专利名称：与小麦黄花叶病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，属 于小麦育种和分子生物学领域。
背景技术：
小麦黄花叶病是由小麦黄花叶病病毒(wheal yellow Mosaic Virus, WYMV)引起 的以真菌为介体的土传病毒病。日本的Sawada(1927)首次发现并描述小麦黄花叶病害。 Inouye (1969)证明该病害的病原是小麦黄花叶病毒(WYMV)。由于小麦黄花叶病与首次 在加拿大安大略省的冬小麦上发现的小麦梭条斑花叶病(wheat spindle streak mosaic virus, WSSMV)症状相似(Slykui，1960)，这两个名字都曾被用于我国和欧洲分离物，后 来通过不同地区分离物的基因组研究证实北美和欧洲分离物为WSSMV，而亚洲分离物为 WYMV(Lei, 1998 ；Chen, 2000)，因此在我国，小麦梭条花叶病即应是小麦黄花叶病。小麦黄花 叶病于1962年在四川省天全县被发现(李振岐，1994)，目前主要分布于我国长江、黄河中 下游流域及淮河流域(候庆树，1993)。自90年代以来，全国每年该病的发生面积都达66. 7 万hm2以上。小麦受害后一般减产10 50%，严重田块达85%以上，甚至绝收。近年由于 广泛种植的高产品种大多缺乏对小麦黄花叶病的抗性、小麦重茬种植以及病土中传毒介体 的传毒特性的变化等原因，使病害呈蔓延态势。采用栽培管理措施、药剂防治可减轻病害的 发生，但效果都不明显，利用植物自身的抗性基因培育抗病品种对控制小麦黄花叶病最为 经济有效。研究小麦黄花叶病抗性遗传对抗病育种具有重要的指导意义。因此，自 Dubey (1970)对小麦黄花叶病抗性进行遗传研究以来，秦家忠(1986)、姚金保(1999)、程兆 榜(2000)和岳绪国(2001)、Liu Weihua(2005)等利用 F1, F2、F3、BC1, BC2 群体研究了小麦 黄花叶病抗性遗传，但所得结论并不一致，部分研究认为由1对主基因控制，部份认为受3 对或3对以上多基因控制。目前对此病害分子遗传机制等遗传基础方面的研究还处于起步 阶段，从分子水平对小麦黄花叶病进行基因定位和分子标记研究的报道也不是很多(Khan， 2000 ；张清平，2005 ；Liu, 2005 ；颜伟，2008 ；Zenta，2010)。根据目前的研究结果，大多数人 认为抗性基因存在于2D染色体长臂上(Khan，2000 ；Liu, 2005a ；颜伟，2008 ；Zenta, 2010)， 也有人认为抗性基因存在于2D染色体短臂或2A染色体上(张清平，2005;Liu ffeihua, 2005b)。因此为进一步明确小麦黄花叶病抗性分子遗传规律，同时拓宽小麦黄花叶病抗性 遗传基础，有必要对不同的小麦黄花叶病抗源在全基因组水平进行分子遗传基础研究。小麦品种CI12633是来自美国的抗白粉病及纹枯病的材料(刘朝晖，2000 ；颜伟， 2004)。经本项目组多年鉴定，CI12633具有较好的黄花叶病抗性。目前为止尚未有与CI12633抗小麦黄花叶病主效QTL相连锁的分子标记报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，针对目前人们对小麦黄花叶病的认知和研究的现状，提 供小麦黄花叶病抗性主效QTL的分子标记及其在抗小麦黄花叶病育种中的应用。本发明目的是这样实现的一种与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标 记，其特征在于，采用PCR引物Wmc327和Gwml54对小麦品种CI12633的DNA进行PCR扩增， 扩增产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧 密连锁的分子标记Xwmc327-180和Xgwml54_105，它们的大小分别为180bp和105bp。在本发明中所述的小麦品种CI12633的DNA是指对CI12633小麦植株的叶片 分离提取获得的DNA ；所述的12%聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有 11. 6克丙烯酰胺和0. 4克甲叉双丙烯酰胺。上述与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于将 分子标记Xwmc327-180和Xgwml54-105用于小麦品种CI12633的衍生品种或品系的基因型 检测，以判断该衍生品种或品系是否具有小麦黄花叶病抗性。在本发明的应用中所述的小麦品种CI12633的衍生品种或品系是指以小麦品 种CI12633为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或采用玉米与小麦 杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦衍生品 种或品系。在本发明的应用中所述的小麦品种CI12633的衍生品种或品系还包括以小麦 品种CI12633的衍生品种或品系为父本或母本，再与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上的衍 生品种或品系。在本发明的应用中分别采用PCR引物Wmc327和Gwml54对小麦品种CI12633的 衍生品种或品系的DNA进行PCR扩增，扩增产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，通过 判断与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记Xwmc327-180和Xgwml54-105在小 麦品种CI12633的衍生品种或品系的DNA中的同时存在与否，来预测该衍生品种或品系是 否具有小麦黄花叶病抗性，同时存在所述两个分子标记的小麦品种CI12633的衍生品种或 品系，它们对小麦黄花叶病的抗性达到“中抗”以上水平，同时不存在所述两个分子标记的 小麦品种CI12633的衍生品种或品系，它们对小麦黄花叶病的抗性达到“感病”。在本发明的应用中所述的“中抗”以上水平是指对小麦黄花叶病的抗性达到“抗 病”或“中抗”，其中，“抗病”是指该衍生品种或品系对小麦黄花叶病的实际病情指数小于 20%，“中抗”是指该衍生品种或品系对小麦黄花叶病的实际病情指数达到20. 1 35. 0%;所 述的“感病”是指该衍生品种或品系对小麦黄花叶病的实际病情指数在35%以上。本发明的优点在于充分发挥分子标记Xwmc327-180、Xgwml54-105辅助选择的特 长，利用分子标记Xwmc327-180、Xgwml54-105辅助选择不受环境条件的影响的特点，通过 检测这些分子标记可以预测小麦植株的黄花叶病抗性，在低世代就可以对小麦新品种或新 品系的小麦黄花叶病抗性进行选择。采用分子标记XWmc327-180、XgWml54-105辅助选择不 仅准确性高，加快对抗黄花叶病小麦的选择进度，同时也将大大减少了育种的工作量，提高 了育种效率，克服了常规抗小麦黄花叶病品种或品系育种周期长、后期筛选工作量大、对品 种或品系进行鉴定的效率低等缺陷和不足。
图1是CI12633的5A染色体上小麦抗黄花叶病主效QTL分析的LOD值分布图。
具体实施方式
实施例1小麦黄花叶病抗源CI12633的测定1、提取小麦品种CI12633的DNA将小麦品种CI12633的植株的叶片采用CTAB提取方法进行分离提取获得的DNA。2、对小麦品种CI12633的DNA进行检测，筛选出与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧 密连锁的分子标记PCR 引物 Wmc327:上游引物5，TGCGGTACAGGCAAGGCT3，；下游引物5，TAGAACGCCCTCGTCGGA3，。PCR 引物 Gwml54:上游引物5，TCACAGAGAGAGAGGGAGGG3，；下游引物4:5，ATGTGTACATGTTGCCTGCA 3，。PCR 扩增利用PCR引物Wmc327对获得的小麦品种CI12633植株的DNA进行扩增，扩增产物 在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得大小为ISObp的分子标记Xwmc327-180。利用PCR引物Gwml54对获得的小麦品种CI12633植株的DNA进行扩增，扩增产物 在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得大小为105bp的分子标记Xgwml54-105。上述对PCR扩增产物电泳分离使用的12%聚丙烯酰胺凝胶是100ml聚丙烯酰胺 胶溶液中含有11. 6克丙烯酰胺和0. 4克甲叉双丙烯酰胺。通过MapQTL5. 0软件进行QTLs分析，获得CI12633的5A染色体抗性QTL的LOD 值分布图(见图1)，其中左边为5A染色体遗传连锁图；右边的曲线图为QTL的LOD值分 布图。由图1可见，大小为180bp、105bp的分子标记Xwmc327-180、Xgwml54_105位于该QTL 两侧，与该QTL紧密连锁。实施例2利用大小分别为180bp和105bp的分子标记Xwmc327-180、Xgwml54_105对小麦品 种CI12633的衍生品系进行小麦黄花叶病抗性预测鉴定对象采用小麦品种CI12633与扬麦158杂交，繁衍到F8代的后代，不同的株系号分别 定义为:E294, E304, E310, E313, E316, E322, E332, E351，E367，E386。将它们都作为对行小 麦黄花叶病抗性未知的鉴定对象。将对小麦黄花叶病抗性已知的小麦品种CI12633和扬麦158作为参照鉴定对象。鉴定过程a)利用与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记进行鉴定先从各鉴定对象的叶片采用CTAB提取方法进行分离提取获得的DNA，然后用分子 标记Xwmc327-180、Xgwml54-105的引物分别对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)[分离提取DNA以及PCR扩增和电泳分离过程与实施例1相同]。每个鉴定对象均采用三个重复。 获取的鉴定结果记录在表1中当PCR扩增、电泳分离后存在相应的分子标记时，记录为A， 否则记录为B。b)将经过分子标记鉴定的株系，后续两年在田间进行抗性鉴定，鉴定方法是将以上鉴定材料分别于2006、2007年秋种植于江苏省农科院小麦黄化叶病病圃， 每株系12单株，设置2个重复，采用自然发病法鉴定抗病性。分别于2007、2008年3月小 麦返青期，发病最重时记录病情，每个株系全部单株都调查病级。分级标准参照侯庆树等 (1990)的方法。0级，无病症；1级，植株矮缩不明显，轻度花叶，一般不产生明显的条纹坏 死斑，叶片不黄化或少数黄化；2级，病株轻度矮缩，花叶明显，条纹斑占叶面积1/2左右，部 分叶片黄化，少数枯死，分蘖黄化矮缩；3级，植株明显矮缩，严重花叶，条纹斑占叶面积3/4 左右，心叶扭曲或呈缩顶状，叶片黄化，部分叶片和分蘖或整株枯死。病情指数的计算公式为
权利要求
一种与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，采用PCR引物Wmc327和Gwm154对小麦品种CI12633的DNA进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记Xwmc327 180和Xgwm154 105，它们的大小分别为180bp和105bp。
2.根据权利要求1所述的小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在 于所述的小麦品种CI12633的DNA是指对CI12633小麦植株的叶片分离提取获得的DNA ； 所述的12%聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有11. 6克丙烯酰胺和0. 4 克甲叉双丙烯酰胺。
3.一种如权利要求1所述的分子标记的应用，其特征在于将分子标记Xwmc327-180 和Xgwml54-105用于小麦品种CI12633的衍生品种或品系的基因型检测，以判断该衍生品 种或品系是否具有小麦黄花叶病抗性。
4.根据权利要求3所述的分子标记的应用，其特征在于所述的小麦品种CI12633的 衍生品种或品系是指以小麦品种CI12633为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采 用花药培养、或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用 遗传转化方法获得的小麦衍生品种或品系。
5.根据权利要求4所述的分子标记的应用，其特征在于所述的小麦品种CI12633的 衍生品种或品系还包括以小麦品种CI12633的衍生品种或品系为父本或母本，再与其他 小麦杂交并繁衍至F2代以上的衍生品种或品系。
6.根据权利要求3或4或5所述的分子标记的应用，其特征在于分别采用PCR引物 Wmc327和Gwml54对小麦品种CI12633的衍生品种或品系的DNA进行PCR扩增，扩增产物 在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，通过判断与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的 分子标记Xwmc327-180和Xgwml54_105在小麦品种CI12633的衍生品种或品系的DNA中的 同时存在与否，来预测该衍生品种或品系是否具有小麦黄花叶病抗性，同时存在所述两个 分子标记的小麦品种CI12633的衍生品种或品系，它们对小麦黄花叶病的抗性达到“中抗” 以上水平，同时不存在所述两个分子标记的小麦品种CI12633的衍生品种或品系，它们对 小麦黄花叶病的抗性达到“感病”。
7.根据权利要求6所述的分子标记的应用，其特征在于所述的“中抗”以上水平是指 对小麦黄花叶病的抗性达到“抗病”或“中抗”，其中，“抗病”是指该衍生品种或品系对小麦 黄花叶病的实际病情指数小于20%，“中抗”是指该衍生品种或品系对小麦黄花叶病的实际 病情指数达到20. 1 35. 0% ；所述的“感病”是指该衍生品种或品系对小麦黄花叶病的实 际病情指数在35%以上。
全文摘要
本发明涉及一种与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，采用PCR引物Wmc327和Gwm154对小麦品种CI12633的DNA进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得与小麦黄花叶病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记Xwmc327-180和Xgwm154-105，它们的大小分别为180bp和105bp，并将所述分子标记用于小麦品种CI12633的衍生品种或品系的基因型检测，以判断该衍生品种或品系是否具有黄花叶病抗性。
文档编号C12Q1/68GK101935654SQ20101028687
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者任丽娟, 周淼平, 姚金保, 杨学明, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院