专利名称：一种与绵羊背膘性状相关的snp及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种利用单核苷酸多态性预测绵羊背膘性状的方法。
背景技术：
根据一个物种已知的基因序列设计简并引物是获得另一个物种未知基因的一种 发法。获得基因后可以利用生物信息学手段对新基因进行功能预测，并通过半定量RT-PCR 和荧光定量PCR对该基因进行组织表达分析，通过多态性分析进行验证。钙蛋白酶抑制 蛋白(Calpastatin，CAST)基因在小鼠、人、兔和牛等物种存在不同的转录本，而且不同 的转录本在不同组织中的表达存在差异(Emori et al. ,1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(11) 3590-3594 ；Killefer andKoohmaraie, 1994, J Anim Sci 72(3) 606-614 ；Takano et al. ,2000, JBiochem 128(1) :83_92)。Zhu等人发现CAST在睾丸组织中存在一新的亚 型，克隆了新基因，并推测可能与精子的发生与关(Zhu, H. et al.，2002，Acta Pharmacol Sin 23(5) :450_454)。单核苷酸多态性标记(singlenucleotide polymorphism, SNP)是 1996 年被美 国MIT的Ε. Lander提出的，被称为“第二代DNA遗传标记〃。其基本原理是对于一个经 PCR扩增后具有固定长度的DNA片断，其分子构象是由碱基序列所决定的，因此单个碱基的 改变能够引起DNA分子单链或等位基因间形成的错配异源双链在变性条件下存在微小的 构象差别，这些不同的构象体在电泳或高效液相检测中因移动性的差异而得以区分。SNP的 检测可以通过PCR-SSCP、PCR-RFLP、测序及SNP芯片等多种技术实现。目前知道牛的CAST基因存在四种转录本，但在羊上CAST基因的研究较少，而且 GenBank上的序列不能清楚知道它属于CAST基因的那种转录本。有关羊CAST基因SNP的 检测及功能验证研究还是一个空白，对于羊的标记辅助选择及育种带来很大的障碍。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种绵羊单核苷酸多态性标记，自SEQID No 1所示序列 的5’端起第162位碱基为G或者T。本发明还提供上述的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊背膘性状预测中的应用。本发明的另一个目的是提供利用单核苷酸多态性预测绵羊背膘性状的引物，其序 列如 SEQ ID No 2 和 SEQ ID No 3 所示。本发明提供的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊背膘性状预测中的应用，具体是用 上述的引物对绵羊的总DNA进行PCR扩增，然后再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检 测，确定自序列表中SEQID No 1的5’端第162位碱基为G还是T，GT基因型的个体的背膘 厚度显著性的大于GG基因型的个体。所述单核苷酸多态性检测的方法为DNA测序、聚合酶链式反应_限制性酶切位点 长度多态性、聚合酶链式反应_单链构象多态性或等位基因特异的寡核苷酸杂交。优选为 聚合酶链式反应_限制性酶切位点长度多态性。其中限制性内切酶选用Hinfl。
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本发明还提供含有SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述引物的用于单核苷酸多态性 预测绵羊背膘性状的试剂盒。该试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNPTs、灭菌双 蒸水。该试剂盒还可包括限制性内切酶HinfI及其缓冲液。本发明利用绵羊的CAST基因的SNP突变位点进行基因型快速分型。不同的绵羊群 体存在这些多态位点上的基因型频率和基因频率存在显著差异。利用一般线性模型对CAST 基因的CAST-S3的g. G162T与绵羊的生产性状进行关联分析，通过SASvS. 02软件进行线性 模型分析发现，CAST-S3的g. G162T突变与背膘厚度间存在关联，GT型的背膘厚度显著高于 GG型(P<0.05)。该多态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，同时为绵羊背膘 厚度的标记辅助选择提供科学依据。
图1为CAST-S3扩增片段的SSCP结果。图2为CAST-S3扩增片段的测序峰图。图3为CAST-S3扩增片段的RFLP结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1(1)用眼科手术剪将约0.3g肌肉组织块充分剪碎，置于1.5ml离心管中，干燥 20mino(2)在上述离心管中加入500 μ 1组织DNA提取液。(3)在上述离心管中加入RNA酶溶液至终浓度为20μ g/ml，充分混勻，37°C消化 1 2小时。(4)在上述离心管中加入蛋白酶K至终浓度为150yg/ml，充分混勻，55°C消化 12 24小时。(5)在上述离心管中加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10分钟使溶液的 两相充分混勻4°C，12000rpm离心10分钟，然后转移上清液至一个干净的离心管中。重复一次。(6)再加入用等体积的Tris饱和酚氯仿异戊醇(25 24 1)，混勻，4°C， 12000rpm离心10分钟。(7)取出上清液，转移入新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)， 4°C, 12000rpm 离心 10 分钟。(8)取上清，加入1/10体积的3M NaAc (pH5. 2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀 DNA。(9)将DNA沉淀挑出，置于新的干净的1. 5ml离心管中，用90%乙醇洗涤两次。(10)将DNA自然晾干后，加入适量TE或灭菌双蒸水进行溶解，-20°C保存。共检测样本676个，小尾寒羊纯种个体36个，杜泊羊*湖羊杂交个体450个，陶赛特羊*湖羊杂交个体145个，萨福克羊*新疆细毛羊杂交个体45个。其中小尾寒羊纯种个 体用于PCR-SSCP分析，检测多态位点；三个杂种羊群体用于PCR-RFLP多态性大规模检测。实施例2PCR-SSCP的PCR引物如下表所示。1、PCR 扩增表1 5对特异性引物序列、退火温度及目的片段长度
权利要求
一种绵羊单核苷酸多态性标记，其特征在于，在SEQ ID No 1所示序列的自5’端起第162位碱基为G或者T。
2.权利要求1所述的单核苷酸多态性标记在绵羊背膘性状预测中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用序列如SEQIDNo 2和SEQ ID No 3所 示的引物对绵羊的总DNA进行PCR扩增，然后再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测， 确定自序列表中SEQ ID No 1的5’端起第162位碱基为G还是T，GT基因型的背膘厚度显 著厚于GG基因型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性检测的方法选自DNA 测序、聚合酶链式反应-限制性酶切位点长度多态性、聚合酶链式反应-单链构象多态性或 等位基因特异的寡核苷酸杂交。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性检测的方法为聚合 酶链式反应_限制性酶切位点长度多态性。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的聚合酶链式反应_限制性酶切位点 长度多态性所用的内切酶为Hinfl。
7.用于检测权利要求1所述的单核苷酸多态性标记的试剂盒，其特征在于，包括序列 如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、 dNPTs、灭菌双蒸水。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括限制性内切酶Hinfl及其缓冲液。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用单核苷酸多态性预测绵羊背膘性状的方法。该方法用SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述的引物对绵羊的总DNA进行PCR扩增，然后再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID No 1的5’端第162位碱基为G还是T，GT基因型的背膘厚度显著厚于GG基因型。该多态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，同时为绵羊背膘厚度的标记辅助选择提供科学依据。
文档编号C12Q1/68GK101942438SQ20101027739
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者张莉, 张菊, 杜立新, 路国彬, 魏彩虹 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所