专利名称：人类白细胞抗原hla-a、b基因全长序列测定以及hla基因测序分型方法
人类白细胞抗原HLA-A、B基因全长序列测定以及HLA基因
测序分型方法技术领域：
本发明涉及生物医学及免疫遗传学，特别是涉及组织配型相关基因HLA-A、-B的 全长序列测定以及HLA基因测序分型方法。
背景技术：
人类白细胞抗原HLA(Human Leukocyte Antigen)分子提呈抗原肽给T淋巴细胞 识别，在适应性免疫应答中起着极其重要的作用。HLA基因同时又是人类重要的遗传结构， 在法医鉴定、器官移植配型等领域应用广泛。众所周知，高度的多态性是HLA基因一个非常重要的特点。以往对人类白抗原基 因多态性的研究主要是针对编码抗原结合肽的外显子(HLA-A、-B基因的第2-4外显子， HLA-DQBU -DRBl基因的第2外显子)。众多研究者对这些外显子的分型技术、多态位点的 探测、疾病相关性以及进化分析研究做了大量工作。然而，越来越多的研究表明，HLA基因非编码区的多态位点及其功能也不容忽视。 上世纪90年代，科学家们开始投入到对HLA基因的调控区特别是5’ -启动子的多态性研 究当中，并从进化、功能分析等多种角度揭示了这些位于调控区的SNPs在基因表达调控中 的作用。大量研究表明，HLA基因调控区多态性蕴含了丰富的与基因进化、基因表达调控以 及疾病相关联的信息。非编码区中除了调控区，内含子多态性也相当可观，它们对于测序 分型试剂盒的开发及完善非常重要。HLA基因测序分型的PCR引物和测序引物，通常位于 目的外显子(HLA-A、-B基因的第2、3、4外显子和HLA-DQB1、-DRBl基因的第2外显子)的 侧翼即调控区及内含子内。某些等位基因的调控区及内含子中存在未知的变异，可能刚好 位于现有分型试剂盒的引物结合位点，导致分型时对该等位基因漏检和丢失现象(Allele dropout)。因此要开发一种长久行之有效的分型试剂盒必须要掌握尽可能丰富的非编码区 多态信息。完整的HLA-A、_B基因的全长序列，应包含8个外显子、7个内含子、5’ -启动子和 3' -UTR0 截止 2010 年 1 月世界卫生组织 WH0(World Health Organization)的 HLA 因子 命名委员会命名的HLA-A等位基因达965个，HLA-B等位基因有1543个(参见IMGT/HLA Database :http //www. ebi. ac. uk/imgt/hla/al ign. html)，但是 IMGT/HLA 数据库中已 公布包含5，-启动子和3，-UTR全长序列的HLA-A等位基因仅31种，占3. 2% (31/965)； HLA-B等位基因有56种，占3. 6% (56/1543)，相对于HLA-A、-B等位基因总数来说是微乎 甚微的，完整的外显子、内含子特别是5’ -启动子及3’ -UTR两端调控区序列的缺乏，难以 进行系统地HLA-A、-B基因全长序列多态性分析和HLA-I类基因精确分型试剂盒的研发，大 量HLA-A、-B等位基因的全长序列有待填补。以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际HLA 基因分型的金标准。该方法首先对需要分型的外显子区域进行PCR扩增即首先扩增目的基 因片段，然后对纯化的PCR扩增产物进行测序反应、电泳检测和序列分析。目前国内各HLA分型和临床组织配型工作中的HLA基因测序分型试剂普遍依赖于进口。但国际上不同厂家 的测序分型试剂盒，扩增HLA基因目的片段的分子大小和策略有所不同。由于商品化试剂 盒较为昂贵，限制了 HLA基因测序分型在群体遗传学和骨髓库中的大规模应用。且大量新 的点突变，被发现分布在HLA-A、-B基因的第1、5、6、7外显子内以及HLA-DRB1、-DQBl基因 的第3外显子内(如DRB1*14:01:01和DRB1*14:54)并获得等位基因命名。在此情况下， 增加这些外显子的多态性检测以解决模棱两可的结果迫在眉睫。
基于上述需求，本发明拟利用中国汉族个体样本建立稳定可靠的HLA-A、-B基因 全长序列分子克隆及测序方法，并对HLA-A、-B基因全长序列多态性进行初步分析，并基于 此系统地开发精确的HLA-A、-B基因第1-7外显子测序分型的方法。HLA-DRB、-DQB基因区域 结构复杂，两个基因区域中均存在多个基因座位，如DRB区域存在DRB1、DRB2、DRB3、DRB4、 DRB5、DRB6、DRB7、DRB8 及 DRB9，其中 DRBl 为功能基因，DRB2、DRB6、DRB7、DRB8、DRB9 为假 基因；DQB区域存在DQB1、DQB2及DQB3，其中DQBl为功能基因，DQB2及DQB3为假基因。由 于功能基因与假基因的序列存在高度同源性，再加上功能基因DRB1、DQBl多态性极高，通 用测序分型引物极难设计。因此对于HLA-DRB1、-DQB1基因的测序分型方法，本发明中我们 分别参考IMGT/HLA数据库中最新释放(2010年7月，Release 3. 1. 0)的两个基因编码区 序列设计组特异性引物对DRBl以及DQBl的第2和第3外显子序列进行扩增，既可有效保 证特异性扩增HLA-DRB1、-DQBl基因序列同时解决了模棱两可结果的问题。HLA-DRBl基因 第2外显子的5’端及DQBl基因第2外显子的3’端多态位点集中且能系统地按组特异性 分类，因此选择这两个区域分别设计组特异性扩增引物。
发明内容本发明旨在解决上述问题，而提供一种测定中国汉族个体人类白细胞抗原 HLA-A、-B基因全长序列的测定方法，以便为中国群体HLA-A、-B全长序列多态性及分子进 化研究、基因的表达调控、疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础。本发明的目的还在于提供一种适合于中国人群的HLA-A、-B、-DQBl、-DRBl基因的 测序分型方法。以便系统地对HLA-A、-B基因的编码区进行测序分型，对HLA-DQB1、DRB1的 第二、三外显子采用组特异性引物进行测序分型，以解决HLA测序分型中出现的模棱两可 的结果问题。为实现上述目的，本发明提供一种人类白细胞抗原HLA-A、-B基因全长序列测定 方法，该方法包括a、各由一对位点特异性PCR扩增引物对HLA-A基因的4. 3kb全长序列，HLA-B基 因的3. 7kb全长序列进行PCR扩增，扩增采用高保真的聚合酶(Pfuultra II Fusion HS DNA polymerase)，扩增区域包含两个基因的5’ -启动子序列，所有外显子，所有内含子，以 及3，-UTR序列；b、将HLA-A 4. 3kb扩增产物以及HLA-B 3. 7kb扩增产物进行末端加碱基‘A’反应 并克隆至PGEM-Teasy载体当中，挑选阳性克隆、提取质粒、分别通过载体两端引物以及正、 反双向十条保守步移测序引物将两个基因的全长序列测通，共获得中国汉族个体HLA-A 38 种等位基因的4. 3kb全长序列，HLA-B 30种等位基因的3. 7kb全长序列。步骤a中，扩增HLA-A 4. 3kb全长序列的PCR引物包括上游引物A-genome-F和下游引物A-genome-R，其中，上游引物A-genome-F的序 列为5 ‘ -ACTCAGAGCTAWGGAATGATG-3 ‘,下游引物 A-genome-R 的序列为 5 ‘ -ACC5 ‘ -ATGGAGCAGCAAAGATGAC-3 ‘；扩增 HLA-B 3. 7kb 全长序列的 PCR 引物包括上游 弓丨物B-genome-F和下游弓|物B-genome-R，其中，上游弓|物B-genome-F的序列为
5 ‘ -CCAGTTCARGGACAGGGATTC-3 '，下游引物 B-genome-R 的序列为 5' -AACAGACTCAGCACAGCRAAC-3‘。所述HLA-A 4. 3kb全长序列的PCR扩增引物以及HLA-B 3. 7kb全长序列的扩增弓丨 物，扩增区域包含两个基因的5’-启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及3’-UTR序列； 上游扩增引物A-Genome-F及B-Genome-F分别位于HLA-A、-B基因的5，-启动子上游，下 游扩增引物A-Genome-R及B-Genome-R分别位于HLA_A、_B基因的3’ -UTR下游，将有多态 性的碱基设计为简并碱基，可同时扩增HLA-A、-B基因所有不同子系的等位基因全长序列。步骤a中，所述测序引物除载体两端通用测序引物(T7、SP6)外，包括的HLA-A基 因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置(以基因的起始密码子 ‘ATG，中的‘A，为ntl)如下A-Genome-SFl 5' -CCCAGGCGTGGCTCTCAG-3‘，NT-266 NT-249 ；A-Genome-SF2 5' -CTACTACAACCAGAGCGA-3‘ ，NT451 NT468 ；A-Genome-SF3 5' -CCTCCCTCTGGTCCTGAG-3‘ ，NT1091 NT1108 ；A-Genome-SF4 5' -CCAGACCCAGGACACGGA-3‘，NT1691 NT1708 ；A-Genome-SF5 5' -AGCAGTCACAAGTCACAG-3‘ ，NT2288 NT2305 ；A-Genome-SRl 5' -TAAACAGCCCATCGCATG-3‘，NT2840 NT2823 ；A-Genome-SR2 5' -AGGTGCTTTACAAAAGAG-3‘ ，NT2230 NT2213 ；A-Genome-SR3 5' -GCCAGGTCAGTGTGATCT-3‘ ，NT1674 NT1657 ；A-Genome-SR4 5' -AATTGTCTCCCCTCCTTG-3‘，NT1068 NT1051 ；A-Genome-SR5 5' -GKCCTCGCTCTGGTTGTA-3‘ ，NT472 NT455。HLA-B基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如 下B-Genome-SFl :5，-GCCCTGACCGAGACCTG-3，，NT52 NT68 ；B-Genome-SF2 :5，-CGGTTTCATTTTCAGTTG-3，，NT625 NT642 ；B-Genome-SF3 :5，-CCCTCTTCTCTCTAGGAC-3，，NTl146 NT1163 ；B-Genome-SF4 :5，-CAGACCAGCAGGAGATAG-3，，NT1720 NT1737 ；B-Genome-SF5 :5，-ATGAGTCAGGGGAAGGTC-3，，NT2296 NT2313 ；B-Genome-SRl :5，-GGATTTTGGCCTCAACTG-3，，NT2711 NT2694 ；B-Genome-SR2 :5，-GGACTGTCTTCCCCTCCA-3，，NT2209 NT2192 ；B-Genome-SR3 :5，-TGGTCTGGTCTCCACAAG-3，，NT1726 NT1709 ；B-Genome-SR4 :5，-GTGCTGGCACACAGGGTC-3，，NT1208 NTl191 ；B-Genome-SR5 5，-AGACCCCAAGAATCTCAC-3，，NT654 NT637。步骤a中，所述38种HLA-A等位基因完整的4. 3kb基因组全长序列，序列从基因 的5，-启动子上游nt-819至3，-UTR下游nt 3435处(以基因的起始密码子‘ATG，中的 'K'为 ntl)，全部延伸 了国际 IMGT/HLA 数据库中(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)释放的该基因最长序列NT-300 NT3203，其中新等位基因全长序列7个，将已有等位基因的 编码区、5’ -启动子区、3’ -非翻译区及所有内含子序列补充完整的等位基因31个；所述 30个HLA-B等位基因完整的3. 7kb基因组全长序列，序列从基因的5’-启动子上游nt-410 至3’ -UTR下游nt3298处，全部延伸了国际IMGT/HLA数据库中释放的该基因最长序列 NT-284 NT3039，其中新等位基因全长序列3个，将已有等位基因的编码区、5，-启动子区、 3’ -非翻译区及所有内含子序列补充完整的等位基因27个。由本发明的方法所获得的HLA-A、-B基因全长序列命名、获得的GenBank登录 号以及与IMGT/HLA已有相同或相近等位基因序列比较特征见表1及表2。表1为38条 HLA-A4. 3kb全长序列登录号及其特征。表 1
等位基因
GenBank IMGT/HLA登长度与IMGT/HLA已有相同或相近等位基 登录号录号 (bp)因序列比较
A*01: 01: 01: 01 GU812295 HWS10010355 4254 延伸 5，-启动子以及 3’ -UTR
A+01:03
HM484299 HWS10010850 4254 首次: 艮道 5’ -启动子以及 3’ -UTR
Α*02: 01: 01: 01 GQ996941 HWS10006796 4271 延伸 5，-启动子以及 3’ -UTR
Α*02: 03: 01 ΗΜ357872 HWS10010839 4271 首次报道 5，-启动子以及 3，-UTR
Α*02: 05: 01 ΗΜ595423 HWS10010903 4271 延伸 5，-启动子以及 3，-UTR
权利要求
一种人类白细胞抗原HLA A、 B基因全长序列测定方法，其特征在于，该方法包括a、各由一对位点特异性PCR扩增引物对HLA A基因的4.3kb全长序列，HLA B基因的3.7kb全长序列进行PCR扩增，扩增采用高保真的聚合酶(Pfuultra II Fusion HS DNA polymerase)，扩增区域包含两个基因的5’ 启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及3’ UTR序列；b、将HLA A 4.3kb扩增产物以及HLA B 3.7kb扩增产物进行末端加碱基‘A’反应并克隆至pGEM Teasy载体当中，挑选阳性克隆、提取质粒、分别通过载体两端引物以及正、反双向十条保守步移测序引物将两个基因的全长序列测通，共获得中国汉族个体HLA A 38种等位基因的4.3kb全长序列，HLA B 30种等位基因的3.7kb全长序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，扩增HLA-A4. 3kb全长 序列的PCR引物包括上游引物A-genome-F和下游引物A-genome-R，其中，上游引物 A-genome-F 的序列为5 ' -ACTCAGAGCTAWGGAATGATG-3 '，下游引物 A-genome-R 的序 列为5' -ACC 5 ‘ -ATGGAGCAGCAAAGATGAC-3 ‘；扩增 HLA-B 3. 7kb 全长序列的 PCR 引物包括上游引物B-genome-F和下游引物B-genome-R,其中，上游引物B-genome-F 的序列为5 ‘ -CCAGTTCARGGACAGGGATTC-3 ‘，下游引物 B-genome-R 的序列为 5' -AACAGACTCAGCACAGCRAAC-3‘。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HLA-A4. 3kb全长序列的PCR扩增引 物以及HLA-B 3. 7kb全长序列的扩增引物，扩增区域包含两个基因的5’-启动子序列，所有 外显子，所有内含子，以及3’ -UTR序列；上游扩增引物A-Genome-F及B-Genome-F分别位 于HLA-A、-B基因的5’ -启动子上游，下游扩增引物A-Genome-R及B-Genome-R分别位于 HLA-A、-B基因的3’ -UTR下游，将有多态性的碱基设计为简并碱基，可同时扩增HLA-A、-B 基因所有不同子系的等位基因全长序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述测序引物除载体两端通用 测序引物(T7、SP6)外，包括的HLA-A基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为ntl)如下A--Genome--SFl5'-CCCAGGCGTGGCTCTCAG--3'，NT-266 ‘ NT-249A--Genome--SF25'-CTACTACAACCAGAGCGA--3'，NT451 ^NT468 ；A--Genome--SF35'-CCTCCCTCTGGTCCTGAG--3'，NT1091 ‘ NT1108A--Genome--SF45'-CCAGACCCAGGACACGGA--3'，NT1691 ‘ NT1708A--Genome--SF55'-AGCAGTCACAAGTCACAG--3'，NT2288 ‘ NT2305A--Genome--SRl5'-TAAACAGCCCATCGCATG--3'，NT2840 ‘ NT2823A--Genome--SR25'-AGGTGCTTTACAAAAGAG--3'，NT2230 ‘ NT2213A--Genome--SR35'-GCCAGGTCAGTGTGATCT--3'，NT1674 ‘ NT1657A--Genome--SR45'-AATTGTCTCCCCTCCTTG--3'，NT1068 ‘ NT1051A--Genome--SR55'-GKCCTCGCTCTGGTTGTA--3'，NT472 一NT455 ；HLA-B基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下 B-Genome-SFl :5’ -GCCCTGACCGAGACCTG-3’，NT52 NT68 ； B-Genome-SF2 :5，-CGGTTTCATTTTCAGTTG-3，，NT625 NT642 ； B-Genome-SF3 :5’ -CCCTCTTCTCTCTAGGAC-3，，NT1146 NT1163 ；B--Genome--SF4:5，-CAGACCAGCAGGAGATAG--3'',NTmO ‘ NT1737B--Genome--SF5:5，-ATGAGTCAGGGGAAGGTC--3'‘，NT2296 ‘ NT2313B--Genome--SRl:5，-GGATTTTGGCCTCAACTG--3'‘，NT2711 ‘ NT2694B--Genome--SR2:5，-GGACTGTCTTCCCCTCCA--3'‘，NT2209 ‘ NT2192B--Genome--SR3:5，-TGGTCTGGTCTCCACAAG--3'‘，NT1726 ‘ NT1709B--Genome--SR4:5，-GTGCTGGCACACAGGGTC--3'NT1208 ‘ NT1191B--Genome--SR5:5，-AGACCCCAAGAATCTCAC--3'‘，NT654 一NT637。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述38种HLA-A等位基因完 整的4. 3kb基因组全长序列，序列从基因的5，-启动子上游nt-819至3，_UTR下游nt3435 处，全部延伸了国际IMGT/HLA数据库中释放的该基因最长序列NT-300 NT3203，其中新等 位基因全长序列7个，将已有等位基因的编码区、5’-启动子区、3’-非翻译区及所有内含子 序列补充完整的等位基因31个；所述30个HLA-B等位基因完整的3. 7kb基因组全长序列， 序列从基因的5，-启动子上游nt-410至3，-UTR下游nt3298处，全部延伸了国际IMGT/ HLA数据库中释放的该基因最长序列NT-284 NT3039，其中新等位基因全长序列3个，将 已有等位基因的编码区、5’ -启动子区、3’ -非翻译区及所有内含子序列补充完整的等位基 因27个。
6.如权利要求1至5中任一条所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B全长序列PCR 扩增反应体系为IOXPfu Buffer 2. 5 μ L dNTP(25mM)2.0 μ LPCR 引物(10 μ Μ) 各 IyL 基因组DNAIOOngPfu 酶(5U/ μ L)0· 5 μ L力口 ddH20 至25 μ L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，HLA-A、-B全长序列扩增反应体系中，其循环 参数为95 0C 2min95 °C 30Sec58 °C 30Sec72 °C 3min，35 个循环72 °C 15min4 °C Infinite。
8.—种HLA基因测序分型方法，其特征在于，该方法包括 a、HLA-A、-B的测序分型方法为将HLA-A、-B均分别由两对位点特异性PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其 中，第一对PCR引物的扩增产物涵盖第1外显子至第4外显子，第二对PCR引物的扩增产物 第5外显子至第8外显子；两个基因分别通过十四条正向和反向测序引物对扩增产物进行 测序反应，其中，分别对HLA-A、-B基因的第1、2、3、4、5、6、以及7外显子进行正、反向双向 测序；b、HLA-DRB1、-DQBl的测序分型方法为采用八条5’端等位基因组特异性引物分别与一条3’端通用位点特异性引物扩增DRBl 的第2外显子至第3外显子的序列，DRBl的第2外显子采用八条5’端等位基因组特异性 引物与一条3’端位点特异性通用测序引物进行正、反双向测序，DRBl的第3外显子采用一 对位点特异性通用测序引物进行正、反双向测序，采用一条5’端通用位点特异性引物分别 与三条3’端等位基因组特异性引物对DQBl第2外显子进行PCR扩增，一对位点特异性引 物对第3外显子进行PCR扩增，通过4条测序引物分别对第2外显子扩增产物和第3外显 子扩增产物进行正、反双向测序。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，扩增HLA-A第1至4外显子的 PCR引物包括上游引物A-SBT-Fl和下游引物A-SBT-R1，其中，上游引物A-SBT-Fl的序列 及核苷酸位置为5 ‘ -GAGAAGCCAATCAGTGTCKTC-3 ‘ (nt-84 nt_64)，下游引物 A-SBT-Rl 的序列及核苷酸位置为5，-GCTTTCCSTAARAGACATGAC-3‘ (ntl866 ntl886)；扩增 HLA-A 第5至8外显子的PCR引物包括上游引物A-SBT-F2和下游引物A-SBT-R2，其中，上游引物 A-SBT-F2 的序列及核苷酸位置为5，-AAGGAGGGAGAYGGGGGTGTC-3，(NT 1848 NT1868)， 下游引物 A-SBT-R2 的序列核苷酸位置为5 ‘ -TGCCTYTCAGTCCCACACAAG-3 ‘ (nt2913 nt2933)，扩增HLA-B第1至4外显子的PCR引物包括上游引物B-SBT-Fl和下游引物 B-SBT-Rl，其中，上游引物B-SBT-Fl的序列及核苷酸位置为5 ‘ -CTAGAGAAGCCAATCAGYGTC -3' (NT-86 NT-66)，下游引物B-SBT-Rl的序列及核苷酸位置为5' -CCCGCCCTGAGMSAGA TATG-3' (NT1865-NT1881，5，端加CCCG)；扩增HLA-B第5至8外显子的PCR引物包括上游 引物B-SBT-F2和下游引物B-SBT-R2，其中，上游引物B-SBT-F2的序列及核苷酸位置为5， -AGGGGGATGAGGGGTCATATC-3，(NT 1849 NT1869)，下游引物 B-SBT-R2 的序列及核苷酸位置 为5’ -AGACACATTCAGGTGCCTTTG-3’ (NT2953 NT2973)。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B基因的第1至第4外显子 的PCR扩增引物的上游引物A-SBT-Fl及B-SBT-Fl分别位于HLA_A、_B基因的5’ -启动子 区域，下游引物A-SBT-Rl及B-SBT-Rl分别位于HLA-A、-B基因的第4内含子区域，扩增区 域涵盖了两个基因分型常规检测区域第2、3、4外显子，还包含了部分5’-启动子区、第1外 显子、第1内含子、第2内含子、第3内含子以及部分第4内含子序列，HLA-A、-B基因第1 至第4外显子的PCR扩增引物的扩增片断长约为1970bp ；所述HLA-A、-B基因的第5至第 8外显子的PCR扩增引物的上游引物A-SBT-F2及B-SBT-F2分别位于HLA_A、_B基因的第4 内含子区域，下游引物A-SBT-R2及B-SBT-R2分别位于HLA-A、-B基因的3，-UTR区，扩增 区域涵盖了两个基因第5、6、7、8外显子，并包括部分第4内含子、第5内含子、第6内含子、 第7内含子及部分3’UTR区域的序列，HLA-A、-B基因第5至第8外显子的PCR扩增引物扩 增片段长度约为IlOObp ；上述八条引物选择了具有位点特异性的保守区域或者单核苷酸 多态性清晰的区域设计引物。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，HLA-A基因分型测序引物及核 苷酸位置如下第一外显子正向测序引物 AlF -ACCGGGACTCAGATTCTC-3‘，nt_32 nt_15，第一外显子反向测序引物 AlR 5' -MCGACCCCGCACTCAC-3‘，nt74 nt89 ；第二外显子正向测序引物 A2F -CCTCTGYGGGGAGAAG-3‘，ntlOl ntll6，第二外显子反向测序引物A2R:5' 第三外显子正向测序引物A3F :5 ‘ 第三外显子反向测序引物A3R :5 ‘ 第四外显子正向测序引物A4F:5' 第四外显子反向测序引物A4R :5’ 第五外显子正向测序引物A5F:5' 第五外显子反向测序引物A5R:5' 第六外显子正向测序引物A6F :5 ‘ 第六外显子反向测序引物A6R :5 ‘ 第七外显子正向测序引物A7F :5 ‘ 第七外显子反向测序引物A7R:5'-CGGACCCGGAGACTGTG-3‘，nt539 nt555 ； -CGGTTTCATTTTCAGTTTAG-3‘，nt621 nt640， -TGTCTCCCCTCCTTGTG-3‘，ntl049 ntl065 ； -GAGTGTCCCATKACAGATG-3‘，ntl517 ntl535， -TTCCSTAARAGACATGAC-3’，NT1866 NT1883 ； -TTCCCCTCTTTTCCCAG-3‘，NT1931 NT1947， -TSTTCCTCCTCCACMTC-3‘，NT2042 NT2058 ； -TCTCACAGGACATTTTCTTC-3‘，NT2481 NT2500， -GCTCCCAAACACAATATC-3‘，NT2576 NT2593 ； -CACAATTCCTCCTCTAG-3‘，NT2616 NT2632， -GAAACCCCATAGCACAG-3‘，NT2786 NT2802 ；HLA-B基因分型测序引物及核苷酸位置如下第一外显子正向测序引物 BlF -CGCACCCACCCGGACTC-3‘，NT-38 NT-22， 第一外显子反向测序引物BlR :5 第二外显子正向测序引物B2F 5 第二外显子反向测序引物B2R 第三外显子正向测序引物B3F 5 第三外显子反向测序引物B3R 5 第四外显子正向测序引物B4F 5 第四外显子反向测序引物B4R 第五外显子正向测序引物B5F 5 第五外显子反向测序引物B5R 5 第六外显子正向测序引物B6F 5 第六外显子反向测序引物B6R 5 第七外显子正向测序引物B7F 5 第七外显子反向测序引物B7R :5-TCACCGGCCCAGGTCTC-3‘，NT61 NT77 ； -AGGCTCCCACTCCATG-3，，NT200 NT215， -CCTCGCTCTGGTTGTAG-3’，NT451 NT468 ； -RGGCCAGGGTCTCACA-3’，nt710 nt725， -GGAGATGGGGAAGGCTC-3’，NT1010 NT1026 -CATTCTCAGGCTGGTCAC-3，，ntl483 ‘ -CCCTCATCCCCCTCCTTAC-3，，ntl841 -AGCCCTTCAGCAGGGTC-3’，NT1889 -GCTTGAAACCCCCAGTG-3’ -GGAGGTTCCTCTAAGATC-3 -GAGACGTKGGACAGGAG-3’ -GGCTCTGACCAGGTCCT-3NT2094 ，NT2425 -NT2576 ，NT2598 ，NT2689-ntl500, ntl861 ； NT1905, NT2110 ； -NT2442, NT2592 ； NT2614, NT2705。-CCACTCTAGACCCCAAG-3‘
12.如权利要求书8所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述HLA-DRBl基因测序分 型方法中，八条5’端等位基因组特异性正向扩增引物均位于DRBl第2外显子5’端，引物 序列及组特异性如下HLA-DRB 1*01 正向扩增引物 5，DRl :5，-TTCTTGTGGCAGCTTAAGTT-3，， HLA-DRB1*02，15，16 正向扩增引物 5，DR2/15/16 :5，-TTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG-3，， HLA-DRB1*03，11，13，14 正 向扩增 弓I 物 5' DR3/11/13/14 5’ -GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC-3’，HLA-DRB 1*04 正向扩增引物 5，DR4 :5，-GTTTCTTGGAGCAGGTTAAAC-3，，HLA-DRB1*07 正向扩增引物 5，DR7 :5，-CACGTTTCCTGTGGCAGGG-3，，HLA-DRB 1*08,12 正向扩增引物 5，DR8/12 :5，-GTTTCTTGGAGTACTCTACGGG-3，，HLA-DRB 1*09 正向扩增引物 5，DR9 :5，-GTTTCTTGAAGCAGGATAAGT-3，，HLA-DRB 1*10 正向扩增引物 5，DRlO :5，-CGGTTGCTGGAAAGACGCG-3，；DRBl的第2至3外显子通用反向扩增引物3’ DR-generic位于DRBl的第3外显子末端及第3内含子的交界处，引物序列为5’ -AAGCTGCTCACTCCATTC-3’ ；八条5’端等位基因 组特异性引物分别与3’ DR-generic扩增DRBl的第2外显子到第3外显子的序列，序列涵 盖DRBl的第2外显子、第2内含子及第3外显子，序列长约2800bp ；DRBl的第2外显子正向测序引物为上述八条5’端等位基因组特异性引物，反向通用测 序引物DRB2Rseq位于第2外显子3’末端，引物序列为5’ -CCGCTGCACYGTGAAG-3’。DRBl的第3外显子正向测序引物DRB3Fseq位于第3外显子5’端，引物序列为 5，-CCTRAGGTGACTGTRTATC-3‘；反向测序引物DRB3Rseq位于第3外显子3，末端，引物序列 为5’ -TCCATTCCACTGTGAGAG-3，。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述HLA-DQBl基因测序分型 方法中，第2外显子的5’端通用正向扩增引物5’ DQex2-generic序列如下5’ -TGTAAAAC GACGGCCAGTTCCTCGCAGAGGATTTC-3，，其中该引物的 3，端 17 个碱基 ‘TCCTCGCAGAGGATTTC， 位于DQBl的第1内含子3’末端及第2外显子5’端的交界处，该引物的5’端18个碱基 ‘TGTAAAACGACGGCCAGT’为M13F的序列，DQBl第2外显子的三条3’端等位基因组特异性反 向扩增引物序列、组特异性及位置如下HLA-DQB1*02，03，04 反向扩增引物 3，DQex2_2/3/4 :5，-CTCGCCGCTGCAAGGTCGT-3，， DQBl第2外显子3’末端；HLA-DQBl-*05，06 反向扩增引物3，DQex2_5/6CAG :5，-GGCTCACTCTCCTCTGCAG-3，，第 2外显子3’末端及第2内含子5’端交界处；HLA-DQBl-部分 *06 反向扩增引物3，DQex2_P6CAA :5，-GGCTCACTCTCCTCTGCAA-3，，第 2外显子3’末端及第2内含子5’端交界处；一条5’端通用正向扩增引物分别与三条3’端等位基因组特异性反向扩增引物扩增 DQBl的第2外显子序列，序列长约300bp ；DQBl第3外显子的正向扩增引物5’ DQex3位于第3外显子的5’端，序列为 5，-GAGCCCACAGTGACCATCTC-3，;第3外显子的反向扩增引物3，DQex3位于第3外显子的3， 末端及第3内含子5，端交界处，序列为5，-TACGCCACTCCRCGRTGATG-3，。该两条引物扩增 第3外显子序列长约280bp ；DQBl第2外显子及第3外显子的测序引物及位置如下第2外显子正向测序引物DQB2Fseq :5，-CTCGCAGAGGATTTCGTG-3，，第2外显子5，端； 第2外显子反向测序引物DQB2Rseq :5，-CTSGTRGTTGTGTCTGCA-3，，第2外显子3，端； 第3外显子正向测序引物DQB3Fseq :5，-AGTGACCATCTCCCCATC-3，，第3外显子5，端； 第3外显子反向测序引物DQB3Rseq :5’ -ATGGGGYTCTGGAGGCT-3’，第3外显子3’端。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，八条5’端等位基因组特异性引物分别与 3'DR-generic扩增DRBl的第2外显子到第3外显子的序列，均可采用的扩增反应体系为IOXBuffer12. 5μ LMgCl2 (25mM)1. 5μ LdNTP (25mM)2. 0 μ LPCR 引物(10 μ Μ)各 IyL基因组DNAIOOngClontech LA 酶(5U/ μ L) 0. 5 μ L力口 ddH20 至25 μ L。
15.如权利要求1、8所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B基因第1至第4外显子 及第5至8外显子、HLA-DQBl的第2外显子、HLA-DQBl的第3外显子均可采用的PCR扩增 反应体系为2XGC Buffer12. 5μ LdNTP (25mM)2. 0 μ LPCR 引物(10 μ Μ)各 IyL基因组DNAIOOngClontech LA 酶(5U/ μ L) 0. 5 μ L 力口 ddH20g25 μ L。
16.如权利要求1、8所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B基因第1至第4外显子 以及第5至8外显子、HLA-DQBl的第2外显子、HLA-DQBl的第3外显子及HLA-DRBl的第2 至3外显子均可采用的PCR扩增反应程序为95 0C2min95 °C15Sec65 °C15Sec72 °C2min，5 个循环95 °C15Sec60 °C15Sec72 °C 2min，26 个循环95 °C 5Sec55 °C Imin72 °C 3min，4 个循环72 °C 15min4 °CInfinite。
17.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B、-DQBl、-DRBl测序分型方 法中所有的测序反应均可采用以下体系测序引物(10 μ M)0. 2μ L测序模板DNA2. OyLABI PRISM BigDyeTerminator 1. 1 0.25 μ 15XBigDye Buffer1. 8μ 1力口 ddH20gΙΟμ 。
全文摘要
一种人类白细胞抗原HLA-A、B基因全长序列测定以及HLA基因测序分型方法，其中，HLA-A、-B基因全长序列测定方法包括a、各由一对引物对HLA-A、B基因约4kb全长序列进行PCR扩增；b、将扩增产物克隆至pGEM-Tea sy载体中，分别通过正、反双向十条步移测序引物将全长序列测通，共获得HLA-A 38种等位基因4.3kb全长序列，HLA-B30种等位基因3.7kb全长序列。HLA-A、-B测序分型方法为将HLA-A、-B分别由两对引物对分型目的区域进行PCR扩增；分别通过十四条测序引物对产物进行双向测序；HLA-DRB1、-DQB1的测序分型方法为分别采用组特异性引物扩增DRB1及DQB1的第2、3外显子的序列。采用八条组特异性引物与三条测序引物对DRB1的第2、3外显子进行双向测序，采用四条测序引物分别对DQB1第2、3外显子进行双向测序。
文档编号C12N15/11GK101962676SQ201010268649
公开日2011年2月2日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者徐筱娉, 王大明, 邓志辉, 高素青 申请人:深圳市血液中心