专利名称：一种鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记及其获取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及 基因工程技术领域，具体涉及一种鸡热应激蛋白70基因上的耐热性 相关分子标记及其获取方法和应用。
背景技术：
分子标记辅助选择育种，是基因工程在现代家禽育种中的一项重要应用，通过分 子标记的方法进行现场育种，不仅能缩短育种时限，大大减少育种的人力物力消耗，另外分 子标记的多样性更使得分子标记辅助选择育种在现场育种中的应用潜力大大提高。高温季 节容易引起鸡产生热应激，导致生长发育缓慢，免疫力降低，发病率和死亡率升高，给集约 化的养鸡生产带来巨大的经济损失。目前生产中主要采取通风降温、日粮调控等综合措施 来缓解鸡的热应激反应，但这并不能从根本上解决热应激对现在家禽养殖的影响。因此，通 过育种的途径改善个体本身的热适应性是今后家禽遗传育种重要的研究方向之一，而分子 标记是达到这一目的的重要手段。耐热力是一种适应能力，通过遗传育种手段增强家禽自身对高温的耐受力，培育 耐热品系是消除热应激的根本措施，是家禽的育种方向之一，而确定耐热指标是选育耐热 品系的基础。皮质酮可以作为一个准确的评价家禽应激状况的生理指标，应激会引起皮质 酮的大量分泌。血浆皮质酮水平降低时，代谢速度减慢，产热减少；而当血浆皮质酮水平升 高时，代谢强度加强，产热增多。淋巴细胞是重要的免疫细胞，包括τ细胞和B细胞，分别直 接参与细胞免疫和体液免疫应答，在机体免疫系统中起着重要的作用，其数量的多少与免 疫性能息息相关。当机体受到外界刺激时(如病原体入侵，热应激等)，淋巴细胞和单核细胞 在血液中的含量会下降，异嗜性粒细胞增加，因此异嗜性粒细胞(H)与淋巴细胞(L)的比值 升高。因此H、L和H/L值不仅是兽医临床上常用的检测方法，也是家禽抗病育种上的一个 重要的免疫性状，H/L值的变化与家禽的应激程度密切相关，可以作为检测家禽应激程度的 一项准确指标。由甲状腺分泌的三碘甲状腺原氨酸(T3)与应激有重要关系，T3水平下降 时，代谢速度减慢，产热减少，反之亦然，是敏感的热应激指标。T淋巴细胞群是检测机体细 胞免疫功能的重要指标，CD (Cluster of Differentiation)是指位于细胞膜上一类分化 抗原的总称。在抗原识别过程中，CD3+T细胞起着信号传导作用。CD4+T细胞具有辅助细胞 免疫和体液免疫应答的作用，CD3+、CD4+T细胞水平降低，机体的免疫水平也随之降低。目前热应激抗性候选基因研究主要集中在热应激蛋白家族(HSP)，其中HSP70是 热应激蛋白家族中重要成员，作为主要的分子伴侣参与机体耐受性的形成。HSP70在应激 适应性过程中起着重要的作用，所以Hsp70基因的多态性可能与易感性、疾病等应激存在 重要的关联。目前针对鸡热适应性的分子标记研究比较少，中国专利申请200910210772. 7 公开了一种筛选耐热性奶牛的SNP位点及检测方法，该SNP位点为奶牛HSP70A1A基因上的 碱基。通过该位点可以通过单倍型组合确定耐热性状，进行奶牛的早期筛选。本发明在鸡 Hsp70的编码区找到的耐热性分子标记为首次报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的耐热性鸡品种的筛选中存在的无法从本质上减少 热应激的缺点，利用辅助分子标记的方法，从遗传育种上改良鸡的耐热性的鸡热应激蛋白 70基因上的耐热性相关分子标记。本发明另一目的在于提供上述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的 获取方法。本发明还有一个目的在于提供上述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标 记的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记，所述耐热性相关分子标记为 A+258G 和 C+1437T。上述利用分子标记对鸡耐热性的获取方法，包括如下步骤
(1)鸡基因组DNA的提取；
(2)设计2对特异性引物，其核苷酸序列如SEQID NO:广4所示，进行PCR扩增；
(3)扩增产物分型，A+258G位点利用PCR产物测序分型，C+1437T位点利用酶切分型。作为一种优选方案，上述步骤中，步骤(1)中所述鸡血为抗凝血，抗凝剂为EDTA或 肝素钠。所述提取是用苯酚_氯仿抽提法或试剂盒抽提。作为一种优选方案，上述步骤中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为Mix占 反应体系的50%，上游引物和下游引物各l(T20pmol，Taq酶占反应体系的0. 75%，基因组 DNA0.广lug，加灭菌双蒸水至反应总体积。所述PCR扩增的反应程序为
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作为一种优选方案，上述步骤中，步骤(3)中所述酶切分型的酶切反应体系为PCR产 物8 10 μ L，内切酶3飞U，IOX缓冲液为内切酶体积的2倍，37°C水浴过夜，用2. 5%的琼 脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据电泳条带判断个体的基因型，位点C+1437T酶切产物检 测到三种基因型，其中TT基因型为一条371bp的条带；CC基因型为两条分别为193bp和 178bp的条带；CT基因型为三条分别为371bp、193bp和178bp的条带。其中，所述内切酶为 Tsp A5 I。本发明鸡血基因组DNA的抽提包括以下具体步骤
30ul抗凝血+470ul 1XSET+12. 5ul 20% SDS+5ul蛋白酶K混勻，55°C水浴过夜消化 (注要按顺序加)
加Tris饱和酚500ul，摇勻(20min)，离心。
取上清于干净1.5ml离心管，加入500ul Tris饱和酚，摇勻，离心。取上清于干净1. 5ml离心管，加入500ul氯仿一异戊醇(23 1 )，摇勻，离心。取上清于干净1. 5ml离心管，加入无水乙醇(-20°C) lOOOul，摇勻，冰冻于-20°C， 20 30min。弃上清，加入IOOOul 75%乙醇，摇勻，离心。
弃上清，烘干，加入适量TE，55°C水浴过夜。本发明鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记可以通过遗传育种，增强 鸡对高温的耐受力。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记通过遗传育种，增强鸡对高温 的耐受力，所采用的方法具有条件简单，价格低，可信度高等优点，用于选择热适应性较好 的种鸡具有重要作用。
图1为A+258G位点测序分型示意图2为C+1437T酶切电泳图，其中，M为DL2000的Marker，自上而下分别为2000、1000、 750、500、100bp。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例分别在室内环境温度为35°C和15°C时翅下静脉采集333个矮脚黄血液分装成三 管非抗凝血1 2mL，血清用于测定T3和皮质酮；抗凝血1 2mL，用于测定H/L，及⑶3+、 CD4+。抗凝血l_2ml，用于基因组DNA的抽提。其中非抗凝血直接离心吸取血清，利用酶联 免疫吸附法测定T3和皮质酮；抗凝血用于测定H/L，用瑞氏和吉姆萨染复合染色法对血涂 片染色，镜检，按Alfred的白细胞分类方法进行细胞分类，并按Campo的方法进行计数和计 算；CD3+、CD4+利用流式细胞仪检测。抽提666个血液样本的基因组DNA，每个样本取10ul，分别制成各样本DNA稀释 液，以DNA稀释液为模板，按照申请专利说明的PCR反应体系配制反应体系，并按相应反应 程序进行PCR扩增。位点A+258G的PCR扩增产物直接测序分型，测序分型结果见图1 ；位点 C+1437T的PCR扩增产物经凝胶电泳检测扩增结果良好的产物进行酶切分型，酶切效果图 如图2，酶切产物检测到三种基因型，分别为CC (178bp、193bp)、CT (371bp、178bp、193bp)、 TT (371bp)；分型结果与测定的耐热性状进行相关分析，分析结果如下表1
表1位点A+258G和C+1437T与耐热性状的关联分析结果
权利要求
一种鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记，其特征在于所述耐热性相关分子标记为A+258G和C+1437T。
2.权利要求1所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其特征 在于包括如下步骤(1)鸡基因组DNA的提取；(2)设计2对特异性引物，其核苷酸序列如SEQID NO:广4所示，进行PCR扩增；(3)扩增产物分型，A+258G位点利用PCR产物测序分型，C+1437T位点利用酶切分型。
3.根据权利要求2所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其 特征在于步骤(1)中所述鸡血为抗凝血，抗凝剂为EDTA或肝素钠。
4.根据权利要求2所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其 特征在于步骤(1)中所述提取是用苯酚_氯仿抽提法或试剂盒抽提。
5.根据权利要求2所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其 特征在于步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为Mix占反应体系的50体积％，上游引物和 下游引物各l(T20pmol，Taq酶占反应体系的0. 75体积％，基因组DNA0.广lug，加灭菌双蒸 水至反应总体积。
6.根据权利要求2所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其 特征在于步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为
7.根据权利要求2所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其 特征在于步骤(3)中所述酶切分型的酶切反应体系为PCR产物纩10yL，内切酶;T5U，10X 缓冲液为内切酶体积的2倍，37°C水浴过夜，用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据 电泳条带判断个体的基因型，位点C+1437T酶切产物检测到三种基因型，其中TT基因型为 一条371bp的条带；CC基因型为两条分别为193bp和178bp的条带；CT基因型为三条分别 为 371bp、193bp 和 178bp 的条带。
8.根据权利要求7所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的获取方法，其 特征在所述内切酶为TspA5 I。
9.权利要求1所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记的应用，其特征在于 所述鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记通过遗传育种，增强鸡对高温的耐受 力。
全文摘要
本发明公开了一种鸡热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记及其获取方法和应用。本发明耐热性相关分子标记是在鸡热应激蛋白70基因编码区的A+258G和C+1437T得到的。通过对热应激蛋白70进行PCR扩增，扩增产物直接进行测序筛查单核苷酸多态位点，将所得分型结果与鸡的耐热形状指标进行关联分析，显著相关的多态位点确定为耐热性相关分子标记，得到A+258G和C+1437T。本发明通过获取得到耐热性相关分子标记，可以培育出耐热品系的鸡，通过遗传育种的方法从根本上增强了鸡自身对高温的耐受力。
文档编号C12Q1/68GK101948832SQ201010282780
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者张细权, 江丽燕, 甘建伉, 罗庆斌, 聂庆华, 肖雄, 陈晓芬 申请人:华南农业大学