专利名称：一种水稻数量性状基因座(qtl)定位的方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻数量性状基因座(QTL)定位的方法，特别是涉及一种利用水 稻永久群体开展QTL定位时数量性状表型数据分析的方法。
背景技术：
水稻是世界上最重要的第一大粮食作物，也是我国最重要的粮食作物之一。水稻 绝大部分农艺性状诸如产量、品质、抗性等均受多基因系统的数量性状基因座(QTL)控制。 当前，水稻QTL定位、分离、图位克隆策略是解析多基因控制数量性状为单个孟德尔遗传因 子最为有效的方法，也是水稻数量性状基因挖掘与功能研究的重要途径。众所周知，构建水稻分子遗传图谱、发展统计模型以及准确测定数量性状表型值 是开展数量性状基因座(QTL)定位研究必不可少的三个重要环节。近年来，已有水稻分子 数量性状遗传研究的报道更多关注分子遗传图谱的构建与统计模型的发展。至今，很少有 关于利用水稻重组自交系群体(RIL)或加倍单倍体(DH)等永久群体开展QTL定位时株系 内抽取样本容量大小影响主效QTL定位的相关报道。一般情况，利用水稻F2或BC1F2分离 群体进行QTL定位时每类性状仅测定一个单株性状值。但这类分离群体不能同时用于多环 境下试验研究而不常用于开展QTL定位研究。目前，大部分水稻QTL定位研究项目选用RIL 或DH永久群体。通常情况，选用水稻永久群体开展QTL定位时，每类性状株系内调查5或 10株求平均值作为该株系性状表型值来进行QTL定位。然而，每类性状株系内测定过多单 株必将倍加了性状值测定的工作量。众所周知，测定性状值效率的高低直接影响着QTL定 位研究进程，特别是一些难以进行性状表型值测定的数量性状，例如根表面积、根直径、根 尖数目，以及一些重要的生理或生化指标性状值。倘若株系内单个性状测定过多单株，那么 性状测定的最佳时期将被错过，这将严重影响了 QTL研究进展，甚至很难获得一套完整用 于QTL定位的表型性状数据。因此，我们急需弄清楚利用水稻永久群体开展QTL定位时每 类性状株系内最佳抽取样本容量，该样本容量可以准确、可靠、高效的用于QTL定位研究。利用水稻永久群体开展QTL定位研究由来已久，该类群体能同时满足不同研究目 标和研究环境的需要，目前早已被国内外水稻遗传学家和育种学家广泛使用。在利用水稻 永久群体开展QTL定位研究，准确测定性状值将是开展高效QTL定位研究的重要环节之一。 但目前，尚未有关于株系内抽取样本容量大小影响稳定表达主效QTL定位研究的相关信息 报道。
发明内容
本发明要解决当今人们利用水稻永久群体进行数量性状基因座(QTL)定位时容 易导致株系内测定过多单株而错过最佳性状考察期，难以获得一套完整用于QTL定位的性 状表型数据进而严重影响QTL定位研究进程的问题。为此本发明提供一种水稻数量性状基 因座(QTL)定位的方法，通过本发明的方法实施以及取得的研究结果，能很好地指导人们 准确、高效、可靠地检测在不同环境下稳定表达的主效QTL。
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水稻永久群体株高性状每株系内完全随机调查5个单株，命名为pha、phb、phc、 phd、phe.共获得26套一系列株系内5个单株完全随机组合2株、3株、4株和5株性状平 均表型值，株系内完全随机组合2或3株分别获得10套性状表型数据。命名为phab、phac、 phad、phae、phbc、phbd、phbe、phcd、phce、phde ；phacd、phabe、phabd、phabc、phbcd、phbde、 phade. phcde、phace. phbce ；株系内完全随机组合4株以及5株所求平均性状表型值分别 为 phabde、phacde、phabcd、phabce、phbcde 禾口 phabcde。利用分子遗传图谱、复合区间作图法(CIM)、株系内5个单株以及26套完全随机组 合性状表型均值对控制株高性状进行QTL定位，选用多区间作图法(MIM)对CIM作图法所 检测到的主效QTL进行存在与否的验证。所述主效QTL能在不同环境条件下同时被株系内5个单株和26套完全随机组合 的性状表型值分别检测到。所述主效QTL定位不受株系内抽取样本容量大小的影响。我们在利用水稻永久群 体开展QTL定位时株系内抽取样本容量大小不影响稳定表达的主效QTL的检测结果。每类 性状株系内测定一个单株和同时测定多个单株性状值求均值来分别进行主效QTL定位，其 定位结果没显著差异。上述单一步骤其他内容为公知技术，在此不再赘述。本发明的有益效果是，利用水稻数量性状基因座(QTL)定位的方法，特别是数量 性状表型数据分析的方法，很好的探索在利用水稻永久群体开展QTL定位时每类性状株系 内抽取样本容量大小对主效QTL定位结果的影响。研究结果表明株系内样本容量的大小 对主效QTL定位结果没有任何影响，这将为遗传学家和育种学家在利用水稻永久群体开展 QTL定位时的田间表型实验设计提供指导，有助于利用永久群体开展准确、高效、可靠的水 稻QTL定位研究。
图1表示位于水稻第3染色体上的主效QTL同时被水稻重组自交系群体株系内5 个单株和26套完全随机组合性状表型数据在2006年和2009年两个不同环境条件下检测 到；图2表示位于水稻第7染色体上的主效QTL同时被重组自交系群体株系内5个单 株和26套完全随机组合性状表型数据在2006年一个环境条件下检测到；具体实施方式
在说明实施方式前，先对其中的术语作如下解释分子遗传连锁图谱染色体的交换与重组是遗传图谱构建的理论基础，利用分子 标记构建遗传图谱的基本原理是根据标记在分离群体中的共分离情况来确定它们的连锁 关系而建立连锁群。具体步骤包括选择亲本和分子标记、构建遗传群体、构建连锁群。遗 传连锁图谱以遗传距离表示标记与标记之间的相对位置(不是实际的物理距离)，它是建 立在统计分析的基础上，通过计算在分离群体中两个标记的交换值，将交换值转化为遗传 距离(厘摩cM)。微卫星(SSR)标记由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十 个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位次数的不同或重复程 度的不完全相同，造成了 SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列。因此，可以用微 卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位 点在不同个体间的多态性。优点1)标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条 染色体上；2)共显性标记，呈孟德尔遗传分离规律；3)技术重复性好，易于操作，结果可靠； 4)标记结果可直接用于水稻分子标记辅助选择育种。复合区间作图法(CIM) :CIM法又叫多标记QTL定位法，是一种基于全基因组所有 标记进行QTL定位及效应分析的作图方法。CIM法以IM法为基础，仍采用QTL似然图来显 示QTL的可能位置及显著程度，在假定不存在上位性效应的条件下，把特定标记区间外的 其他标记拟合到模型中，充分利用了整个基因组的标记信息，在较大程度上控制了背景的 遗传效应；用类似于单区间作图的方法，计算各参数的LOD值及显著性，绘制各染色体的似 然图谱，标出各QTL的可能位置，可以较好地处理多QTL连锁的情形，改善了作图的精度和 效率。数量性状基因座(QTL)指控制数量性状表现的数量基因在连锁群中的位置。数 量性状的变异呈连续性，杂交后的分离世代不能明确分组。数量性状一般容易受环境条件 的影响而发生变异，而这种变异一般是不能遗传的。控制数量性状的基因在特定时空条件 下表达，不同环境条件下基因表达的程度可能不同，因此数量性状普遍存在着基因型与环 境互作。本发明的方法具体实施过程1、材料与方法(1)供试材料2002年选用中国第一个商业超级杂交稻组合“协优9308”双亲配制“协青早B (株 高94. 6cM) X中恢9308 (株高119. 3cM) ”杂交组合并获得F1经单粒传法构建含有226个株 系重组自交系群体。株高性状在双亲呈显著表型遗传差异且在重组自交系群体中表现连续 分布，同时该性状比较容易准确测定。所选定位群体和定位数量性状均较适应于本方法的 实施。同时“协优9308”为中国水稻研究所选育的超级杂交水稻，株型紧凑，分蘖中等偏弱， 茎杆粗壮，耐肥抗倒，剑叶挺，后期青杆黄熟，转色好，首批被国家农业部认定的超级杂交稻 品种之一。(2)分子遗传图谱本方法实施所用分子遗传图谱以“协青早BX中恢9308”重组自交系群体281 个株系构建分子遗传图谱为定位图谱。该图谱包含199个SSR标记，标记序列公布于 (http://www. gramene. org/)，SSR标记均勻分布于水稻12条染色体，图谱覆盖水稻基因组 全长1765. 6cM，相邻标记间平均图距为8. 87cM，该图谱适合QTL定位研究，绘图所用软件为 MapMaker/EXP3. OVersion0(3) QTL作图软件及方法本方法实施所采用软件为WinQTLCart 2. 5版软件。应用复合区间作图法(CIM) 和多区间作图(MIM)进行主效QTL定位并对其存在与否进行验证，估算主效QTL的遗传参数。在2006年、2009年夏季分年将含有226个株系的“协青早BX中恢9308”重组自 交系群体及双亲种植于浙江富阳中国水稻研究所试验基地，选择肥力均勻田块，按照株行
5间距20cMX 23cM的规格实验材料，每株系种植4行，每行6株。用于本方法实施研究的数 量性状为水稻株高。重组自交系群体性状株高株系内完全随机测定5个单株；命名为pha、phb、phc、 phd、phe.共获得26套一系列株系内5个单株完全随机组合2株、3株、4株和5株性状平 均表型数据，株系内完全随机组合2或3株分别能获得10套性状表型数据，命名为phab、 phac> phad> phae、phbc、phbd、phbe、phcd、phce、phde ；phacd> phabe> phabd> phabc、phbcd、 phbde,phade,phcde,phace,phbce ；株系内完全随机组合4株和5株，获得6套性状表型数 据，为 phabde、phacde、phabcd、phabce、phbcde 和 phabcde。利用构建 RIL 分子遗传图谱、复 合区间作图法(CIM)、株系内5个单株和26套完全随机组合性状表型数据对株高性状分别 进行QTL定位，选用多区间作图法(MIM)对CM所检测到的主效QTL的存在与否进行验证。 结果发现，在第3、第7染色体上分别被株系内5个单株和26套完全随机组合性状表型数 据同时检测到2个控制株高的主效QTL(图1、图2)。位于第3染色体上Qph3 (RM148-RM85) 能同时被31套株高表型数据在2006年、2009年两个不同环境条件下检测到。位于第7染 色体控制株高Qph7a(RM3670-RM2)能同时被31套株高表型数据在2006年一个环境下检测 到。同时发现稳定表达的主效QTL定位结果不受株系内抽取样容量大小的影响。因此，本 方法很好的诠释了利用水稻永久群体开展QTL定位时株系内抽取样本容量大小影响QTL定 位结果的问题。本发明采用QTL作图技术，利用水稻永久群体开展数量性状基因定位，创建了一 种数量性状基因座QTL定位研究时田间性状表型数据分析的新方法，丰富了 QTL定位研究 所表型性状表型数据，提高了 QTL定位研究的准确性、可靠性，必将加快QTL定位研究进程。最后，还需要特别注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发 明不仅仅限于以上实施例子，还可以有许多变通的情况。本领域的技术人员从本发明公开 的内容直接推导出或联想到的所有变通情况，均认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种水稻数量性状基因座(QTL)定位的方法，其特征在于选用双亲农艺性状存在显著差异的水稻重组自交系(RILs)永久群体作为QTL定位群体；选用分子微卫星(SSR)标记构建分子遗传连锁图谱；调查水稻永久群体株高性状株系内完全随机的5个单株，该单株性状表型值分别命名为pha、phb、phc、phd、phe，总共获得26套株系内5个单株完全随机组合2株、3株、4株以及5株性状表型数据，其中株系内完全随机组合2株求平均值获得10套性状表型数据，命名为phab、phac、phad、phae、phbc、phbd、phbe、phcd、phce、phde；完全随机组合3株也获得10套表型数据，命名为phacd、phabe、phabd、phabc、phbcd、phbde、phade、phcde、phace、phbce；完全随机组合4株以及5株共获得6套表型数据，命名为phabde、phacde、phabcd、phabce、phbcde和phabcde；利用所述分子遗传连锁图谱，用WinQTLCart 2.5版软件的复合区间作图法(CIM)，以及株系内5个单株和26套完全随机组合株高性状表型数据，对控制株高性状基因进行QTL作图，用多区间作图法(MIM)对CIM作图法所检测的主效QTL的存在与否进行验证。
2.如权利要求1所述的一种水稻数量性状基因座(QTL)定位的方法，其特征在于所 述主效QTL能在不同环境条件下同时被株系内5个单株和26套完全随机组合的性状表型 数据分别同时检测到。
全文摘要
能指导人们准确、高效、可靠地检测主效QTL的一种水稻数量性状基因座定位的方法选用双亲农艺性状存在显著差异的水稻重组自交系(RILs)永久群体作为QTL定位群体；选用分子微卫星(SSR)标记构建分子遗传连锁图谱；调查水稻永久群体株高性状株系内完全随机的5个单株的性状表型值以及26套由5个单株完全随机组合2株、3株、4、5株的性状表型数据；利用所述分子遗传连锁图谱，用WinQTLCart 2.5版软件的复合区间作图法(CIM)，以及株系内5个单株和26套完全随机组合株高性状表型数据，对控制株高性状基因进行QTL作图，用多区间作图法(MIM)对CIM作图法所检测的主效QTL的存在与否进行验证。本发明可用于水稻数量性状基因座定位。
文档编号C12Q1/68GK101974620SQ201010269959
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者曹立勇, 梁永书, 程式华, 高志强 申请人:中国水稻研究所