专利名称：一种GAI mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是GAI基因mRNA分子在梨属植物砧 木和接穗间长距离传递的分子鉴定方法。
背景技术：
园艺作物生产过程中，广泛应用嫁接技术，获得抗性、矮化等性状，以增加产量并 提高产品品质，其中果树栽培中对嫁接的应用更为普遍。生产过程中发现，同样的接穗嫁接 至不同砧木后性状表现不同，如果实色泽、可溶性固形物含量、开花期等变化，许多性状的 改变会影响到果品的形成、生长及发育，进而影响后期的经济效益。一系列的研究表明，植物体中一些RNA分子在细胞间与一些韧皮部蛋白以蛋白 质-RNA复合体的形式在韧皮部中转移，并可通过嫁接口由砧木传递至接穗的顶端分生组 织，影响接穗的生长发育。因此，通过对果树嫁接过程中RNA的韧皮部长距离系统运输的鉴 定及研究，可以为今后我们搞清果树中砧木与接穗间RNA分子的传递机制，以及利用可传 递RNA转基因有目的的改良砧木，使接穗获得优良性状以利于果品生产及经济效益的提高 奠定基础，也为果树生产提供积极的指导作用。赤霉素(GA)是在植物生长发育过程中起重要作用的植物激素。对GA信号调控 方面的研究中发现，GRAS家族中的GAI拟南芥中GA信号起负调控作用，其氨基酸序列N 端包括一个保守的区域被称为DELLA(Alvey等，2005)，DELLA区缺失植物会表现半矮化 (Olszewski等，2003)。目前拟南芥中编码DELLA蛋白的基因有5个，分别为GAI、RGL、RGL1、 RGL2 和 RGL3(Dill et al. ,2001 ；Lee et al.，2002)。苹果‘嘎拉，品种在 NCBI 中登录的 编码 DELLA 蛋白的基因有三组共 6 个 MdRGLla/b、MdRGL2a/b 和 MdRGL2a/b(Foster et al.， 2007)，湖北海棠中有2个MhGAIl和MhGAI2，小金海棠中有2个MxGAIl和MxGAI2，苹果‘富 士，有2个MhGAIl和MhGAI2(徐海燕等，2009)，其他植物如水稻(Su et al.，2005)、大麦 (Ikeda et al. ,2001)中也克隆到了编码DELLA蛋白的GRAS家族基因。至今为止，研究发现能够在植物韧皮部进行长距离传递的基因mRNA及其编码的 蛋白有很多，如KNl、BEL5、NACP、FT蛋白、SUT1等，关于这些基因的RNA及蛋白是否能够 传递的验证也仅是使用转基因检测载体携带特异性标签(Haywood et al.，2005)，及巢式 RT-PCR(Harada et al. , 2009) ,Northern blot等技术，虽然这些技术检测基因的传递性比 较准确，但是其过程繁琐，要求高，耗时长，明显存在工作量大，工作周期长，效率低等不足 之处，特别是因为果树转基因及再生较困难，我们在研究RNA在砧穗间传递的过程中，转基 因的方法验证基因RNA的传递很困难，这样就为我们进行果树内源mRNA嫁接传递的研究更 增加了难度。
发明内容
本发明的目的是提供杜梨和‘鸭梨’GAI的核苷酸序列和由该核苷酸编码的蛋白的 氨基酸序列，如SEQ ID NOl 4所示。
本发明的另一个目的是提供一种GAI基因mRNA在梨属砧穗间运输的分子鉴定方 法，包括如下步骤(1)根据拟南芥、南瓜、苹果等植物GAI基因保守区设计引物，分离和克隆杜梨 (Pyrus betulaefolia)、‘鸭梨，(Pyrus bretschneideri)中编码 DELLA 蛋白的 GAI 基因全 长，利用生物信息学方法进行序列分析，并对所得基因进行了比对及分析，证实所得基因属 于GRAS家族；(2) ‘鸭梨’为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；(3)分析‘鸭梨’和‘杜梨’的GAI基因序列，寻找各自特异的酶切位点，在此酶切 位点的上下游分别设计引物；(4)分别提取‘鸭梨’、杜梨以及嫁接后的砧木和接穗的总RNA，反转录成cDNA，PCR 扩增GAI的基因片段；(5)用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图，如果在嫁接 体系中存在RNA的传递，则在砧木杜梨的扩增产物酶切后会出现接穗‘鸭梨’特异性的条 带，同样在接穗‘鸭梨’的扩增产物酶切后也会出现砧木杜梨特异性的条带；如果不发生传 递，那么扩增产物的酶切电泳图中就会显示出各自相应样品的条带而无其他杂带。所述用于扩增杜梨和‘鸭梨，GAI同源基因的引物为TTGATTTCCGAGCCCTACCC和 AACTCGGTCATCGCTCACTGA。所述的限制性内切酶为Hap II。其中，用于提取接穗‘鸭梨’总RNA的样品选择嫁接3 4d的‘鸭梨’的叶片、茎 尖、茎段韧皮部或嫁接口。本发明的另一个目的是提供所述的鉴定方法在梨属其他植物砧穗间GAI mRNA分 子传递鉴定中的应用。本发明提供的方法解决了同源性高的基因在砧木和接穗间无法通过设计特异性 引物进行RT-PCR鉴定的问题，同时也解决了果树转基因技术较难，耗时长而不方便鉴定的 问题。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于其他梨属植物。
图1所示为‘鸭梨’和杜梨GAI基因PCR扩增电泳图。图中M DNA分子量标准；1 ‘鸭梨’ ；2 杜梨。图2所示为GAI氨基酸序列同源性比较。图中YL-GAI ‘鸭梨，；DL-GAI 杜梨； MfGAI 苹果‘富士，；MxGAI 小金海棠；MdRGLla 苹果‘嘎啦，。图3所示为GAI氨基酸序列系统进化树分析图4所示为‘鸭梨’和杜梨GAI RT-PCR产物限制性酶切电泳检测结果。图中M DNA分子量标准；1 ‘鸭梨，RT-PCR产物酶切结果；2 杜梨RT-PCR产物酶切结果；3 ‘鸭梨， 和杜梨等量混合物RT-PCR产物酶切结果；4 ‘鸭梨，RT-PCR产物；5 杜梨RT-PCR产物。图5所示为嫁接后砧木和接穗RT-PCR结果。图中1 : ‘鸭梨’茎尖；2 ‘鸭梨’叶片； 3 ‘鸭梨’茎段韧皮部；4 嫁接口 ；5 杜梨茎段韧皮部；6 杜梨茎段木质部；CK 对照组；Y 未嫁接的‘鸭梨’ ；D 未嫁接的杜梨；M 未嫁接的‘鸭梨’和杜梨等量混合物。图6所示为微嫁接接穗与砧木GAI RT-PCR产物限制性酶切电泳检测结果。M =DNA分子量标准；1 ‘鸭梨’茎尖；2 鸭梨’叶片；3 鸭梨’茎段韧皮部；4 嫁接口 ；5 杜梨砧木 茎段韧皮部；6 杜梨茎段木质部；Y 未嫁接的‘鸭梨’ ；D 未嫁接的杜梨；M'未嫁接的‘鸭 梨’和杜梨等量混合物。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1试管微嫁接选取砧木杜梨(Pyrusbetulaefolia Bunge)和接穗‘鸭梨，(Pyrus bretschneideri iYali')组培苗幼叶，恒定光源，光强15001x，光照14h，室温23 25°C, 相对湿度85%，30 40d继代一次。_植物材料培养基
‘鸭梨，MS+1. Omg · L_16-BA+0. Img · L-1IBA
杜梨MS+0. 5mg · L_16-BA+0. Img · L-1IBA
液氮处理后-80°C冰箱保存用于基因克隆。在无菌条件下，将扩繁30d后 的杜梨组培苗去头，留约1.5cm长茎段，沿顶部纵切；取苗高Icm的‘鸭梨’组培苗， 顶端留2-3片叶，基部削成“V”型，插入砧木切口，用锡箔纸固定，嫁接苗在培养基 MS+0. 5mg · L_16-BA+0. Img · L-1IBA 中生长。实施例2基因组DNA提取(1)18叶片液氮研磨，转入一个2.0!1^离心管中，加入80(^12\07^(2% CTAB, IOmM Tris-HCl，1. 4M NaCl, 1% PVP)，稍振荡混勻，放于65°C水浴中20_40min，期间轻摇几次。(2)降至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 1)，室温12000rpm离 心10分钟。(3)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 1)，12000rpm离心10分钟。(4)上清中加入2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀30min。(5) 12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗两次，晾干沉淀，溶于适量 双蒸水中。(6)若需要，按100 μ 1力Π 1 μ 1 RNA酶比例进行去RNA处理，37°C 30分钟。用CI 抽提一遍再用乙醇沉淀，沉淀溶于适量双蒸水中。(7) 1 %琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计测260nm处吸光度计算DNA 浓度。实施例3 GAI基因组全长克隆
根据GenBank中公布的拟南芥、南瓜、苹果‘富士’等植物GAI的基因保守区设计 引物。扩增GAI基因使用引物如下上游引物5‘ -TTGATTTCCGAGCCCTACCC-3，，下游引物5，-AACTCGGTCATCGCTCACTGA-3，。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反应体系Prime STAR HS DNA 聚合酶(Takara 公司，DR010S)，Takara LA PCR invitro Cloning Kit (Takara 公司，DRR015)_5 X Prime STAR 缓冲液10 μ 1dNTP mixture (2. 5mM each)4 μ 1Primer F/R(10 μ mol/L)1 μ 1Templete1 μ 1Prime STAR HS DNA 聚合(2. 5U/ μ 1) 0. 5 μ 1双蒸水32. 5 μ 1_总计50 μ 1 _PCR反应程序如下94°C 预变性 3min;94°C 40s ；61°C 30s ；72 °C Imin ；30个循环。72°C最后延伸 2min。PCR产物检测根据目标片段大小制作琼脂糖凝胶，0. TAE电泳缓冲液， 70-110V电压电泳约15min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物片段大小，可得两条大小 相同的条带(图1)。实施例4目的片段琼脂糖凝胶回收使用中科瑞泰生物技术有限公司回收试剂盒，方法参照其公司说明书①切取含有目的DNA片断的琼脂糖，尽量切除多余凝胶，加入350μ1的溶胶液PN。②50°C水浴放置lOmin，不断温和上下翻转离心管，确保胶块完全溶解。若仍然有 未溶解的胶块，可补充一些溶胶液或放置几分钟，直至完全溶解。③将溶好的胶冷却至室温，加到回收柱中，13000rpm离心60s，倒掉收集管中的废
液，重复操作一次。④重复③中的操作一次。⑤加入700 μ 1漂洗液PW(已加无水乙醇)，13000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。⑥加入500 μ 1漂洗液PW(已加无水乙醇)，13000rpm离心60s，倒掉收集管中的废
6液。⑦将吸附柱放回收集管内，13000rpm离心2min，尽量去除漂洗液。⑧取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在超净台上吹干，在吸附柱膜中央加入 30 μ 1已加热至68°C的洗脱液，室温下放置2min，13000rpm离心lmin。⑨取5 μ 1回收产物电泳检测回收效果，放入_20°C保存备用。实施例5制备大肠杆菌感受态①从-70°C冰箱中取出菌种，未完全解冻前用已经灭菌的牙签轻轻点一下后在备 好的90mm培养基上划线，37°C过夜培养16h左右，培养至可见单菌落时封口于4°C冰箱中保 存备用；②配制LB液体培养基300ml，分装于6个200ml的三角瓶(50ml/瓶)，高温高压 灭菌20min，冷却至55°C左右，每个三角瓶中取LB液体培养基50 μ 1都装于同一个已经灭 菌的玻璃试管中。三角瓶中培养基封口于4°C冰箱备用；③用已灭菌的枪头于90mm培养好的菌板上挑取单菌落，将枪头推入装有LB液体 培养基的玻璃试管中，封口，于37°C恒温震荡床中228rpm过夜培养16h以上；④从培养好的液体菌液中分别取50 μ 1于备用的6个装有液体培养基的三角瓶 中，以1 100比例接种，225rpm培养至0D600为0. 6，大约为3h左右；⑤将菌液分装到12个50ml无菌聚丙烯离心管中，冰上放置lOmin，然后4000rpm， 4°C离心IOmin收菌；⑥弃上清，倒置离心管Imin以彻底去除上清。每管加入25ml预冷的0. IM CaCl2, 轻轻混勻，冰上置30min ；⑦ 4000rpm，4°C离心 IOmin ；⑧弃上清，倒置离心管Imin以彻底去除上清。每管加入25ml预冷的0. IM CaCl2, 轻轻混勻；⑨此时感受态可以直接使用，若需长时间保存，可加入浓度为80 %的甘油，并使甘 油终浓度为20%，于-70°C保存。实施例6目的片段T-载体连接和转化取纯化的PCR产物加入pMD18-T载体及缓冲液(Takara公司，D101A, Japan)(参 照PMD18-T载体连接说明书)连接体系_连接液I5 μ 1PCR 产物4. 5 μ 1pMD18-T0. 5 μ 1_总体积10 μ 1_混勻，稍离心，16°C水浴12h以上。载体与基因片段的摩尔比1 4。①取50 μ 1感受态细胞，置于冰上，完全溶解后轻轻将细胞悬浮。②加入5 μ 1连接液，轻轻混勻，冰上放置30min。
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③42°C热激90s，冰上放置2min。④加入500 μ 1 LB培养基，于37°C 200rpm振荡培养lh。⑤室温下4000rpm离心lmin，用枪头吸掉400 μ 1上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。⑥将细菌涂布在加有氨苄抗生素的固体LB培养基上。⑦将平板于37°C倒置培养过夜。挑取单菌落白斑及蓝斑接入50 μ 1 LB+Amp液体培养基中混勻，以此为模板进行 PCR鉴定。同时设置阳性(PCR回收纯化后的产物为模板)和阴性(蓝斑菌液为模板)及 单引物作对照；琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。选择阳性克隆菌液，由北京诺塞基因测 序。测序结果显示两条目的片段均为1987bp，编码634个氨基酸，无内含子。实施例7杜梨和‘鸭梨’ GAI基因生物信息学分析将所得序列在http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov等网站上提供的软件中进行同源 性比较、分子量的预测；用DNAMAN(Lyrmon BioSoft)和BioEdit等软件进行多序列比对分 析、进化树绘制分析。在NCBI上Blast比对结果显示‘鸭梨’和杜梨GAI基因氨基酸序列与其他植物 的具有较高的相似性，其中与‘嘎拉’ MdRGL(Ia)和苹果‘富士’的相似性最高(97% )，其次 依次为小金海棠、湖北海棠和‘嘎拉’ MdRGL(Ib)。‘鸭梨’和杜梨GAI基因编码的氨基酸序 列包含有5个结构域(图2)，与已知的其他植物中的GAI基因的结构域LHR I ,VHIID,LHR II、PFYRE和SAW—致，证明克隆得到的序列为编码DELLA蛋白基因。因此，将其分别命名 为 YL-GAI 禾口 DL-GAI。通过DNAMAN构建YL-GAI、DL-GAI等14种植物GAI基因氨基酸序列的系统进化 树。该进化树显示，所获得的氨基酸序列与‘嘎拉’ MdRGL(Ia)、苹果‘富士’ MfGAI和小金海 棠MxGAI亲缘关系最近，与湖北海棠MhGAI 1、‘嘎拉，MdRGL(Ib)关系较近，与南瓜CmGAIP、 CmGAIPB及葡萄VvGAIl亲缘关系较远。而与拟南芥AtGAI、AtRGAl与芸薹属植物BoGAI、 BrGAI亲缘关系最远(图3)。本研究获得的系统进化树在一定程度上与植物学分类结果一 致。表明氨基酸的序列进化与植物的进化保持一致，同科植物在进化树上处于同一分支，而 亲缘关系较远的处于不同分支，且氨基酸的同源百分率也随物种亲缘关系的变远而变小。实施例8总RNA的提取植物材料总RNA的提取采用CTAB法(张玉刚等，2005)，从接穗、砧木叶片和茎段 中提取总RNA，用30 μ 1 DEPC水溶解，电泳检测后置_80°C冰箱保存备用。RNA 中 DNA 的去除①在500 μ L薄壁PCR管中加入_RNA2ug
无RNA酶的DNA酶缓冲液5 μ d
RNA酶抑制剂(40U/ μ 1)2μ 1
无RNA酶的DNA酶2μ 1
DEPC 水补足至50 μ 1
②37°C处理30min ；加入100 μ L无RNA酶的水(0. 1 % DEPC处理)；加入等体积氯 仿/异戊醇(24 1)混勻，冰浴IOmin ；③4°C IOOOOrpm离心IOmin ；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24 1)混勻， IOmin 冰浴；4°C IOOOOrpm 离心 IOmin ；④取上清，加入10 μ 1 IOM NH4AC,同时加入2. 5倍体积的无水乙醇，_20°C，30min ； 40C，12000rpm离心20min ；弃上清，沉淀加入适量75%乙醇弹起，7500rpm离心lOmin，洗涤 2次；真空吸净乙醇；⑤沉淀于低温下吹风机吹干，溶于50 μ L无RNA酶的水中，_70°C保存备用。实施例9 cDNA合成反转录体系(25 μ 1)及过程在无RNA酶的200ul薄壁管中加入如下试剂总RNA 2 μ 1，Oligo dT 1 μ 1，DEPC 水 12 μ 1，共 15ul 的混合物 5000rpm 混勻，放置 70°C 5min,马 上拿出放置于冰上，再加入以下部分=M-MLV 1 μ 1,5XM-MLV缓冲液2. 5 μ 1，RNA酶抑制剂 0. 6μ 1，dNTP (IOmM) 1. 25 μ 1，DEPC 水 4. 65 μ 1。加入以上共25ul体系的混合物，5000rpm混勻，42°C lh, 70°C IOmin,中止反应。所得到的cDNA作为下述PCR扩增的模板。实施例10杜梨和梨cDNA的GAI PCR扩增YL-GAI与DL-GAI基因核苷酸序列相似性高达99%，特异性引物很难设计，利用 RT-PCR的方法鉴定不可行。所以发明人根据已经获得的核苷酸序列，利用DNAMAN分析砧木 与接穗核苷酸序列间酶切位点，比较酶切位点之间的差异，选择砧木对接穗特异的酶切位 点，用Primer5. O与DNAMAN在其两端设计引物。即通过对两个基因酶切位点的分析，我们 筛选出一个特异的限制性内切酶HaplKTakara公司，D1053A)，即将‘鸭梨’与杜梨切成不 同大小的片段。采用酶切鉴定的方法验证GAI基因mRNA的传递。
基因内_弓丨物
大小(bp) 大小(bp)
上游引物5’-GGGATGC
24 24
AGTGGCCCGCTCT -3' GAI Hapll …认二丨 &36144 44
下游引物5’-GCTCCACCA
权利要求
一种杜梨GAI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.由权利要求1所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.一种‘鸭梨，GAI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.由权利要求3所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO 4所示。
5.一种GAI mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤(1)‘鸭梨’为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；(2)分析权利要求1和权利要求3所述基因的核苷酸序列，选择各自特异的酶切位点， 在此酶切位点的上下游分别设计引物；(3)分别提取杜梨、‘鸭梨’以及嫁接后砧木与接穗的总RNA，反转录成cDNA，PCR扩增 GAI的基因片段；(4)用所选的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图。
6.根据权利要求5所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述限制性内切酶为HapII。
7.根据权利要求5所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的用于提取接穗总RNA的样 品选自嫁接3 4天的叶片、茎尖、茎段韧皮部或嫁接口。
8.如根据权利要求5 7任一项所述的分子鉴定方法在其他梨属植物砧穗间GAImRNA 分子传递的鉴定上的应用。
全文摘要
本发明公开了杜梨和“鸭梨”GAI蛋白的氨基酸序列和编码该蛋白的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO1～4所示。本发明同时公开了GAI mRNA在杜梨和梨砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤1)、“鸭梨”为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；2)、寻找“鸭梨”和杜梨的GAI基因各自特异的酶切位点，在此酶切位点的上下游分别设计引物；3)、限制性酶切杜梨、“鸭梨”以及嫁接后的杜梨、“鸭梨”的RT-PCR产物，比较嫁接前后的酶切谱图鉴定传递情况。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于其他梨属植物。
文档编号C12N15/29GK101942453SQ20101026934
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者张文娜, 李天忠 申请人:中国农业大学