受稻瘟菌诱导的启动子及其应用的制作方法

专利名称：受稻瘟菌诱导的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中水稻受稻瘟菌诱导的启动子及其应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻 最主要的病害之一，严重影响了水稻的产量和品质。到目前为止，稻瘟菌病害的防治还没 有得到有效的解决，植物抗病基因工程的发展为水稻稻瘟菌病害的防治提供了一条新的途 径，从而引起了人们广泛的关注。植物在与病害长期的互作进化过程中，逐渐获得了一系列抵御逆境、保护自身免 受其害的抗性防御机制。植物抗病性可以概括为植物的抗病基因识别病源物信号一信号 传递一防卫基因表达一植保素合成的过程。植物与病原菌相互作用的结果是诱导植物中与 抗病相关防卫基因的表达，继而调控下游代谢途径合成植保素等次生代谢产物，从而发挥 抵抗病原物侵害的作用。植物防卫基因主要包括编码苯丙氨酸解氨酶(Ehenlalanine ammonialyase,PAL) 和查尔酮合酶(Qialcone synthase, CHS)等基因，它们是植保素(phytoale_xins，PA)、木 质素(Iignin)等抗菌活性物质生物合成途径中的关键限速酶，在植物抗病防御反应中发
挥着重要作用。PAL基因是植物防御反应中早期被诱导表达的关键的防卫基因之一，其对病原 菌及病原菌诱导物的应答调控是在转录水平上进行的，即病原菌及其诱导物的侵染信号 被PAL基因启动子上的诱导应答元件(inducible cis-element)所识别，调控植物的抗 病防卫反应活性。应答调控元件指的是在同一条核苷酸链上调控基因表达活性的DNA 序列。Minami 及 Zhu 等(Minami E，Ozeki Y，Matsuoka M，et al. Structure and some characterization of the gene for phenylalanine ammonia-lyase from rice plants.， Eur. J. Biochem. (1989) 185 :19_25 ；Minami E，Tanaka Y，et al. Nucleotide sequence of the gene for phenylalanine ammonia-lyase of rice and its deduced amino acid sequen ce.Biochim. Biophys. Acta. (1993) 1171 :321_322 ；Zhu Q，Dabi T，Beeche A，et al.Cloning and properties of a rice gene encoding phenylalanine ammonia-lyase. Plant Mol.Biol. (1995)29:535-550)分别从水稻中克隆到三个PAL基因，分别是GP_1、 GP-28和ZB8PAL，其中ZB8PAL基因受伤害、病毒以及真菌诱导物的诱导。1998年Kervinen 等(Kervinen PS,Teeri TH. Differential expression of phenylalanine ammonia-lyase genes in barley induced by fungal infection or elicitors. New Phytol. (1998) 139: 293-300)从大麦的根中分离到四个PAL基因，它们受HgCl2、病原诱导物的诱导。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明所提供的DNA分子，来源于水稻(Oryza satvia L.)，是如下1)_3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列选自序列表中序列1，且具有序列表中序列1自5’末端第868位 到1101位的核苷酸序列，同时其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第 1位到868位中的任一位置；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述DNA分子为如下1) -9)中任一所述的DNA分子1)其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第868位 中的任一位置；2)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第868位中 的任一位置；3)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第693位到第868位中 的任一位置；4)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的 任一位置；5)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第693位中 的任一位置；6)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第693位中 的任一位置；7)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第532位中的 任一位置；8)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第532位中 的任一位置；9)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的
任一位置。所述DNA分子为如下1) -5)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位到第1101位的序列；2)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3 11位到第1101位的序列；3)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第532位到第1101位的序列；4)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第693位到第1101位的序列；5)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第868位到第1101位的序列。所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列2所示。含有所述DNA分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发 明所保护的内容。本发明的又一个目的是提供所述DNA分子在启动基因转录中的应用，所述转录受 稻瘟病菌诱导中的应用，最终达到培育抗稻瘟病植物的目的。本发明有助于将水稻中受稻瘟菌诱导的启动子应用于增强植物抗病防御反应速率的分子育种中，具有重要的实践意义。


图1为稻瘟病菌粗提物诱导处理后水稻愈伤组织中rPAL_P5基因的转录活性检 测。其中，A为对照水以及稻瘟病菌粗提物诱导处理后水稻愈伤组织中rPAL-P5基因的 mRNA沉积；B为对照水以及稻瘟病菌粗提物诱导处理后水稻愈伤组织中rPAL-P5基因的 Northern blot 分析。图2为rPAL_P5基因转录的基础启动子序列(_45 +145)及OsACRE序列 (-89 -45)。图 3 为质粒 pCAMBIAl38IT-DNA 结构。图4为pR-1 X OsACRE和pR_3 X OsACRE报告质粒构建流程。图5为pE-OsACBFl效应质粒的构建流程。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、rPAL_P5基因启动子序列的获得及其转录活性的检测一、rPAL-P5基因启动子序列的获得 根据已发表的水稻ZB8PAL基因序列设计一对引物，rPAL-P5-promoterP 1 5' -TCGCGCCTACTGACCTACGTAT-3‘，此引物序列位于rPAL_P5基因启动子区域，距离翻译 起始位点 ATG 上游约 Ikb ；rPAL-P5-promoterP2 5' -ACCATGCGCTTCACCTCGTC-3‘，此引物 序列位于rPAL-P5基因外显子1区域，与翻译起始位点ATG相距330bp。以水稻品种爱知旭 (公众可从北京大学获得，记载过该材料的非专利文献是Lin RM, Zhao WS, Meng XB, Wang M,Peng YL. Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC—domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea. Plant Science(2007) 172 :120-130) 的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到含有rPAL-P5基因启动子序列，得到长度为 1.4kb的特异性片段并测序。PCR反应体系如下
去离子水39 μ L
dNTP2μ L
正向引物1 μ L
反向引物1 μ L
模板1 μ L
10 X Taq酶反应缓冲液5 μ L
Taq酶1 μ L
总体积50 μ L
PCR反应程序如下
预变性 94 °C2分钟
变性 94 °C60秒
退火60 °C延伸72 °C循环次数35次终末延伸72 °C
70秒 90秒
10分钟二、稻瘟病菌诱导下rPAL_P5基因转录活性的检测以136bp特异的rPAL-P5基因的转录非翻译区DNA序列为探针(+1 +136 :5，_A AGAAGAGCCGCACCATCCAGTGCAGTAGTACACTAGCTCTTCTTCACAACAGCTAATCGAGTAGCTAGAACCATTAT ATACTCTTCTCTCGACGCTTTCTGTGCTAGGTTAACCGATCCATCTTCTGGTACTGAA-3，)，测定了爱知旭非 亲和小种131稻瘟病菌(公众可从北京大学获得，记载过该材料的非专利文献是Lin RM, Zhao WS, Meng XB, Wang M, Peng YL. Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea. Plant Science (2007) 172 =120-130)诱导粗提物处理不同时间的水稻愈伤组织中rPAL_P5基因的 转录水平。爱知旭非亲和小种131稻瘟病菌诱导粗提物的制备方法如下稻瘟病菌接于固体燕麦培养基，28°C黑暗培养7-8天后用无菌水将表面的菌丝洗 下，重新接于固体燕麦培养基活化4-5天；用无菌水将表面菌丝洗下，盖上两层纱布，光照 下培养2-3天后用水将孢子洗下；镜检后将孢子浓度调节到1. OX 105Cfu/mL-l. OX IO6Cfu/ mL。将无菌水洗下的菌丝接于燕麦液体培养基，置于28°C、暗处振荡(200rpm)培养4_5天； 10，OOOrpm离心5分钟收获菌丝，用蒸馏水洗3_4次后加入适量蒸馏水，并用玻璃研钵将菌 丝体研碎；于10，OOOrpm离心5分钟后，收集上清并高压灭菌，即得到稻瘟病菌诱导粗提物。爱知旭非亲和小种131稻瘟病菌诱导粗提物处理水稻愈伤组织的方法如下水稻品种爱知旭成熟种子去皮，清水洗净；用灭好菌的去离子水配制20%的次 氯酸钠(NaClO)和70%酒精；在超净台中将洗好的种子至于三角瓶内，用70%的酒精洗 2-3遍，时间控制在30秒内；用20% NaClO洗1-2遍，放于摇床上摇20-25min，再利用 20% NaClO洗一次；用无菌水洗3-4遍，置于滤纸上阴干；将灭菌种子放于N6+2mg/L2，4-D 培养基上，避免胚部直接接触培养基；黑暗培养3周，选择色泽鲜黄的愈伤组织转入新的 N6+2mg/L 2，4-D培养基继续培养；将小块的水稻愈伤组织(约Ig)浸泡在稀释5倍的上 述诱导粗提物中，于25°C、IOOrpm黑暗处培养，并在不同时间取样，液氮速冻后，于-70°C保 存；同时以水进行同样处理的水稻愈伤作为对照。通过Northern blot分析，结果如图1所示，在诱导物处理水稻愈伤组织1小时后 即可检测到少量rPAL-P5基因的转录产物，3小时后mRNA的沉积达到最高水平，约为水处理 对照组的20倍，到6小时已明显降低，12小时几乎恢复到原来正常的水平，而在水处理对照 组的水稻愈伤组织中几乎检测不到rPAL-P5基因转录产物。此结果说明稻瘟菌诱导物能够 激活rPAL-P5基因的转录活性，而且诱导转录活性的高峰期为诱导后约3小时。实施例2、受稻瘟菌诱导的启动子的获得及其功能验证—、受稻瘟菌诱导的启动子的获得以实施例1中获得的水稻品种爱知旭长度为1. 4kb的特异性的rPAL_P5基因启动 子序列为模板进行PCR扩增，在rPAL-P5基因启动子的不同位点设计引物，分别为-956 -935(rPP-a-BamHI) :5，-cgggatccTCGCGCCTACTGACCTACGTAT-3，，
-646 -627(rPP-b-BamHI) :5，-cgggatccCATTCTGAATAGGGCATGCA-3，，-425 -406(rPP-c-BamHI) :5，-cgggatccCACACCAACTTCCATCCATA-3，，-264 -245(rPP-d-BamHI) :5，-cgggatccAGACGCAGCAAGTCCGTCGC-3，，_45 _26 (rPP-e-BamHI) :5，-cgggatccACCCACCCGCCTATTTAAGC-3，(小写字母为 BamHI酶切位点)和+126 +145(P-a-HindIII) :5，-aagcttGCACTCCATTTCAGTACCAG-3，(小写字母为 HindIII酶切位点)为引物，进而PCR扩增得到了一系列长度不同的5’端完整及缺失启动子片段以 引物-956 -935 (rPP-a)和 +126 +145 (Ρ-a)扩增得到了 rPPa(-956 +145)(该扩增 产物的核苷酸序列为序列表中序列1)；以引物-646 -627(rPP-b)和+126 +145 (P_a) 扩增得到了 rPPb(-646 +145)(该扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末 端第311到1101位)；以引物-425 -406 (rPP-c)和+126 +145 (P_a)扩增得到了 rPPc(-425 +145)(该扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第532到1101 位)；以引物-264 -245 (rPP-d)和 +126 +145 (Ρ-a)扩增得到了 rPPd(-264 +145) (该扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第693位到1101位)；和以引 物-45 -26 (rPP-e)和+126 +145 (Ρ-a)扩增得到了 rPPe (-45 +145)(该扩增产物的 核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第912位到1101位)。将rPPa rPPe 5个启动 子基因片段分别连接于植物转化载体pCAMBIA1381Xa(购自澳大利亚Cambia公司)的⑶S 基因上游的BamHI和HindIII酶切位点之间，构建出一系列5’端缺失启动子的⑶S表达 质粒(rPP-GUS)含有rPPa的载体rPPa_GUS、含有rPPb的载体rPPb_GUS、含有rPPc的载 体rPPc-GUS、含有rPPd的载体rPPd-GUS、含有rPPe的载体rPPe_GUS。同时，在植物转化 载体pCAMBIA1381Xa的⑶S基因上游的BamHI和HindIII酶切位点之间连入35S启动子， 此 35S 启动子是以 pCAMBIA1381Xa 质粒为模板，以引物 35S-P1 :5，-gcggatccAACATGGTGGAG CACGACACTCTCG-3，和 35S-P2 :5，-ccaagcttAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT-3，为引物，扩增 得到pCAMBIA1381Xa载体上第9810-10593位的35S启动子DNA序列，用限制性核酸内切酶 BamHI和HindIII酶切后连接于pCAMBIA1381Xa载体中，构建出含有35S启动子的⑶S表达 质粒(35S-GUS)。测序结果表明，各嵌合基因的读码框都正确。使用基因枪法分别将上述5个rPP-GUS质粒转化水稻愈伤组织，同时用35S-GUS 质粒转化水稻愈伤组织作为对照，然后将液体培养的转化水稻愈伤组织分别经稻瘟病菌诱 导粗提物和无菌水处理(处理方法同实施例1)8小时(经测定8小时PAL酶活达到最大) 后进行GUS荧光值测定，以它们受诱导物诱导后GUS活性与受水诱导后GUS活性的比值， 即E/W值，检测稻瘟病菌对上述5个启动子的诱导情况。实验设3个克隆愈伤组织作为重 复。检测结果如下E/W比值为转基因水稻愈伤组织经诱导物(E)或水(W)处理8小时后 ⑶S活性的比值。因为已知35S启动子是一个组成型表达的强启动子，因此35S-GUS质粒 转化的水稻愈伤组织虽然在水或诱导物处理后都有较高的GUS活性，但是它们的比值(即 Ε/ff)却接近于1，这与其组成型表达的特性是相符的，表明35S启动子没有受到稻瘟菌的 诱导，而缺乏⑶S基因启动子的pCAMBIA1381Xa质粒的转化水稻愈伤组织在两种处理下都 检测不到⑶S活性；但是分别含有缺失启动子rPPa(-956 +145)、rPPb (-646 +145)和 rPPc (-425 +145)的质粒rPPa_GUS、rPPb-GUS和rPPc_GUS转化的水稻愈伤组织，它们
8的E/W值为3，表明这3个启动子受稻瘟菌诱导物处理后其活性约为水处理对照组的3倍， 即3个启动子对稻瘟菌诱导具有应答活性并可以提高下游基因的表达；而含有缺失启动子 rPPd (-264 +145)的质粒rPPd_GUS转化的水稻愈伤组织的E/W值为1. 6，较前3者的诱 导活性降低了约1/2 ；含有缺失启动子rPPe (-45 +145)的质粒rPPe_GUS转化的水稻愈伤 组织的E/W值为1. 1，与35S-GUS质粒转化的水稻愈伤组织的E/W值接近，因此-45 +145 序列确定为能够使rPAL-P5基因转录的基础启动子(mini-promoter)，其中包括TATAbox和 转录起始位点(+1)(图2)。以上结果说明在rPAL_P5启动子-425 -45区域存在与稻瘟病菌诱导相关的顺 式元件，通过与PLACE数据库(www. dna. affrc. go. jp)进行比对，发现-89 -45区域里面 存在AC-rich顺式元件区域(图2中所示的-89 -45核苷酸序列)，即为稻瘟病菌诱导应 答调控元件区域。将该诱导应答调控元件命名为OsACRE(AC-rich element)。实施例3、诱导应答调控元件OsACRE与反式作用因子OsACBFI的相互作用。一、反式作用因子OSACBFI的获得以三个拷贝串联重复的OsACRE作为诱饵序列，从稻瘟病菌诱导0. 5,1. 0、1. 5小时 的水稻愈伤组织mRNA混合制备的cDNA文库中筛选出与OsACRE相互作用的反式作用因子， 命名为 0sACBFl(0ryza sativa AC-rich element binding factor 1)。通过体夕卜 EMSA 方 法证实诱导应答调控元件OsACRE与反式作用因子OsACBFI可以结合；同时在酵母体内表达 的蛋白OsACBFI与OsACRE特异性结合后可以激活下游报告基因(LacZ，相当于PAL基因的 替换)的转录活性。二、通过烟草瞬时表达系统验证诱导应答调控元件OsACRE与反式作用因子 OsACBFI的相互作用为了在植物体内证实诱导应答调控元件OsACRE与反式作用因子OsACBFI的相互 作用，我们利用不同的报告质粒(Importer，pR_l X OsACRE和pR_3 X OsACRE)和效应质粒 (Effector, pE-0sACBFl)对烟草叶片进行共转化瞬时表达，测定⑶S报告基因的活性。l、pR_lX0sACRE和pR_3X0sACRE三重复串联顺式作用元件报告质粒(Iteport er plasmid)的制备以 rPAL-P5 基因为模板，用如下一对引物，OsACRE-Pl :5，-ccaagcttACCAGACCATCA CAACCCCCCTCCGTCAT-3，(此引物序列位于rPAL_P5基因启动子-89 -60，带有HindIII酶 切位点)和 0sACRE-P2 :5，-ctactagtGCACTCCATTTCAGTACCAG-3，(此引物序列位于 rPAL_P5 基因的+126 +145，带有SpeI酶切位点)，进行PCR扩增，得到rPAL_P5基因的1 X OsACRE 序列(图2中的-89 +145位，即序列表中序列1的第868位到第1101位)。并克隆入 pCAMBIA1381Xa质粒(购自澳大利亚Cambia公司)，得到质粒pR_l X OsACRE。之后直接 合成2XOsACRE (2X (-89 -45)，长度为90bp)，两端分别带有BamHI和HindIII酶切位 点，并克隆入 pCAMBIA1381Xa-l XOsACRE (pR-1 XOsACRE)质粒，得到质粒 pR_3X0sACRE。 pCAMBIAl38IT-DNA结构如图3所示。pR-1 XOsACRE和pR_3X0sACRE报告质粒构建流程如 图4所示。3X0sACRE的核苷酸序列如序列表中序列2所示。PCR反应程序如下预变性94 °C 2分钟变性95 °C 10 秒
退火延伸
58 0C 30 秒 72 0C 15 秒循环次数30次终末延伸 72°C10分钟2、表达反式作用因子的植物效应质粒pE-OsACBFl (Effector plasmid)的构建植物效应质粒pE-OsACBFl的构建步骤如下(1)以pGADT7 5' KpnI和pGADT7 3‘ BamHI为引物，以水稻叶片的cDNA为模板， PCR扩增出含有KpnI和BamHI位点的OsACBFIcDNA片段。引物序列为pGADT7 5' KpnI 5，-ccggtaccATGGAGTTGCATCTGAACAACGTGG-3，和 pGADT7 3' BamHI :5，-gcggatccTCAATGG TGGTGGTGATGGCGGCTT-3‘。(2) KpnI 和 BamHI 酶切 OsACBFl PCR 产物并回收 OsACBFI 片段；KpnI 和 BamHI 酶 切pRTL2 (购自Invitrogen公司)，回收质粒；(3)连接步骤(2)中获得的OsACBFl片段和酶切质粒，然后利用氨苄青霉素钠(终 浓度为50 μ g/mL)筛选阳性质粒pRTL2-HA-0sACBFl ；(4) Hindi11 酶切 pRTL2-HA_0sACBFl，回收 35S-HA_0sACBFl ；(5)将pCAMBIA1381Xa使用HindIII单酶切，去磷酸化，回收；(6)将步骤(4)回收的35S-HA-0sACBFl和步骤(5)回收的酶切质粒连接，利用卡 那霉素(终浓度为50 μ g/mL)筛选阳性1381-HA-OsACBF 1质粒，即pE-OsACBFl。质粒pE-OsACBFl的构建流程如图5所示。同时，将实施例2中基础启动子(mini-promoter)(即含有-45 +145序列)克 隆入pCAMBIA1381Xa质粒，构建重组载体pC-mini。3、反式作用因子和顺式作用元件互作的检测(1)农杆菌的培养和处理(土壤农杆菌感受态的制备和转化)挑取 1 个新鲜的农杆菌 EHA105 (购自 http //www. ρ green, acuk. com)菌落到 2mL 液体LB (加入利福平终浓度为10 μ g/mL)中28°C、250rpm培养48小时后转入50mL新鲜 的液体LB (加入利福平终浓度为10 μ g/mL)继续培养3小时。菌液4°C，4，OOOrpm离心5 分钟，去上清。用无菌的IXTE重悬细胞，然后4°C，4，OOOrpm离心5分钟。用5mL无菌的 IXTE重悬细胞。取200 μ L感受态细胞，加入待转化的质粒pR-lX0sACRE、pR-3X0sACRE 报告质粒、效应质粒pE-OsACBFl、质粒pC-mini以及质粒35S-GUS，分别为500ng，冰上放置 30分钟，液氮速冻30秒后放入42°C水浴中热激90秒，然后冰上放置5分钟；加入800 μ L LB培养基28°C恢复培养1小时；将培养后的菌液铺在含10 μ g/mL利福平，50 μ g/mL卡那 霉素的LB固体培养基上筛选阳性转化农杆菌，28°C培养2天，筛选出具有卡那霉素抗性的 农杆菌即为阳性转化农杆菌。(2)转化后的土壤农杆菌的培养和处理从平板上挑取阳性转化农杆菌菌落接种到2mL含有10 μ g/mL利福平和50 μ g/mL 卡那霉素的LB液体培养基中，28°C培养24小时后按1 100的比例转接到含有10 μ g/mL 利福平、50 μ g/mL卡那霉素、20 μ M的乙酰丁香酮和10mmol/L无水2-吗啉乙磺酸(MES)的 LB液体培养基中，继续培养到0D600大于或者等于1时，将菌液4，OOOrpm离心5分钟，去上 清。再用浸染缓冲液(Infiltration Buffer 150 μ M AS, 10mmol/L MES，IOmmo 1/L MgCl2)重悬细胞(0D600 = 1)。然后将重悬液室温静置3小时备用。(3)烟草叶片农杆菌渗透转化(Agroinfiltration)共转化1体积含报告质粒(Iteporter)的菌液加1/5体积的含效应质粒 (Effector)的菌液1体积pR_l XOsACRE菌液加1/5体积的pE-OsACBFl菌液；1体 积pR-3XOsACRE菌液加1/5体积的pE-OsACBFl菌液；1体积pC-mini菌液加1/5体积 的pE-OsACBFl菌液；对照为未加入效应质粒菌液的报告质粒菌液PR-lX0sACRE菌液、 pR-3XOsACRE菌液、pC-mini菌液以及35S-GUS菌液。选取植株生长、发育状态一致的叶 片大小近似(约90%成熟叶片大小)的烟草(Nicotinana tabacum)叶片作为注射备用叶 片。用IOmL注射器吸取菌液，再用针头在叶片上扎直径约2mm的小孔(穿过叶片)，去掉针 头，用手指尖托着叶片背面小孔处，将注射器头轻压在小孔上，将菌液注入叶片(需要掌握 力度，太轻和过重都难将菌液均勻注入叶片)。随后，将植株用塑料袋套上，保湿，弱光下培 养36小时后取样。(4)植物材料的采集用打孔器在注射孔附近取样，将一部分叶盘用1. 5mL离心管保存在_80°C，以备定 量测定GUSA基因的表达活性。取少量新鲜叶盘直接用GUS染液染色，定性观察GUSA基因 的表达活性。(5)⑶S活性检测取少量叶盘直接浸泡在⑶S染液中，37°C反应4-6小时，然后用75%的乙醇脱色， 定性观察GUSA基因的表达活性，按以下成分配制X-Gluc染色液N、N-二甲基甲酰胺500 μ LX-Gluc5mg1 OOmmo 1/L 磷酸缓冲液 pH7. O9800 μ L5mmol/L 铁氰化钾IOOyL5mmol/L 亚铁氰化钾IOOyLTriton X-10010 μ L总体积IOmL⑶S基因表达活性的定量测定方法如下取约IOOmg的注射后的烟草叶片，加入少量酸洗过的沙(Sigma公司)，再加入 200 μ L GUS缓冲液[50mmol/L的磷酸钠缓冲液(ρΗ7· 5)，IOmmol/L的巯基乙醇，0. 1% (V/ V)的 TritonX-100, IOmmol/L 的 EDTA]，冰上研磨；12，000rpm，4°C离心 5 分钟；取 50 μ L 上 清到0. 35mL⑶S缓冲液中，其他上清留存用于测蛋白浓度；37°C保温5分钟；加入100 μ L 5mmol/L的4_MUG(4_甲基伞形酮葡萄糖苷酸)(终浓度lmmol/L)(购自Sigma公司)；37°C 保温；不同时间点取样分别于10、30、60、90分钟取100 μ L样品至IJ 3. 9mL 0. 2M的碳酸钠 溶液中(碳酸钠用来终止反应，并且可以增强荧光强度)。将终止反应的样品保存于黑暗 处待测。用日立-850型荧光分光光度计测定各样品Ex365/Em455的值；配制一系列浓度的 4-MUG，建立GUS荧光标准曲线。根据标准曲线可以精确测定反应体系中的4-MU (4-甲基伞 形酮)的量。⑶S活性用4-MU pmol/mg · min表示。⑶S基因表达活性的定量测定的结果如下所选用的mini promoter是有效的基 本启动子，对下游⑶S基因的启动表达活性很低，⑶S活性为115士 12 pmol/mg -min ；在没有外源因子OsACBFI时，OsACRE也可以启动GUS基因表达，GUS活性为200士30pmol/mg ·π η， 是基本启动子所启动的⑶S活性的2倍，3个重复OsACRE下游的⑶S活性是321 士 16pmol/ mg ·π η，是基本启动子所启动的GUS活性的3倍，应该是烟草中含有可以和OsACRE元件相 互作用的因子；当外源因子OsACBFI存在时，如果启动子中只插入一个拷贝的OsACRE，下游 ⑶S基因的表达活性为1089士 115pmol/mg -min,比没有外源因子OsACBFI时的GUS活性提 高约5倍；而这种激活作用可因为顺式元件序列数目的增加而加强，当有三个重复串联的 OsACRE存在时，⑶S基因的表达活性为3525士227pmol/mg · min,比没有外源因子OsACBFI 时的GUS活性提高10倍以上；因为已知35S启动子是一个组成型表达的强启动子，因此带 有35S启动子的pCAMBIA1381Xa质粒的烟草叶片瞬时表达体系中没有OsACBFI存在时，也 具有较高的⑶S活性，⑶S活性为3650士612pmol/mg ·π η，表明35S启动子并不受OsACBFI 的调控。此结果说明，在植物体内OsACBFI与OsACRE之间存在着特异性相互作用，并激活 下游目的基因的表达。同时，OsACBFI对下游目的基因的激活转录活性随着诱导应答元件 OsACRE拷贝数的增加而增强。
权利要求
一种DNA分子，为如下1) 3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列选自序列表中序列1，且具有序列表中序列1自5’末端第868位到第1101位的核苷酸序列，同时其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第868位中的任一位置；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为如下1)-9)中任一 所述的DNA分子1)其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第868位中的 任一位置；2)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第868位中的任 一位置；3)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第693位到第868位中的任 一位置；4)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的任一 位置；5)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第693位中的任 一位置；6)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第693位中的任 一位置；7)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第532位中的任一 位置；8)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第532位中的任 一位置；9)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的任一位置。
3.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为如下1)-5)中任一 所述的DNA分子1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位到第1101位的序列；2)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第311位到第1101位的序列；3)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第532位到第1101位的序列；4)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第693位到第1101位的序列；5)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第868位到第1101位的序列。
4.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列为序列 表中序列2所示。
5.含有权利要求1-4中任一所述DNA分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重 组菌。
6.权利要求1-5中任一所述DNA分子在启动基因转录中的应用，所述转录受稻瘟病菌 诱导。
7.权利要求1-6中任一所述DNA分子在培育抗稻瘟病植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了水稻中受稻瘟菌诱导的启动子。本发明所提供的受稻瘟菌诱导的启动子，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列选自序列表中序列1，且具有序列表中序列1自5’末端第868位到1101位的核苷酸序列，同时其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到868位中的任一位置；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明有助于将水稻中受稻瘟菌诱导的启动子应用于增强植物抗病防御反应速率的分子育种中，具有重要的实践意义。
文档编号C12N1/15GK101935660SQ201010270229
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者于祥春, 安成才, 张旭, 王莉江, 钱万强, 黄萍 申请人:北京大学