓度为Omg/L时，外植体生长旺盛；潮霉素浓度为5mg/L时，外植体生长减慢，致死率达到 50. 17% ；潮霉素浓度为10mg/L时，致死率高达93. 0% ；潮霉素浓度为15mg/L时，叶片全部 死亡。从高山红景天叶片对潮霉素敏感性实验的结果看，当Hyg浓度达到10mg/L时，可完 全抑制从叶片诱导愈伤组织的形成。但如果外植体一开始就经历高压选择，可能导致已转 化细胞的死亡。所以，本实验确定转基因初期抗生素筛选浓度Hyg为5mg/L。为能获得阳性转基因抗性愈伤组织，在转基因初期潮霉素浓度为5mg/L获得大量生长状态良筛选，获得 理想的实验结果。将上述获得的EHA105/pBSRsTyrDC接种在固体培养基(YEB)上划线培养，于27°C 下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在50ml YEB液体培养基，于27 °C、120rpm\min，黑 暗下震荡培养，继代3次，待EHA105/pBSRsTyrDC的0D_为0. 5时用于侵染高山红景天 (Rhodiola sachalinensis A. Bor ；Ma, L. Q. , Liu, B. Y. , Gao, D. Y. , Pang, X. B. , Lu, S. Y., Yu, H. S. , Wang, H. , Yan, F. , Li, Ζ. Q. , Li, Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印· 26，989-999 ；公众可从北京农学院获得。) 的叶盘，侵染时间为9分钟。将农杆菌EHA105/pBSRsTyrDC侵染过的高山红景天叶盘置于共培养基上(图IOA 侵染过农杆菌的高山红景天叶盘置于共培养基上)，25°C光照条件下共培养3天后，转移到 只含有抑制农杆菌生长抗生素(头孢霉素Cef，500mg/L)的抑菌培养培养基上进行5天的 抑菌培养；将经过抑菌培养的外植体接到含有潮霉素Hyg2. 5mg/L、Cef500mg/L诱导培养培 养基上，25°C连续光照条件下，3周继代一次，进行诱导培养(图IOB转化叶盘在选择培养 基上产生愈伤)。待诱导培养获得的愈伤形成后，将一部分愈伤组织接到抗性筛选培养培 养基上，在高浓度潮霉素(30mg/L)条件下进行抗性筛选培养筛选转基因抗性愈伤组织(图 IOC愈伤置于高选择压培养基上)；取在抗性筛选培养培养基上成活的愈伤组织采取逐渐 降低潮霉素浓度的方式依次进行I和II所示的继代抗性筛选培养，具体为在潮霉素20mg/L 培养基上继代3次后，转入潮霉素10mg/L的培养基上继代保存培养，形成生长状态良好的 抗性愈伤组织(图IOD筛选出的抗性愈伤)，作为转RsTyrDC高山红景天愈伤组织进行分子 检测和指标测定。每IOOOml所述共培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加 入1.5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液和0.5ml 2，4-二氯苯氧乙酸丁酯母液 后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述共培养用的培养基；每1000ml所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. Omie-苄氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、5. Oml头孢霉素母液后，蒸馏水定容至 1000ml，得到所述抑菌培养所用的培养基；每1000ml所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. Oml 6-苄氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酶母液、0. 25ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素 母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述诱导培养所用的培养基；每1000ml所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. Oml 6-苄氨基嘌呤母液、0. Iml 1-萘乙酸母液、0. 3ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素 母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述抗性筛选培养的培养基；所述共培养的时间为3天，所述共培养的温度为25°C，所述共培养为连续光照；所述抑菌培养的时间为5天，所述抑菌培养的温度为25°C，所述抑菌培养为连续 光照；所述诱导培养的时间为2-3周，所述诱导培养的温度为25°C，所述诱导培养为连 续光照；
所述抗性筛选培养的时间为10周，所述抗性筛选培养的温度为25°C，所述抗性筛 选培养为连续光照；所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下I和II所示步骤进行培养I IOOOml所用培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加入 1. Omie-苄氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、0. 2ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素母液后， 蒸馏水定容至1000ml，得到所述的I所用培养基；培养时间为40d，继代3次，25°C，连续光照。II :1000ml所用培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加入1. 0ml6苄 氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、1. Oml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素母液后，蒸馏水定 容至1000ml，得到所述的II所用培养基；培养时间为30d，每15d继代1次，25°C，连续光照；所述6-苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置称取50mg6_苄氨基嘌呤用IOmllM的 NaOH水溶液溶解后加水定容到50ml，得到所述6-苄氨基嘌呤母液；所述1-萘乙酸母液按照如下方法配置称取50mgl_萘乙酸用IOml IM的NaOH水 溶液溶解后加水定容50ml，得到所述1-萘乙酸母液；所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置称取20mg2，4_ 二氯苯氧乙 酸丁酯用15ml无水乙醇溶解后加水定容20ml，得到所述2，4_ 二氯苯氧乙酸丁酯母液；所述头孢霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg头孢霉素溶解在水中后，加水 定容到10ml，得到所述头孢霉素母液；所述潮霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg潮霉素溶解在水中后，加水定容 到10ml，得到所述潮霉素母液；所述MS培养基的组成及配制方法如下表1为MS培养基母液
直接溶解定容表2为MS培养基配制方法(1000ml) 配制方法大量筒中先放置200ml左右的蒸馏水，将上述母液称量后加入大量筒 中，再加入400-500ml蒸馏水，加入30克蔗糖溶解后定容到1000ml，倒入三角瓶中。 用PH计测PH值到5. 80—5. 85。加入7—7. 5g琼脂后融化倒瓶灭菌。3、转RsTyrDC高山红景天愈伤组织的分子鉴定以上述步骤2中得到转RsTyrDC高山红景天愈伤组织(潮霉素阳性愈伤组织)为 材料，提取基因组DNA为模板，进行PCR检测。为了避免内源基因的干扰，PCR引物之一为 目标基因的3’引物(TyrQC3’ _1)，另一个引物为对应于CaMV 35S启动子上游的一段核苷 酸序列(35S-UP，5，-TGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG-3，)，该引物在野生型高山红景天基因 组上没有互补序列。图11为转化RsTyrDC的部分转基因愈伤组织的PCR检测结果(PCK 质粒PCARsTyrDC ；RCK 野生型；1_15 部分转RsTyrDC高山红景天愈伤组织。)，阳性对照用 质粒pBSRsTyrDC为模板。结果显示用引物TyrQC3，_l与35S-UP从转RsTyrDC高山红景天 愈伤组织中扩增得到的DNA片断与阳性对照(PCK)相同，为1. 6Kb左右，阴性对照(野生型 高山红景天，RCK)没有该扩增产物。在检测的25个转RsTyrDC高山红景天愈伤组织系中 PCR检测结果全部为阳性。说明高浓度潮霉素筛选的效率高。基于转基因材料在一段时间内与农杆菌共同生长，取一部分愈伤组织在诱导、筛 选、继代5个月实验过程中一直添加头孢霉素(Cef 500mg/L)获得脱菌转基因愈伤组织，另 一部分在检测前4周停止脱菌(停止添加头孢霉素Cef 500mg/L)获得停止脱菌转基因愈 伤组织，停止脱菌的材料培养过程中没有农杆菌的再生。提取脱菌转基因愈伤组织、停止 脱菌转基因愈伤组织和野生型愈伤组织的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR。引物为 TyrQC3’-l和35S-UP，阳性对照用质粒pBSRsTyrDC为模板，空白对照(空白对照1_实时荧 光PCR鉴定时以无菌水为模板，空白对照2提取DNA、RNA时，以无菌水代替研磨后的植物组 织)(以下同)。如图12 (PCK 质粒pCARsTyrDC ；DBTC 脱菌转RsTyrDC高山红景天愈伤组 织，ODBTC 停止脱菌转RsTyrDC高山红景天愈伤组织，RCK 野生型愈伤组织，BCKl :2_空白 对照)所示，脱菌和没脱菌转基因愈伤与阳性对照相同，有扩增产物生成，都得到近“S”型 曲线，说明RsTyrDC的cDNA确已整合到高山红景天核基因组DNA中。而野生型愈伤及空白 对照1，2 —致，没有扩增产物生成，得到为近水平直线。为了弄清RsTyrDC在转录水平表达情况，进行了实时荧光RT-PCR。提取阳性转 RsTyrDC高山红景天愈伤组织的RNA和野生型愈伤组织的RNA，分别经反转录得到阳性转 RsTyrDC高山红景天愈伤组织cDNA和野生型愈伤组织的cDNA，分别以各自cDNA为模板，引 物为TyrQC3’-l和35S-UP，进行实时荧光PCR。设阳性质粒和野生型及空白对照1，2，结果 见图13 (PCK 阳性质粒对照，TPC 阳性转RsTyrDC高山红景天愈伤组织，BCKl :2_空白对 照，RCK 野生型愈伤)。由图可以判断出，阳性转RsTyrDC高山红景天愈伤组织中得到与阳 性质粒对照一致的结果，说明在转录水平中表达。综合前述分子检测，说明RsTyrDC基因不仅成功整合到高山红景天基因组DNA中， 而且得到转录水平表达。采用同样的方法将空载体pBRin713转入高山红景天愈伤组织中，获得转 pBRin713高山红景天愈伤组织。采用同样的方法将PCAMBIA1301-RsTyrDC导入高山红景天中，获得转 pCAMBIA1301-RsTyrDC高山红景天愈伤组织。pCAMBIAl301-RsTyrDC在(Ge Y, Cheng X，Hopkins A, Wang ZY. Generation of transgenic Lolium temulentum plants by Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation. Plant Cell Rep. 200726(6) :783_789，公众可从北京农学院获得。)记载。pCAMBIAl301-RsTyrDC的构建方法与pBSRsTyrDC基本相同，为将序列表中序列1 自5，末端第69-1592位核苷酸插入pCAMBIA1301载体的BgLII和Bst EII识别位点间得 到。实施例3、转RsTyrDC高山红景天愈伤组织中红景天甙含量的HPLC测定将由实施例2获得的阳性转RsTyrDC高山红景天愈伤组织、野生型对照(高山红 景天愈伤组织)、由实施例2获得的转pBRin713高山红景天愈伤组织和由实施例2获得的 转PCAMBIA1301-RsTyrDC高山红景天愈伤组织中的红景天甙含量进行了高效液相色谱测 定，具体方法如下从由实施例2的2步骤获得的阳性转RsTyrDC高山红景天愈伤组织中提取红景天 甙，具体提取方法如下将高山红景天转基因愈伤组织于烘箱中60°C烘至恒重，粉碎后过 80目网筛，精确称取0. 8g样品加入甲醇8ml，超生提取30min (超声功率100w、时间30min)， 之后于60°C孵育30min，于室温IlOOOg离心15min，收集上清；沉淀用50%的甲醇水溶液再 提取一次，将上清合并后，过0. 45 μ m滤膜。取过滤后的溶液进行HPLC检测，检测条件为色谱柱=Hypersyl ODS柱，5mm， 4. 6X 150mm ；流动相水-甲醇-乙腈(70 25 5，ν/ν/ν)；流速0. 8ml/min ；检测波长 275nm,带宽10nm，参比波长400nm，带宽80nm ；外标法定量。红景天甙标准品(上海同田生物技术有限公司，Catalog E_0069)，保留时间 为5.61min。HPLC检测的野生型愈伤组织对照中的红景天甙的保留时间为5.61min，转 RsTyrDC高山红景天愈伤组织中的红景天甙的保留时间为5. 61min。实验重复三次，结果取平均值。红景天甙样品保留时间为5. Blmin0结果如图14(A 愈伤组织，B 转pBRin713愈 伤C 转RsTyrDC高山红景天愈伤组织；)所示，从图中看出野生型愈伤组织中的红景天甙 含量为1. 55mg/g干重，转RsTyrDC高山红景天愈伤组织中的红景天甙含量为8. 22mg/g干 重，转RsTyrDC高山红景天愈伤组织中的红景天甙含量比野生型对照提高4. 3倍，RsTyrDC 的转化明显提高了红景天甙的积累水平，具有直接的应用价值。而转pCAMBIA1301-RsTyrDC 高山红景天愈伤组织中的红景天苷含量为3. 77mg/g DW，远低于转RsTyrDC高山红景天愈 伤组织(使用pBRin713载体)。转PBRin713高山红景天愈伤组织和野生型愈伤组织对照的结果无显著差异。
权利要求
一种制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将RSTYRDC蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因的愈伤组织；2)从所述转基因的愈伤组织中提取红景天甙，得到红景天甙；所述RSTYRDC蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述RSTYRDC蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植体； 所述RSTYRDC蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主根癌农杆菌得到的重组根 癌农杆菌；所述重组植物表达载体为将所述RSTYRDC蛋白的编码基因插入载体pBRin713的多克 隆位点间得到的。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于将所述RSTYRDC蛋白的编码基 因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织的方法包括如下步骤用重组根癌农杆菌 侵染所述目的植物的外植体，再依次进行共培养、抑菌培养、诱导培养、抗性筛选培养和继 代抗性筛选培养。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述用重组根癌农杆菌侵染所 述目的植物的外植体的步骤中，所述侵染的时间为9分钟。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外植体为叶盘。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述共培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸和2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯，得到所述共培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述共培养所用的培养基 中的浓度为0. 15mg/L,所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培养所用的培养基中的浓度 为 0. 5mg/L ；所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸和头孢霉素，得到所述抑菌培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所述抑菌培 养所用的培养基中的浓度为1.0mg/L，所述1-萘乙酸在所述抑菌培养所用的培养基中的浓 度为0. lmg/L，所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述诱导培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述诱导培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所 述诱导培养所用的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述诱导培养所用的培养 基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为2. 5mg/L，所 述头孢霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述抗性筛选培养的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所 述抗性筛选培养的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述抗性筛选培养的培养 基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为30mg/L，所 述头孢霉素在所述抗性筛选培养的培养基的浓度为500mg/L ；所述共培养的时间为3天，所述共培养的温度为25°C，所述共培养为连续光照；所述抑菌培养的时间为5天，所述抑菌培养的温度为25°C，所述抑菌培养为连续光照；所述诱导培养的时间为3周，所述诱导培养的温度为25°C，所述诱导培养为连续光照；所述抗性筛选培养的时间为10周，所述抗性筛选培养的温度为25°C，所述抗性筛选培 养为连续光照；所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下I和II所示步骤进行培养I在连续光照、25°C，在如下培养基中继代3次培养，I所用的培养基按照如下方法配 制向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到I所用的培养 基；所述6-苄氨基嘌呤在I所用的培养基中的浓度为1. Omg/L，所述1-萘乙酸在I所用的 培养基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在I所用的培养基中的浓度为20mg/L，所述头孢 霉素在I所用的培养基中的浓度为500mg/L ；II在连续光照、25°c，在如下培养基中继代2次培养，II所用的培养基按照如下方法 配制向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到II所用的培 养基；所述6-苄氨基嘌呤在II所用的培养基中的浓度为1. Omg/L,所述1-萘乙酸在II所用 的培养基中的浓度为0. lmg/L，所述潮霉素在II所用的培养基中的浓度为10mg/L，所述头 孢霉素在II所用的培养基中的浓度为500mg/L。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述步骤I中，所述继代3次按照每10-13天的间隔进行继代；所述步骤II中，所述继代2次按照每15天的间隔进行继代。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述RsTyrDC蛋白的编码基因 为下述1)或2)或3)1)序列表中的序列1的自5’末端第69位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中的序列1的自5’末端第63位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中的序列1。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者 单子叶植物，所述双子叶植物优选为景天科植物，所述景天科植物优选为红景天属植物，所 述红景天属植物尤其优选为高山红景天。
全文摘要
本发明公开了一种利用RsTyrDC制备红景天甙的方法。本发明提供的制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将RSTYRDC蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因的愈伤组织；2)从所述转基因的愈伤组织中提取红景天甙，得到红景天甙；所述RSTYRDC蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明内容为利用高山红景天转基因愈伤组织系统过表达红景天甙生物合成途径关键酶—酪氨酸脱羧酶(RSTyrDC)提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。
文档编号C12N5/10GK101928308SQ20101026196
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者于寒松, 师光禄, 张继星, 王有年, 马兰青 申请人:北京农学院