专利名称：一种胶冻样类芽孢杆菌及其培养方法和培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种胶冻样类芽孢杆菌P. muc3016CGMCC No. 4100以及培养该细菌的方法和培养基。
背景技术：
目前，我国农业土壤中缺磷、钾问题越来越明显。一方面，我国磷、钾素化肥生产 能力严重不足，每年需要大量进口 ；另一方面，耕作层的土壤中含有大量磷、钾元素，但这些 磷、钾绝大部分固化在铝硅酸盐中，不能被植物吸收利用。另外，我国农业生产中目前大量 应用氮素化肥，而氮素化肥的利用率不到40%，大量未被利用的氮素不但形成白白损失，而 且成为地下水和江河湖泊的污染源。硅酸盐细菌，俗称“钾细菌”，是一类可分解正长石等硅酸盐矿物和磷灰石的 芽胞杆菌，据目前分类学研究表明，该类群属于胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)和土壤类芽孢杆菌(Paenibacillusedaphicus)。自原苏联学者从土壤中 分离到这种细菌，发现这类细菌的某些类型能分解硅酸盐类矿物，并将植物难以吸收的磷、 钾等元素释放以供植物利用；此外，这类细菌可同时产生胞外多糖，具有增强植物非特异性 免疫能力，在农业生产实践中表现出良好的应用效果，成为微生物肥料领域研究和应用的 热点。此外，该类菌种在采矿、冶金、饲料、环保领域也有着广阔的应用。现有具有固氮、溶磷、解钾能力的微生物肥料(菌剂)都采用混合菌种来实现此三 种功能，即分别由具有固氮能力的菌种、具有溶磷能力的菌种和具有解钾能力的菌种三类 菌种组合而成，相应生成工艺及过程控制较为复杂。在发酵工艺及培养基配方设计上，对该类菌种的都是采用一次配料、灭菌、批次发 酵工艺，在发酵过程中不对发酵状态进行监测和干预，发酵产物即芽孢含量获得率较低，通 常芽孢密度不超过10亿/ml ；且发酵时间较长，通常30h左右。
发明内容
为了解决上面提到的现有技术所存在的问题，本发明的一个目的提供了一种具有 较强的固氮、溶磷、解钾功能的胶冻样类芽孢杆菌。本发明的另一目的在于提供培养这种胶冻样类芽孢杆菌的方法。本发明的第三个目的在于公开了用于培养这种胶冻样类芽孢杆菌的培养基。本发明的技术方案如下一种胶冻样类芽孢杆菌，其中，所述胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷和解钾 的作用。上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌，其中，所述胶冻样类芽孢杆菌具有序 列表1所述的16S DNA。上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌，其中，所述胶冻样类芽孢杆菌为P. muc 3016 CGMCC No. 4100。
上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，是指将上述技术方案中所 述的胶冻样类芽孢杆菌置于培养基中进行发酵培养，其中所述培养基中包含下列浓度的物 质碳源0. 2 0. 8g/L、豆粕粉2. 0 8. Og/L、硫酸铵0. 6 1. 5g/L、硫酸镁0. 2 0. 6g/ L、磷酸二氢钾0. 1 0. 6g/L、磷酸氢二钾0. 4 1. 5g/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L和碳酸钙 0. 1 0. 5g/L，培养基的pH为7. 5 7. 0 ；在发酵培养过程中还包括下述步骤(1)、发酵培养中间补料流加碳源，保持发酵培养基中碳源含量不高于0. 05% ；(2)、调节发酵罐通风量及搅拌速度，使发酵液溶解氧浓度不低于30% ；(3)、在发酵前12h发酵温度保持在28°C 32°C，12h后每2h温度提高1°C，在温 度升至36°C时保持该温度，直至形成芽孢产率到95%。上述技术方案中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，其中，所述培养基包含下列 浓度的物质碳源0. 4 0. 6g/L、豆粕粉4. 0 6. Og/L、硫酸铵0. 9 lg/L、硫酸镁0. 3 0. 5g/L、磷酸二氢钾0. 3 0. 5g/L、磷酸氢二钾0. 8 lg/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L和碳酸 钙 0. 2 0. 4g/L。上述技术方案中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，其中，所述培养基中的碳源 选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。培养上述技术方案中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养基，其中，所述培养基包含下 列浓度的物质碳源0. 2 0. 8g/L、豆粕粉2. 0 8. Og/L、硫酸铵0. 6 1. 5g/L、硫酸镁 0. 2 0. 6g/L、磷酸二氢钾0. 1 0. 6g/L、磷酸氢二钾0. 4 1. 5g/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/ L和碳酸钙0. 1 0. 5g/L，培养基的pH为7. 5 7. 0。上述技术方案中所述的培养胶冻样类芽孢杆菌的培养基，其中，所述培养基包含 下列浓度的物质碳源0. 4 0. 6g/L、豆粕粉4. 0 6. Og/L、硫酸铵0. 9 lg/L、硫酸镁 0. 3 0. 5g/L、磷酸二氢钾0. 3 0. 5g/L、磷酸氢二钾0. 8 lg/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L 和碳酸钙0. 2 0. 4g/L。上述技术方案中所述的培养胶冻样类芽孢杆菌的培养基，其中，所述培养基中的 碳源选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。本发明所述的菌种P. muc 3016的菌体特征、菌群特征以及生理生化特征如下(1)、菌体特征该菌种P. muc 3016为G-芽孢杆菌(有时会随着培养条件及菌龄 会有变化)，细胞粗长杆状，两端钝圆，产生聚羟基丁酸盐(PHB)颗粒；在无氮培养基上 菌体大小为(1. 0 1. 2)umX (4. 0 7. 0)um ；单个菌体或多个菌体包裹在同一荚膜边界 内形成菌胶团，外被肥厚夹膜，并呈现2-4层的结构，有时比菌体大10倍以上；芽孢壁厚，椭 圆形，中生或偏端生，芽孢囊微膨大(菌体照片见图2、3)。(2)、菌落特征在无氮的无氮筛选培养基(见菌落分离部分)上菌落胶质粘稠、湿 润，形成光亮透明、边缘整齐圆形隆起菌落，挑起时富有弹性，可拉成丝。通常在28°C培养 48小时，菌落直径可达3mm以上(菌体照片见
图1)。(3)、生理生化特性氧或兼性厌氧生长，水解淀粉、硝酸盐还原、不利用木糖；石 蕊牛奶反应不发生酸凝，不产碱；M. R反应为阳性；V. P反应为阴性；不产生吲哚；生长的最 佳PH值为7.0 8. 0，ρΗ低于5.0或高于8. 5均不生长；最佳生长温度范围为28°C 33°C。(4)、分类地位的确定
16S rDNA全序列测定结果如序列1所示，根据16S rDNA全序列测定结果，该菌种 P.muc 3016在系统发育上属于胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacil lusmucilaginosus)。由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果1、本发明所述的胶冻样类芽孢杆菌克服了现有技术中采用混合菌种来实现固氮、 溶磷、解钾三种功能时相应生成工艺及过程控制较为复杂的缺点，由单一菌种同时实现了 固氮、溶磷、解钾三种功能；2、由于本发明所述的胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷、解钾三种功能，具有 较强的功能活性，明显提高作物产量；3、本发明中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法首次在发酵方法上对本发明所述 菌种进行补料发酵，并监测调控其碳源浓度及溶解氧浓度，实现了高密度发酵的目的，较常 规提高一倍左右，且发酵时间为23h，较常规发酵方法缩短发酵时间大约6小时左右。菌株保藏信息本发明胶冻样类芽孢杆菌P. muc 3016，分类命名Paenibacillus mucilaginosus，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保 藏，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 4100，保藏日 期为2010年8月24日。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说 明实施例1 胶冻样类芽孢杆菌P. muc 3016的获得一、分离地及环境作为本发明的具体实施例，分离地及环境选择北京市昌平区国家褐潮土土壤肥力 和肥料效益长期监测基地内耕层土壤，该基地位于北纬40° 13’，东经116° 14’;土壤理化 性质见表1。表1分离地土壤状况
项目 全氮 全缚 ~全钾 速效氮 速效磷 速效钾 有机质 pH ___(P2O5) (K2O)___(P2O5) (K2O) 含量__
单位 ％ %__% mg/kg mg//kg mg/kg__%__/_
^ 0.081 0.69 1.75 36.07 4.8778.611.27 8.12二、菌株筛选(1)、挑取典型菌落称取IOg 土壤加入IOOml无菌水中，25°C摇床震荡30分钟，取上清液作10—1 10_4 稀释，将各稀释液在80°C处理15min，分别取0. Iml涂布于筛选平板培养基上，28°C 30°C 培养3 5d，挑取具有胨冻样芽孢杆菌典型菌落特征的单菌落，显微镜检查其纯度，确认为 纯培养后转接至斜面，28°C 30°C培养至菌苔长起，置4°C冰箱保存备用。无氮筛选培养基配方蔗糖5. Og, Na2HP042. Og, MgSO4 · 7H20 0. 5g，CaCO3O. lg， FeCl3 · 6H20 0. 005g，pH7. 5，琼脂粉 16g，蒸馏水 1. OL0(2)、单菌株解钾性能筛选
250ml三角瓶中分装筛选培养基50ml (成份同上无氮筛选培养基，不加琼脂粉)， 加入0. Ig钾长石粉，121°C灭菌30min，接入菌悬液(1. 6 X 108CFU/ml) 5ml ；对照处理接等 量灭活菌液，30°C振荡(200r/min)培养7天后采用原子吸收分光光度计测定培养液中钾含 量，以筛选高效分解钾长石的菌株(3)、单菌株解磷性能筛选对步骤(2)筛选的高效分解钾长石的菌株继续进行溶磷筛选，筛选溶磷细菌 性能的培养基为改良的Pikovskaya培养基，其中培养基配方为含有下列浓度的物质 (NH4)2SO4O. 5g/L, NaClO. 2g, KCl 0. 2g/L, MgSO4:7H20 0. 3g/L, MnSO4O. 03g/L, FeSO4O. 03g/ 1^，酵母粉0.58/1，葡萄糖10.(^/1，磷酸三钙5.(^/1，？!1值7.2。其中磷酸三钙过80目筛， 115°C高压灭菌20min。将配置好的上述液体培养基按50mL加入到250mL三角瓶中，灭菌冷 却后接入待筛选菌株的菌悬液(1.6X108CFU/ml)5ml ；对照处理接等量灭活菌液，30°C振荡 (200r/min)培养5天后采用钼锑抗比色法，用紫外可见分光光度计测定培养液中磷含量， 以筛选高效解磷的菌株。(4)、单菌株固氮性能筛选(I)将步骤(3)中筛选的具有高效解钾、溶磷能力的的各菌株同时活化，保持生长 状态一致；(II)将活化后的各菌株接入不走(1)中所述的无氮筛选培养基(其中加入0. 5g 酵母膏)，30°C 200rpm振荡培养20h ；(III)测各菌株的0D600值，按每个液体小瓶Iml IOD值的量接种；(IV)各取出6倍量菌液，4000rpm，4°C离心lOmin，收集菌体，用生理盐水洗两遍后 充分悬浮于Iml液体上述补加酵母膏的筛选培养基中，再加入2ml (适量)培养基混勻，用 A15将菌液的0D_值调到1 ；(V)每个液体小瓶加入9ml上述补加酵母膏的筛选培养基，接入Iml菌液，向液体小 瓶中塞入胶塞，注入纯氩4min，按事先算好的体积加入氧气(1. 5ml空气)，使瓶内氧气的终浓 度为0. 5%。每个样品至少3个重复；各注入十分之一新制的乙炔(6. 5ml)，30°C反应4_6h ；(VI)从每个液体小瓶中用微量进样器取出100 μ 1气体用气相色谱法测定乙烯含 量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。最终筛选得到具有较强固氮、解磷、解钾的芽孢杆菌，将其命名为P. muc3016。实施例2 菌种P. muc 3016的固氮、溶磷、解钾性能按照实施例1菌株筛选方法中固氮、溶磷和解钾的测定方法对菌种P. muc 3016 的固氮、溶磷、解钾性能进行测定，结果显示在固氮性能方面，该菌种具有较高的固氮酶活 性，为3. (^AC2H4nmoVar1 ^mg)蛋白，显著高于目前微生物肥料生产中使用的圆褐固氮菌 ACCC 11103的固氮酶活性达85%;在溶磷性能方面，用该菌种接种处理含磷矿粉(无机磷) 及卵磷脂(有机磷)的缺磷培养基，无机及有机磷含量分别比对照增加211. 5%、146. 2% ； 在解钾性能方面，用该菌种接种处理含钾长石的缺钾培养基，其水溶性钾浓度为87. 7mg/L， 对照为23. 4mg/L，增加3. 75倍。实施例3 菌种的培养实施例3-1 按下列浓度制备发酵培养基，其中碳源0. 2g/L、豆粕粉8. Og/L、硫酸铵0. 6g/L、硫酸镁0. 2g/L、磷酸二氢钾0. lg/L、磷酸氢二钾1. 5g/L、硫酸钙0. 2g/L和碳酸钙0. 5g/L，培 养基的pH为7. 5 7. 0 ；其中碳源为淀粉、糖蜜或蔗糖。将实施例1中获得的菌种P.muc 3016接种到上述培养基中，然后按照下述步骤进 行操作(1)、发酵培养中间补料流加碳源，保持发酵培养基中淀粉含量不高于0. 05% ；(2)、调节发酵罐通风量及搅拌速度，使发酵液溶解氧浓度不低于30% ；(3)、在发酵前12h发酵温度保持在28°C 32°C，12h后每2h温度提高1°C，在温 度升至36°C时保持该温度，直至形成芽孢产率到95%。按照本实施例所述的培养方法进行培养，发酵时间为23h，较常规发酵方法缩短发 酵时间大约6小时左右。在100L发酵罐小试水平，发酵芽孢得率在95%以上，芽孢发酵密 度18. 7亿/ml，较国内常规水平5 10亿/ml，提高了一倍以上；发酵时间不超过30h。实施例3-2 本实施例与实施例3-1相同，区别在于所述培养基中含有下列浓度的物质碳 源0. 8g/L、豆粕粉2. Og/L、硫酸铵1. 5g/L、硫酸镁0. 6g/L、磷酸二氢钾0. 6g/L、磷酸氢二钾 0. 4g/L、硫酸钙0. lg/L和碳酸钙0. lg/L,培养基的pH为7. 5 7. 0 ；其中碳源为淀粉和糖 蜜或淀粉和蔗糖的组合。实施例3-3 本实施例与实施例1基本相同，区别在于所述培养基中含有下列浓度的物质碳 源0. 4g/L、豆粕粉4g/L、硫酸铵0. 9g/L、硫酸镁0. 3g/L、磷酸二氢钾0. 3g/L、磷酸氢二钾 0. 8g/L、硫酸钙0. 2g/L和碳酸钙0. 4g/L，培养基的pH为7. 5 7. 0 ；其中碳源为淀粉、糖蜜 和蔗糖的组合。实施例3-4 本实施例与实施例1基本相同，区别在于所述培养基中含有下列浓度的物质碳 源0. 6g/L、豆粕粉6g/L、硫酸铵lg/L、硫酸镁0. 5g/L、磷酸二氢钾0. 5g/L、磷酸氢二钾Ig/ L、硫酸钙0. lg/L和碳酸钙0. 2g/L，培养基的pH为7. 5 7. 0 ；其中碳源选自淀粉、糖蜜或 蔗糖中的一种或两种以上的组合。实施例4 菌种P. muc 3016对作物产量的影响试验设计马铃薯小区实验设灭菌的空白培养基、P.muc 3016菌液两个处理，每 个处理4小区重复，每小区面积16m2，小区实验排列采用随机拉丁方设计。供试土壤性质见 表2表2小区实验土壤基本理化件质
权利要求
一种胶冻样类芽孢杆菌，其特征在于所述胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷和解钾的作用。
2.根据权利要求1所述的胶冻样类芽孢杆菌，其特征在于所述胶冻样类芽孢杆菌具 有序列表1所述的16S rDNA。
3.根据权利要求1或2所述的胶冻样类芽孢杆菌，其特征在于所述胶冻样类芽孢杆 菌为 P. muc 3016 CGMCC No. 4100。
4.权利要求1所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，是指将该细菌置于培养基中进行发 酵培养，其特征在于，所述培养基包含下列浓度的物质碳源0. 2 0. 8g/L、豆粕粉2. 0 8. Og/L、硫酸铵0. 6 1. 5g/L、硫酸镁0. 2 0. 6g/L、磷酸二氢钾0. 1 0. 6g/L、磷酸氢二钾 0. 4 1. 5g/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L和碳酸钙0. 1 0. 5g/L，培养基的pH为7. 5 7. 0 ；在发酵培养过程中还包括下述步骤(1)、发酵培养中间补料流加碳源，保持发酵培养基中碳源含量不高于0.05% ；(2)、调节发酵罐通风量及搅拌速度，使发酵液溶解氧浓度不低于30%；(3)、在发酵前12h发酵温度保持在28V 32°C，12h后每2h温度提高1°C，在温度升 至36°C时保持该温度，直至形成芽孢产率到95%。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于所述培养基包含下列浓度的物质碳 源0. 4 0. 6g/L、豆粕粉4. 0 6. Og/L、硫酸铵0. 9 lg/L、硫酸镁0. 3 0. 5g/L、磷酸二 氢钾0. 3 0. 5g/L、磷酸氢二钾0. 8 lg/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L和碳酸钙0. 2 0. 4g/ L0
6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于所述培养基中的碳源选自淀粉、 糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。
7.培养权利要求1所述胶冻样类芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于所述培养基包 括下列浓度的物质碳源0. 2 0. 8g/L、豆粕粉2. 0 8. Og/L、硫酸铵0. 6 1. 5g/L、硫 酸镁0. 2 0. 6g/L、磷酸二氢钾0. 1 0. 6g/L、磷酸氢二钾0. 4 1. 5g/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L和碳酸钙0. 1 0. 5g/L，培养基的pH为7. 5 7. 0。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于所述培养基包含下列浓度的物质碳源 0. 4 0. 6g/L、豆粕粉4. 0 6. Og/L、硫酸铵0. 9 lg/L、硫酸镁0. 3 0. 5g/L、磷酸二氢 钾0. 3 0. 5g/L、磷酸氢二钾0. 8 lg/L、硫酸钙0. 1 0. 2g/L和碳酸钙0. 2 0. 4g/L。
9.根据权利要求7或8所述的培养基，其特征在于所述培养基中的碳源选自淀粉、糖 蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。
全文摘要
本发明一种胶冻样类芽孢杆菌及其培养方法和培养基，属于微生物技术领域。该胶冻样类芽孢杆菌P.muc3016同时具有固氮、溶磷和解钾的作用，属于类芽孢杆菌类群。对该胶冻样类芽孢杆菌发酵培养时进行补料发酵，并监测调控其碳源浓度及溶解氧浓度。所述培养基包括碳源、豆粕粉、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钙和碳酸钙，培养基的pH为7.5～7.0。本发明的胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷和解钾三种作用，具有较强的功能活性，明显提高作物产量；采用本发明所述培养方法和培养基能够提高了发酵密度并缩短了发酵时间。
文档编号C12N1/20GK101967456SQ20101027670
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者关大伟, 冯瑞华, 姜昕, 曹风明, 李俊, 李力, 杨小红, 沈德龙, 葛一凡, 邴晓会, 陈慧君, 马鸣超 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所