专利名称：结合基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测的方法。
背景技术：
植物microRNA是一类20-24碱基长的非编码RNA，是重要的基因调控元件[10]。 装载到RNA引导沉默复合体(RISC)后，植物microRNA会引导与其高度互补的靶基因mRNA 在互补位点的切割，降低靶基因的表达水平[10]。靶基因中大部分编码转录因子，这使得植 物microRNA的调控范围几乎遍及整个基因组[12]。因此microRNA在植物的多种生物过程 中都起到了重要作用，包括植物发育、应激反应以及microRNA途径自身[12]。对植物microRNA的研究发现了大量的植物microRNA，在此基础上建立了专门的 microRNA数据库[9，19]。miRBase是一个综合的microRNA数据库，包含了动植物中已经 发表的microRNA，提供了 microRNA序列、前体序列、前体二级结构、基因组上下文及参考文 献等信息[9]。PMRD是一个专门的植物microRNA数据库，涵盖了更多的植物物种，并包含 了大量预测到的无实验验证的micr0RNA[19]。对于水稻和拟南芥等有mRNA序列数据的物 种，PMRD还列出了预测到的靶基因[19]。作为重要的模式生物，水稻和拟南芥有大量的生物信息学资源，包括详细注释的 基因组序列，多态性数据，以及大量的高通量测序数[7，11，13-17]。这些数据中，很多可以 用于植物microRNA的研究。用测序数据或者微阵列实验，探测到了水稻和拟南芥亚种间大量的单核苷酸多态 性(SNP) [7，13，15]。microRNA前体的SNP会影响microRNA前体的折叠，进而影响到DCLl 对microRNA前体的识别与切割[10]。microRNA成熟体或者靶基因结合位点的SNP会改变 microRNA与靶基因mRNA的互补程度，从而改变microRNA对mRNA的切割效率[10]。可以 利用SNP数据来研究SNP在microRNA途径层次对亚种间差异的贡献。大规模并行信号测序(MPSS)是一种研究基因表达的高通量测序技术，水稻和拟 南芥有大量的MPSS数据[14]。植物microRNA是独立的转录单元，与蛋白编码基因一样 由RNA 二型聚合酶转录，具有5’帽和3’聚腺苷酸尾[10]。因此，可以用MPSS数据来分析 microRNA基因的表达。另外，MPSS的转录信号可以为microRNA基因的转录区间及基因模 型提供参考。RNA末端并行分析(PARE)是一种降解组高通量测序技术，测定有聚腺苷酸尾的3’ 端切割产物的5’端序列，水稻和拟南芥也有大量的PARE数据[14]。植物microRNA与靶基 因mRNA高度互补，主要引导靶基因mRNA的切割，切割产物能被PARE技术探测到[8]。因 此，PARE数据可以用于microRNA对靶基因mRNA切割作用的分析。另外，microRNA的生物 发生需要DCLl的切割，microRNA也可能引导microRNA前体自身的切割，可以用PARE数据 来分析这些切割作用[8]。
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发明内容
本发明的目的是提供一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预 测的方法。基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测的方法包括如下步骤1)收集植物microRNA和基因组数据；
2)处理植物microRNA数据；3)使用miRU预测植物microRNA的靶位点；4)收集PARE信号数据；5)建立PmiPKB数据库的“MiR-Tar”模块；6)利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系；7)构建植物microRNA靶位互作网络。所述的收集植物microRNA和基因组数据步骤为水稻和拟南芥的microRNA数据 来自于版本15的miRBase，其中，水稻有成熟体序列498条，前体序列449条，拟南芥有成熟 体序列224条，前体序列199条，水稻的基因组数据来自于版本6. 1的TIGR，拟南芥的基因 组数据来自于版本9的TAIR。
所述的处理植物microRNA数据步骤为miRBase的microRNA数据为EMBL格式， 基因组坐标数据为GFF格式，使用PERL脚本解析这些数据，将其存入数据库，所有的序列均 转换成大写字母。所述的使用miRU软件预测植物microRNA的靶位点步骤为分别输入水稻的 microRNA和水稻基因组数据，选择miRU软件的默认参数，然后对水稻microRNA的基因靶 位点进行预测；分别输入拟南芥的microRNA和拟南芥基因组数据，选择miRU软件的默认参 数，然后对拟南芥microRNA的基因靶位点进行预测。所述的收集PARE信号数据步骤为PARE信号数据来自NGSD的10个数据集和 Yongfang Li的1个数据集，原数据进行归一化处理。所述的建立PmiPKB数据库的“MiR-Tar”模块步骤为用SVG图形表示microRNA 基因附近的PARE信号数据。图示的范围为microRNA前体基因组坐标左右共一万碱基对， 数据集纵向排列，方便用户进行比较。所述的利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系步骤为使用PmiRKB 数据库中的“MiR-Tar”模块，图形化输出含PARE信号数据的全部靶位点互作关系，共计 8253对，再进行人工筛选校正，最终获得3077对可靠性较高的microRNA靶位互作关系。所述的预测植物microRNA靶位互作网络步骤为将获得的3077对可靠性较高的 microRNA靶位互作关系存储到以tab键分隔的文本文件中，利用NeAT将该文本文件转化为 通用的GML网络格式文件，使用yED网络可视化工具对这3077对microRNA靶位互作关系 进行可视化处理，构建出植物microRNA靶位互作网络。本发明整合了水稻、拟南芥的RNA末端并行分析数据，提供了映射到靶基因mRNA 与microRNA结合位点附近的PARE信号信息，可用于鉴别预测的microRNA-target mRNA 之间是否存在真实的切割调控关系；来自不同组织材料的PARE数据集间可以进行比较 以揭示这种调控关系的组织特异性。此外，又整合了已有的PARE数据，提供了映射到 pre-microRNA上的PARE信号情况，可用于监测DCLl对pri-或pre-microRNA的加工情况， 以及microRNA或microRNA*对其microRNA前体的自切割作用，组织间的差异依然可以通 过跨库比较来观察到。最后对水稻和拟南芥现有microRNA靶位互作关系进行人工筛选校 正，获得3077对可靠性较高的microRNA靶位互作关系，构建了网络模型并进行网络可视化 处理，此网络模型具有相当高的可靠性。
图1是PmiRKB数据库简要的ER图；图2是PmiRKB数据库的“MiR-Tar”模块中使用PARE信号数据验证拟南芥miR156h 对AT5G50570. 1的切割；图3是预测到的水稻microRNA靶位互作网络局部示意图；图4是预测到的拟南芥microRNA靶位互作网络局部示意图。
具体实施例方式基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测的方法包括如下步骤1)收集植物microRNA和基因组数据；
2)处理植物microRNA数据；3)使用miRU预测植物microRNA的靶位点；4)收集PARE信号数据；5)建立PmiPKB数据库的“MiR-Tar”模块；6)利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系；7)构建植物microRNA靶位互作网络。所述的收集植物microRNA和基因组数据步骤为水稻和拟南芥的microRNA数据 来自于版本15的miRBase，数据包括了 microRNA名称、microRNA序列、前体名称、前体序 列、前体的基因组坐标以及参考文献。其中，水稻有成熟体序列498条，前体序列449条，拟 南芥有成熟体序列224条，前体序列199条，一条前体可能对应有多条成熟体。水稻的基因 组数据来自于版本6. 1的TIGR，拟南芥的基因组数据来自于版本9的TAIR。所述的处理植物microRNA数据步骤为miRBase的microRNA数据为EMBL格式， 基因组坐标数据为GFF格式，使用PERL脚本解析这些数据，将其存入数据库，所有的序列 均转换成大写字母。水稻的MIR156f和MIR531前体都对应有两个基因组坐标，为了简 化数据库结构，将对应于不同基因组坐标的同一前体分作多个前体来表示MIR156f(l)、 MIR156f (2)、MIR531 (1)和 MIR531 (2)。对于未给出 microRNA* 序列的 microRNA，根据前体 的二级结构，选择microRNA*序列使双链体3’端有两个碱基的突出[10]。所述的使用miRU软件预测植物microRNA的靶位点步骤为分别输入水稻的 microRNA和水稻基因组数据，选择miRU软件的默认参数，然后对水稻microRNA的基因靶 位点进行预测；分别输入拟南芥的microRNA和拟南芥基因组数据，选择miRU软件的默认参 数，然后对拟南芥microRNA的基因靶位点进行预测。所述的收集PARE信号数据步骤为RNA末端并行分析(PARE)是一种降解组高通 量测序技术，PARE信号数据可以用于microRNA对靶基因mRNA切割作用的分析。PARE信号 数据来自NGSD的10个数据集和Yongfang Li的1个数据集，原数据进行归一化处理，即利 用数据库提供的算术运算对原数据进行归一化处理，即将各个序列的读数除以所在数据集 的总读数，再乘以一百万，得到序列的RPM(数据集每百万读数中序列的读数)。所述的建立PmiPKB数据库的“MiR-Tar”模块步骤为用SVG图形表示microRNA基 因附近的PARE信号数据。图示的范围为microRNA前体基因组坐标左右共一万碱基对，由于 范围太大，在图示的上方给出了缩略图与可移动的窗口，通过JavaScript实现移动窗口查 看详细信息的功能。PARE序列的RPM用不透明度表示，在鼠标指到序列时显示出该序列具 体的基因组坐标和RPM值。数据集纵向排列，方便用户进行比较。在其中表示出microRNA 与靶基因mRNA间的配对，图示范围为mRNA上microRNA结合位点左右共约120碱基对。对 于唯一映射到该位点的PARE序列，在表示信号的矩形外加边框，以示区别。所述的利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系步骤为使用PmiRKB 数据库中的“MiR-Tar”模块，图形化输出含PARE信号数据的全部靶位点互作关系，共计 8253对，再进行人工筛选校正，最终获得3077对可靠性较高的microRNA靶位互作关系。所述的预测植物microRNA靶位互作网络步骤为将获得的3077对可靠性较高的 microRNA靶位互作关系存储到以tab键分隔的文本文件中，利用NeAT将该文本文件转化为 通用的GML网络格式文件，使用yED网络可视化工具对这3077对microRNA靶位互作关系
8进行可视化处理，构建出植物microRNA靶位互作网络。实施例1.数据来源水稻和拟南芥的microRNA数据来自于miRBaSe[9]，版本为15。数据包括了 microRNA名称、microRNA序列、前体名称、前体序列、前体的基因组坐标以及参考文献。其 中，水稻有成熟体序列498条，前体序列449条；拟南芥有成熟体序列224条，前体序列199 条。一条前体可能对应有多条成熟体。水稻microRNA前体的基因组坐标基于TIGR6.0伪 分子，拟南芥microRNA前体的基于TAIR9基因组。水稻的基因组数据来自于TIGR[16]，版 本为6. 1。版本6. 1与6. 0仅有少数基因分类不同，因此miRBase提供的水稻microRNA前 体的基因组坐标适用于TIGR6. 1。拟南芥的基因组数据来自于TAIR，版本为9。(见表1)水稻的SNP 数据涉及 了 21 个亚种93-11、Nipponbare, Tainung 67、 Li-Jiang-Xin-Tuan-Hei-Gu> M 202、Azucena、Moroberekan> Cypress、Dom-Sufid> N 22、 Dular、FR13A、Aswina、Rayada>IR64-21、Shan-Huang Zhan-2、Pokkali、Swarna>Sadu-Cho> Minghui 63和Zhenshan 97B。其中Nipponbare为参考亚种。亚种93-11的SNP数据来自 于基因组的序列联配，原数据提供了 SNP周围共41碱基长的序列用于定位[7]。其余亚种 与Nipponbare间的SNP数据由重测序微阵列技术，结合基于模型(MB)或机器学习(ML)的 计算方法测定[13]。原数据提供了 SNP的TIGR5伪分子坐标和周围共201碱基长的序列， 可以用这些序列将SNP定位到TIGR6. 1上。取MB和ML方法的交集，以保证数据的高可靠 性。拟南芥的 SNP 数据涉及了 7 个亚种=Col-O,Bur-0,Tsu-ULer-UBay-O,Sha 和 Cvi-O0 其中Col-O是参考亚种。这些亚种的SNP数据来自TAIR的Polymorphism数据库，原数据 直接提供了 SNP的TAIR9基因组坐标[15]。水稻和拟南芥的MPSS数据主要来自于NGSD (Next-Gen Sequence Database)的35 个数据集[14]。原数据提供了每一个序列标签的读数，需要归一化处理以便进行数据集间 的对比。另外，Guojie Zhang等人用高通量方法得到的水稻亚种93-11的转录组数据，共2 个数据集，与MPSS数据类似，同样适合做microRNA基因转录的分析[17]。因此，可以将这 2个数据作为MPSS数据进行处理。PARE数据主要来自NGSD的10个数据集[14]，原数据需要归一化处理。另外， Yongfang Li等人的水稻降解组数据，共1个数据集，与PARE数据类似，也可以用来分析 microRNA引导的mRNA切割[11]。因此，把这一数据集作为PARE数据进行处理，构建出植 物microRNA靶位互作网络。(见表2)表1 植物microRNA及基因组的数据来源
权利要求
一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测的方法，其特征在于，包括如下步骤1)收集植物microRNA和基因组数据；2)处理植物microRNA数据；3)使用miRU预测植物microRNA的靶位点；4)收集PARE信号数据；5)建立PmiPKB数据库的“MiR Tar”模块；6)利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系；7)构建植物microRNA靶位互作网络。
2.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预 测的方法，其特征在于，所述的收集植物microRNA和基因组数据步骤为水稻和拟南芥的 microRNA数据来自于版本15的miRBase，其中，水稻有成熟体序列498条，前体序列449条， 拟南芥有成熟体序列224条，前体序列199条，水稻的基因组数据来自于版本6. 1的TIGR， 拟南芥的基因组数据来自于版本9的TAIR。
3.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测 的方法，其特征在于，所述的处理植物microRNA数据步骤为=HiiRBase的microRNA数据为 EMBL格式，基因组坐标数据为GFF格式，使用PERL脚本解析这些数据，将其存入数据库，所 有的序列均转换成大写字母。
4.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测 的方法，其特征在于，所述的使用miRU软件预测植物microRNA的靶位点步骤为分别输入 水稻的microRNA和水稻基因组数据，选择miRU软件的默认参数，然后对水稻microRNA的 基因靶位点进行预测；分别输入拟南芥的microRNA和拟南芥基因组数据，选择miRU软件的 默认参数，然后对拟南芥microRNA的基因靶位点进行预测。
5.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测 的方法，其特征在于，所述的收集PARE信号数据步骤为PARE信号数据来自NGSD的10个 数据集和Yongfang Li的1个数据集，原数据进行归一化处理。
6.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测 的方法，其特征在于，所述的建立PmiPKB数据库的“MiR-Tar”模块步骤为用SVG图形表示 microRNA基因附近的PARE信号数据。图示的范围为microRNA前体基因组坐标左右共一万 碱基对，数据集纵向排列，方便用户进行比较。
7.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测 的方法，其特征在于，所述的利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系步骤为 使用PmiRKB数据库中的“MiR-Tar”模块，图形化输出含PARE信号数据的全部靶位点互作 关系，共计8253对，再进行人工筛选校正，最终获得3077对可靠性较高的microRNA靶位互 作关系。
8.如权利要求1所述的一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测 的方法，其特征在于，所述的预测植物microRNA靶位互作网络步骤为将获得的3077对可 靠性较高的microRNA靶位互作关系存储到以tab键分隔的文本文件中，利用NeAT将该文 本文件转化为通用的GML网络格式文件，使用yED网络可视化工具对这3077对microRNA靶位互作关系进行可视化处理，构建出植物microRNA靶位互作网络。
全文摘要
本发明公开了一种基于下一代测序数据的植物microRNA靶位互作网络预测的方法。它包括如下步骤1)收集植物microRNA和基因组数据；2)处理植物microRNA数据；3)使用miRU预测植物microRNA的靶位点；4)收集PARE信号数据；5)建立PmiPKB数据库的“MiR-Tar”模块；6)利用PARE信号数据验证植物microRNA靶位互作关系；7)构建植物microRNA靶位互作网络。本发明整合了水稻、拟南芥的RNA末端并行分析数据，提供了映射到靶基因mRNA与microRNA结合位点附近的PARE信号信息，可用于鉴别预测的microRNA-target mRNA之间是否存在真实的切割调控关系；来自不同组织材料的PARE数据集间可以进行比较以揭示这种调控关系的组织特异性。对水稻和拟南芥现有microRNA靶位互作网络进行预测，并人工进一步筛选得到最终网络模型，具有相当高的可靠性。
文档编号C12Q1/68GK101976296SQ20101028168
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者克里斯汀·克鲁卡斯, 孟一君, 白琳, 苟凌峰, 陈迪俊, 陈铭, 黄冬林 申请人:浙江大学