人fgf21突变基因及制备重组人fgf21蛋白方法

专利名称：人fgf21突变基因及制备重组人fgf21蛋白方法
技术领域：
本发明涉及一种突变基因，尤其涉及一种人FGF21突变基因以及由该基因编码 的人源成纤维细胞生长因子(hFGF21)，本发明还涉及该人FGF21突变基因在制备重组人 FGF21蛋白中的应用，属于人FGF21重组蛋白的制备领域。
背景技术：
2000年，Tetsuya Nishimura等最先报道了人FGF21基因。该基因定位于人α 1， 2-墨角藻糖基转移酶基因的5’侧翼区，编码一个209个氨基酸大小的多肽，特异性表达于 肝脏中，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽，因此FGF21能分泌到细胞外。通过序列比对分 析，人FGF21属于FGF家族的FGF19亚家族，该家族包括FGF15、FGF19、FGF21、FGF23，FGF21 与家族中FGF19的同源性最高，两者氨基酸序列同源性为35%。由于FGF21与FGF19的同源性比较高，而后者已经证明可以调节内分泌代谢，因此 研究人员推测FGF21可能也具有相应的能力。2005年，来自Lilly公司的研究人员Alexei Kharitonenkov等首先在细胞水平和生物水平两方面对FGF21的生物学活性展开研究。他 们将FGF21作用于脂肪细胞24小时后发现，FGF21刺激后的脂肪细胞表现了明显葡萄糖 吸收能力，但与胰岛素的作用现象不同，在加入胰岛素刺激后，细胞很快出现葡萄糖吸收作 用，而FGF21则需要持续作用4小时以上才能达到相似的结果。同样的结果也在动物实验 上得到体现。而且FGF21还表现出一些很有意义的特点科研人员对健康鼠、糖尿病鼠及过 表达该基因的转基因小鼠的研究发现，任何剂量的FGF21均未引起小鼠体重增加或导致低 血糖症现象出现，这再一次提示FGF21可能不依赖于胰岛素途径来调节血糖。FGF21除直接调节血糖水平外，还可以激活胞外信号途径并改善胰腺细胞功能。据 报道，FGF21可以提高正常小鼠胰岛素mRNA水平和蛋白水平，同时激活细胞外信号调节激 酶1/2和Akt信号途径，但无诱导胰岛素分泌功能。FGF21处理的糖尿病啮齿动物，可以提 高胰岛素量和葡萄糖诱导胰岛素分泌。正常或糖尿病小鼠进行FGF21治疗后，胰岛素水平， 葡萄糖清除率都得到改善。而且未发现胰岛细胞增殖。由此推测，FGF21对胰腺的作用可 能得益于其在内环境稳定中起到的有益作用。另外，FGF21对糖脂毒性和细胞因子诱导的 胰岛细胞调亡也有局部保护作用。FGF21对血脂也有一定的调控作用。研究表明长期注射FGF21糖尿病恒河猴体内， 除血糖水平得到控制外，脂蛋白代谢也得到改善，尤其是特异性的降低低密度脂蛋白胆固 醇及升高高密度脂蛋白胆固醇水平，由此可见FGF21在整个内分泌过程中的重要作用。此外，Hajime Yamauchi等通过对斑马鱼FGF21的研究发现，敲除FGF21基因的斑 马鱼胚胎红细胞生成能力受到明显抑制，而该现象在向胚胎注入FGF21后得到改善。不仅 如此，缺少FGF21的斑马鱼胚胎在粒细胞的生成也受到干扰，因此FGF21可能在动物体内的 骨髓_红系祖细胞的分化中起到决定性作用。由于FGF家族成员大都具有促细胞分裂即促肿瘤生成的作用，而且，研究人员发 现与FGF21组成结构相似的FGF19会使小鼠肝细胞增生，因此FGF21安全性是决定它是否能够成为候选糖尿病药物的关键因素。令人兴奋的是，到目前为止，所有的实验都证明 FGF21是非常安全的。研究人员没有在被FGF21长期处理的3T3-L1细胞、NIH3T3细胞、人 脐静脉上皮细胞(HUVECs)等细胞上发现增殖现象，而且长期注射FGF21的小鼠、恒河猴及 转基因小鼠身上也没有任何组织增生现象。除了在糖尿病领域的研究外，FGF21还在其他几个方面给我们带来了振奋人心的 结果。Xinqiang Huang等利用二乙基亚硝胺作用于肝细胞大量表达FGF21的转基因小鼠， 令人惊奇的是与裸鼠相比，转基因小鼠能明显地延缓腺瘤的发生时间，虽然两者在肝癌发 生时间上并无太大区别，但是该结果也证明FGF21并不像FGF家族其他成员那样具有癌症 因子的恶名。作为肿瘤促进因子FGF家族的一员，FGF21同该家族的其他成员一样能够促使 MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)和FRS-2(成纤维生长因子受体底物2)的磷酸化，但是目前 的实验已经证明FGF21不会引起细胞分裂，因此FGF21信号传导途径引起众多科研人员的 兴趣。Alexei Kharitonenkov等对FGF21生物功能进行研究时发现，FGF21能够使 FGFR-I (成纤维细胞生长因子受体1)和FGFR-2 (成纤维细胞生长因子受体2)磷酸化，但 是这一过程并不需要肝磷脂的参与，这与以往对FGF家族成员的认识不符。而且FGF21只 能对脂肪细胞起作用而不能促进前脂肪细胞产生葡萄糖吸收作用，Yasushi Ogawa等通过 对不同分化时期的脂肪细胞研究发现beta-klotho在脂肪细胞分化过程中表达量从无到 有，因此推测beta-klotho的存在与否可能决定了 FGF21信号传递过程是否通畅，随后的试 验也证明了这一推断，免疫沉淀检测到FGF21受体复合物中包含了 beta-klotho，而且抑制 beta-klotho表达的脂肪细胞不能对FGF21的刺激起反应，因此beta-klotho取代肝磷脂参 与FGF21的信号传递过程。JULIE S. MOYERS等在对FGF21作用机制的研究中发现，PPAR γ (过氧化物酶体增 殖因子活化受体)激动剂罗格列酮能够增强FGF21刺激脂肪细胞葡萄糖吸收的能力，而且 进一步实验表明，在预先用罗格列酮处理脂肪细胞后，FGF21刺激FGFR-I和FGFR-2磷酸化 能力显著提高。由于大肠杆菌遗传背景清楚，繁殖快，成本低，表达量高，易于操作等诸多优势，目 前大多数重组蛋白的生产都是由大肠杆菌表达系统技术来实现。但其表达产物多为包涵 体，需要进行蛋白变性和复性，操作复杂，且蛋白损失量大，因此，有必要摸索FGF21在大肠 杆菌中大量可溶性表达的条件，为FGF21研制成药物奠定基础。目前，大肠杆菌表达系统多用目的蛋白与相应的标签进行融合表达，以利于纯化。 现有的用于从融合蛋白中切割标签的蛋白酶或蛋白因子主要存在着特异性较差、稳定性 低、不能在较宽范围的反应环境体系中保持高活力等缺陷，更为重要的是其成本高，因此， 在工业化生产中成为一个制约因素，有待进一步改进。

发明内容
本发明目的之一是提供一种人FGF21突变基因，该突变基因能显著提高人FGF21 蛋白的可溶性表达量。本发明目的之二是提供一种由上述人FGF21突变基因编码的蛋白。
本发明目的之三是提供一种制备重组人FGF21蛋白的方法。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一种人FGF21突变基因(mutFGF21)，其碱基为SEQ ID NO. 1所示；由上述人FGF21突变基因编码的蛋白，其氨基酸为SEQ ID NO. 2所示；本发明将人FGF21基因进行了突变，相比于突变前，突变后的人FGF21基因在宿主 细胞中的可溶性表达量有显著提高。含有SEQ ID NO. 1所示碱基的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然的 包括在本发明的保护范畴之内。其中，所述的表达载体优选为原核表达载体，所述的宿主细 胞优选为大肠杆菌(E. coli)细胞。一种制备重组人FGF21蛋白的方法，包括将SEQ ID NO. 1所示基因与表达载体可 操作性的相连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞；培养重组宿主细胞， 诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，即得。为了更好的提高重组人FGF21蛋白的可溶性表达水平，更优选的，一种制备重组 人FGF21蛋白的方法，包括将6 XHis标签基因、SUMO标签基因、羟胺切割位点基因和SEQ ID NO. 1所示基因依次连接在一起后得到SEQ ID N0. 3所示基因；将SEQ ID N0. 3所示基 因与表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞；培 养重组宿主细胞，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，羟胺切割，再纯化，即得。其中，所述的表达载体优选为原核表达载体，所述的宿主细胞优选为大肠杆菌 (E. coli)细胞。本发明制备重组人FGF21是通过利用羟胺可以专一性地切开蛋白中Asn-Gly肽键 的特点，从而将SUMO标签从人重组FGF21融合蛋白中去除，纯化，即得重组FGF21蛋白。本发明人通过实验发现，当采用以下条件进行诱导时，可有效提高重组蛋白的可 溶性表达水平在温度为37°C，IPTG终浓度为0. 25mmol/L，转速为lOOr/min条件下诱导6 小时。其中，优选的，所述的羟胺切割条件包括温度为30°C，缓冲液为PBS，pH值为7. 2， 切割1小时，融合蛋白与2X羟胺切割缓冲液的体积比为1 5，其中，融合蛋白的浓度优选 为5mg/ml ；所述的羟胺切割缓冲液包括盐酸羟胺浓度为5mol/L，pH值为9. 5。本发明制备重组FGF21蛋白的方法具有特异性好、稳定性高、能在较宽范围的反 应环境体系中保持切割活性，成本低等优点。


图 1 重组表达质粒 pET30a (+) -SUMOHis-Asn_Gly-hFGF21 的构建过程图。图 2pET30a(+)-SUM0His-Asn-Gly-hFGF21 环状 PCR产物；1. Ikb DNA Marker ；2.空 白对照(与泳道4体系相同但不加模板)；3.空白对照(与泳道4体系相同但不加引物)； 4. PCR产物。图3PCR产物胶回收图；1. PCR产物；2.胶回收产物；3. Ikb DNA Marker。图4 Dpn I酶切结果；1. Dpn I酶切PCR纯化的产物；2. Dpn I酶切质粒； 3.DL2000DNA Marker。图 5pET30a(+)-SUMOHis-Asn-Gly-mutFGF21 的 PCR 鉴定；1. IOObp DNA Marker ；2. PCR产物；3.空白对照(与泳道2体系相同但无模板)。图6蛋白突变前后表达量差异结果；M.蛋白分子量标准，1.突变后蛋白，2.突变 前蛋白。图7人重组FGF21融合蛋白的诱导表达结果；1. 37°C下0. 25mmol/L IPTG诱导3h 含重组质粒的阳性菌；2. 37°C下未诱导含重组质粒的阳性菌；3.含重组质粒的阳性菌诱导 3h破碎后上清；4.含重组质粒的阳性菌诱导3h破碎后沉淀；5.蛋白标准分子量。图8最佳诱导时间的摸索结果；1-6分别为含重组质粒的阳性菌在37 °C， 0. 25mmol/L IPTG诱导lh、2h、4h、6h、8h、12h时的蛋白条带；7.未诱导含重组质粒的阳性 菌；8.蛋白标准分子量。图9最佳诱导剂浓度的摸索；1.蛋白标准分子量；2.诱导的含pET30a(+)空载体 的宿主菌对照；3.未诱导的含重组质粒宿主菌；4-9.分别为在37°C，诱导剂IPTG浓度分别 为 0. 25mmol/L、0. 5m mol/L、0. 8m mol/LU. Om mol/L、1. 5mmol/L、2. Om mol/L 时的蛋白表 达条带。图10最佳诱导温度的摸索；1. 20°C时未诱导的含重组质粒阳性菌；2. 20°C时含重 组质粒阳性菌诱导3h，0. 25mmol/LIPTG时的蛋白表达条带；3.蛋白标准分子量；4. 37°C时 未诱导的含重组质粒阳性菌；5. 37°C时含重组质粒阳性菌诱导3h，0. 25mmol/L IPTG时的 蛋白表达条带。图11羟胺切割条件的摸索；1.切割前的融合蛋白；2.蛋白分子量标准；3.融合蛋 白与羟胺切割缓冲液体积比为1 5时切割产物；4.融合蛋白与羟胺切割缓冲液体积比为 1 4时切割产物；5.融合蛋白与羟胺切割缓冲液体积比为1 3时切割产物；6.融合蛋 白与羟胺切割缓冲液体积比为1 2时切割产物；7.融合蛋白与羟胺切割缓冲液体积比为 1 1时切割产物。图12人重组FGF21的纯化结果；1.融合蛋白羟胺切割后产物；2. SUMO蛋白；3.蛋 白分子量标准；4.纯化后的人重组FGF21。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例lmutFGF21基因的构建、表达1、重组表达质粒的构建将带有6 XHis标签序列的SUMO序列(两端分别引入Nde I和BsaI酶切位点)克 隆至PMD18-T载体上，构建pMD18-T-SUM0His质粒。将带有羟胺位点的人FGF21序列(两端 分别引入BsaI和BamHI酶切位点)克隆至pMD18_T载体上，构建pMD18-T-Asn_Gly-hFGF21 质粒。将Nde I和BsaI酶切pMD18-T_SUM0His后获得的SUMOHis片段与BsaI和BamHI酶 切pMD18-T-Asn-Gly-hFGF21后获得的Asn-Gly-hFGF21片段进行连接，连接后的产物再克 隆至Nde I和BamHI酶切后的pET30a(+)上，得到重组表达质粒pET30a(+)-SUMOHis_Asn-Gly-hFGF21，其构建过程见图1。
2、hFGF21基因的定点突变2. lhFGF21基因环状PCR过程设计两条突变引物Primer262 5' CTCGCTTCCTGCCACTACCATTCCTGCCCCCCGCACTCCCG 3' Primer263 5 ‘ CGGGAGTGCGGGGGGCAGGAATGGTAGTGGCAGGAAGCGAG 3‘采用定向突变的方法扩增环状FGF21表达载体。分别以不加模版和不加引物作为 空白对照。5XPS buffer5.0μ 1
dNTP mix(2. 5mmol/L)2.5 μ 1
pET30a (+)-SUMOHis-Asn-Gly-hFGF211.0 μ 1 (25ng)
Primer2621.0μ KlOp mol/'μ 1)
Primer2631.0μ KlOp mol/'μ 1)
Primer Star DNA polymerase0.3 μ 1
ddH2014 2μ 1共25μ 1体系，循环参数95°C预变性2min，95°C变性30s，65°C退火lmin， 72°C延伸:13min, cycle = 15，72°C终延伸30min。扩增结束后，取3μ 1混合物于琼脂 糖凝胶电泳上观察扩增结果，扩增结果见图2。2.2PCR产物的纯化取2. 1步骤中扩增的PCR产物采用AxyPr印PCR清洁试剂盒纯化PCR产物。方法 参照试剂盒说明。步骤如下①在PCR、酶切、酶标或测序反应液中，加3个体积的BufferPCR-A ；混勻后，转移到 DNA制备管中，将DNA制备管置于2ml离心管中，12000 Xg离心lmin。弃滤液。②将制备管 置回2ml离心管，加700μ 1 Buffer W2，12000 X g离心lmin，弃滤液。③将制备管置回2ml 离心管，加400 μ 1 Buffer W2，12000 Xg离心lmin，弃滤液。④将制备管置于洁净的1. 5ml 离心管中，在制备膜中央加25-30 μ 1去离子水，室温静置Imi η。12000 X g离心lmin洗脱 DNA。取2μ 1回收产物于琼脂糖凝胶电泳上观察纯化结果。PCR产物胶回收图结果见 图3。2. 3Dpn I 消化过程PCR纯化产物经Dpn I核酸内切酶酶切，切割掉母链和杂合的母链，剩下的双链环 状DNA分子都是新合成的带有突变碱基的DNA分子。取1 μ g甲基化的质粒做酶切对照。Dpn I酶切体系如下Dpn I2. 0 μ 1IOXbuffer45 μ 1PCR纯化产物或对照质粒25 μ 1 (2. 0 μ g)灭菌去离子水18 μ 1共50 μ 1酶切体系，37°C水浴12h。1 %琼脂糖凝胶电泳观察结果。将PCR纯化产物和对照组质粒分别进行Dpn I核酸内切酶酶切，带有甲基化的对照组质粒被切割成片段，未被甲基化双链环状DNA分子没有被切割成片段(图4)。2. 4阳性突变质粒的筛选与鉴定以 primer 262 和 primer 263 为引物，重组质粒 pET30a (+)-SUMOHis-Asn-Gly-mu tFGF21为模板进行PCR鉴定，在约570bp处有一条目的带，与预期带大小566bp相符，初步 确认为mutFGF21基因。如图5所示。2. 5突变后的FGF21基因的测序与结果分析重组质粒样品由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。采用DNAMAN软件 进行序列分析。序列测定的结果为SEQID NO. 1所示，所推导的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2 所示。3、突变前hFGF21基因及突变后muthFGF21基因的表达突变前hFGF21 基因(SEQ ID NO. 5)及突变后的 muthFGF21 基因(SEQ ID NO. 1) 均按照实施例2所述的方法进行转化、表达及重组蛋白的纯化。所表达的重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图6 ；从电泳结果可以看出，突变后的 hFGF21蛋白的表达量比突变前的hFGF21蛋白有显著提高，其可溶性表达量提高了 16%。实施例2人重组FGF21融合蛋白的制备和纯化1、转化Rosetta感受态冰上融化，加入1 μ 1 (IOng)重组表达质粒，冰上放置30分钟，42°C 热激45秒，加入200 μ 1 LB液体(无Kan)，37°C摇45分钟后涂板，37°C倒置过夜培养。2、表达(1)活化挑取单菌落于IOml LB (50 μ g/ml Kan)中，37°C振摇过夜；(2) 二次活化1/100 接菌(1000ml 接种 10ml，50 μ g/mlKan)，37°C 振摇 2-3 小时 至 OD600 = 0 . 3 ；(3)诱导设置两组，分别按照以下诱导条件进行诱导试验组温度37°C，IPTG 终浓度0· 25mmol/L,转速100r/min，振摇时间3小时；对照组温度37°C，转速100r/min，振摇时间3小时。(4)收菌:4°C，4000r/min,离心30分钟，用lysis buffer冲悬，再离心，弃上清， 菌于-80°C冻存。重组蛋白的SDS-PAGE的电泳结果为图7 ；从实验结果可见，采用试验组的诱导条 件可显著提高蛋白的可溶性和表达产量(图8-10)。3、纯化(1)融菌将菌冰上融化，加溶菌酶(1000ml 菌=10_20mllysis buffer, Iml lysis buffer中加入Img溶菌酶)和lysis buffer后，冰上放置45分钟。(2)超声破碎1000ml菌大约40分钟；
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(3)冰上柱上结合1小时，14000r/min离心；(4)洗杂蛋白每次 5ml wash buffer，洗 16 遍；(5)洗脱每次 2ml elution buffer，洗 4 遍；(6)透析PBS透析过夜。实施例3本发明人重组FGF21融合蛋白的羟胺切割和人重组FGF21的纯化1、试验材料供试样品实施例2所制备和纯化的人重组FGF21融合蛋白；试剂羟胺切割缓冲液。2、试验方法及结果(1)融合蛋白羟胺切割浓度的摸索将融合蛋白(浓度为lmg/ml)浓缩5倍至浓度为5mg/ml，分别以体积比为1 1、 1 2、1 3、1 4、1 5加入2 X羟胺切割缓冲液，30°C反应1小时后将各体系加入PBS PH7. 2至蛋白浓缩前体积，取样15% SDS-PAGE检测，分析最佳羟胺切割缓冲液浓度。结果 见图11。(2)人重组FGF21的纯化将浓度为lmg/ml融合蛋白浓缩5倍至浓度为5mg/ml后，以体积比为1 5加入 2X羟胺切割缓冲液。羟胺切割后产物经PBSpH7. 2缓冲液透析以除去切割缓冲液，再经 Ni-NTA琼脂糖亲和层析，收集唯一的流穿液，即为人重组FGF21，用Elution Buffer洗脱 Ni-NTA琼脂糖结合的小泛素相关修饰物蛋白，15% SDS-PAGE电泳检测，结果见图12。
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权利要求
一种人FGF21突变基因，其特征在于其碱基为SEQ IDNO.1所示。
2.由权利要求1所述人FGF21突变基因所编码的蛋白，其特征在于其氨基酸为SEQ ID NO. 2 所示。
3.含有权利要求1所述人FGF21突变基因的表达载体。
4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述表达载体是原核表达载体。
5.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。
6.一种制备重组人FGF21蛋白的方法，包括将权利要求1所述人FGF21突变基因与 表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞；培养重 组宿主细胞，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，即得。
7.一种制备重组人FGF21蛋白的方法，包括将6XHis标签基因、SUMO标签基因、羟 胺切割位点基因和权利要求1所述人FGF21突变基因依次连接在一起后得到SEQ ID NO. 3 所示基因；将SEQ IDN0. 3所示基因与表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将 重组表达载体转化宿主细胞；培养重组宿主细胞，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的 蛋白，羟胺切割，再纯化，即得。
8.按照权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的表达载体为原核表达载体；所 述的宿主细胞为大肠杆菌(E. coli)细胞。
9.按照权利要求7所述的方法，其特征在于所述的诱导条件包括在温度为37°C， IPTG终浓度为0. 25mmol/L，转速为100r/min条件下诱导6小时。
10.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的羟胺切割条件包括温度为30°C， 缓冲液为PBS，pH值为7.2，切割1小时，融合蛋白与2X羟胺切割缓冲液的体积比为1 5， 其中，所述的羟胺切割缓冲液包括盐酸羟胺浓度为5mol/L，pH值为9. 5。
全文摘要
本发明公开了人FGF21突变基因及制备重组人FGF21蛋白方法。本发明将人FGF21基因进行突变，突变后碱基序列为SEQ IDNO.1所示，突变后的基因在原核细胞中的表达量有显著提高。本发明还提供了一种提高人FGF21蛋白表达量的方法，包括将6×His标签基因、SUMO标签基因、羟胺切割位点基因和人FGF21突变基因依次连接在一起后得到SEQ ID NO.3所示基因；将其与表达载体相连接，得到重组表达载体；将其转化宿主细胞；培养，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，羟胺切割，再纯化，即得。本发明方法具有特异性好、稳定性高、能在较宽范围的反应环境体系中保持切割活性、制备成本低等优点。
文档编号C12N15/63GK101967485SQ201010274258
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者任桂萍, 刘铭瑶, 李德山, 王文飞, 高华山 申请人:东北农业大学