专利名称：荠菜冷诱导COR15a基因及其在改良植物的抗寒性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种荠菜冷诱导基因 CORl^a{CbCOR15a)及其制备方法，还涉及该基因的重组质粒，并将其应用于植物逆境基因 特别是用于植物抗寒基因的遗传转化，达到提高植物抗寒性的目的。
背景技术：
植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进 化的遗传基因型控制，又受个体发育中的生理生态因素制约。温度作为重要的环境因子 之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用。低温寒害不仅是 农业生产中一种严重的自然灾害，亦是影响植物由南向北移动的一个非常重要的限制因 素。冷驯化是通过低温诱导植物形成抗冷力的过程。近年来的研究发现植物中的冷调节 蛋白(cold regulated proteins，CORPs)禾口冷马川化蛋白(cold acclimation proteins, CAIPs)是植物在冷驯化下产生的特异性蛋白质，他的最大特点在于其能够保护植物在低 温和干旱时避免受伤害，该蛋白可以避免细胞的过度失水对植物造成伤害(Mohapatra SS, ffolfraim L, Poole RJ, Dhindsa RS. Molecular cloning and relationship to freezing tolerance of cold-acclimation-specific genes of Alfalfa. Plant Physiol, 1988, 89:375-380; Gilmour SJ, Artus NN, Thomashow MF. cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaiiana. Plant Mol Biol 1992，18: 13-21)。由于冷调节蛋白的功能和特性的研究，使得人们通 过生物技术的手段培育抗寒植物成为可能。目前在植物中已发现了多种冷调节蛋白，但 不同植物之间及同一植物内部，不同的冷调节蛋白的氨基酸组成、序列、重复单元、重复次 数、空间结构、组织特异性分布等方面均表现出一定程度的差异性，它们的组成与结构也呈 现出多样性和复杂性。C0R15a基因是从拟南芥中分离出来的冷调节蛋白基因，是目前研 究最多的基因之一。C0R15a在低温诱导下表达后，可增加质膜的晶体稳定性，增加其原生
(Anus NN, Uemura M, Steponkus PL, Gilmour SJ, Lin C, Thomashow MF. Constitutive expression of cold-regulated Arabidopsis thaliana C0R15a gene affects both c chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1996， 93:13404-13409)。荠菜、Capsella torsa-pastori s)是一种1或2年野生的草本植物，平铺地 面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用蔬菜，属于十字花科(Cruciferae)、荠菜属 (Capsella)，在低温条件下能够正常生长发育并结实。本发明所涉及的荠菜冷调节基因 {CbC0R15a)是从荠菜叶片的总RNA中克隆得到的。目前尚未发现有关荠菜冷调节基因 CbC0R15a的研究和利用该基因培育耐寒植物的相关报道。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新的冷诱导基因、CbCorl5a)，该基因是从荠菜 中克隆到的，是植物在冷驯化下产生的高表达的蛋白质。本发明的第二目的是提供一种新的冷诱导蛋白ij0bCorl5a)。本发明的第三目的是提供这种荠菜冷诱导蛋白多肽和编码序列在利用转基因技 术改良植物抗逆(耐低温)上的应用。在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有荠 菜冷诱导蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸 第1-674位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度 严紧条件下与SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序 列编码具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供了一种分离出的荠菜冷诱导蛋白质多肽，它包括具有 SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肤、或其活性片段，或其活性衍生物。较 佳地，该多肽是具有SEQ ID No. 2序列的多肽。在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿 主细胞是酵母细胞、拟南芥、烟草和其它植物细胞。在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有荠菜冷诱导蛋白质活性的多肽的方 法，其步骤如下
(1)将编码具有荠菜冷诱导蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调 控序列，形成荠菜冷诱导蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸第 1-674位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成荠菜冷诱导蛋白的重组细胞；
(3)在适合表达荠菜冷诱导蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；
(4)分离出具有荠菜冷诱导蛋白活性的基本纯的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID No. 1中第1_674位的序列。在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有荠菜冷诱导蛋白 活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对干旱的耐受性的方法，其步骤如下
(1)将编码具有荠菜冷诱导蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表 达调控序列后，形成含荠菜冷诱导蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共 培养，在22-28°C条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有荠菜冷诱导 蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有荠 菜冷诱导蛋白基因的转基因植株对植物干旱耐受特性具有增强的作用。较佳地，在该方法中使用的核苷酸序列具有SEQ ID No. 1中第1_674位的序列。 本发明还提供了与荠菜冷诱导蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗 体。在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段己从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA.或片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组份 分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语“荠菜冷诱导蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有荠菜冷诱 导蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No. 1中第1-674位核苷酸序列及其简并序 列。该简并序列是指，位于SEQ ID No. 1序列的编码框第1-674位核苷酸中，有一个或多 个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性， 所以与SEQ ID No. 1中第1-674位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出 SEQ ID No. 2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下 与SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括 与SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%， 更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的荠菜冷诱导蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID No. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常 为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取 代，以及在5 ’和/或3 ’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10 个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳 地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的 方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含 天然状态下伴随其的组分。在本发明中，术语“荠菜冷诱导蛋白或多肽”指具有荠菜冷诱导蛋白活性的SEQ ID No. 1序列的多肽。该术语还包括具有与天然荠菜冷诱导蛋白相同功能的SEQ ID No. 2序 列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或 N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基 酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功 能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。 该术语还包括荠菜冷诱导蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的荠菜冷诱导蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位 变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与荠菜冷诱导蛋白DNA杂交的 DNA所编码的蛋白、以及利用荠菜冷诱导蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“荠菜冷诱导蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID No. 1的氨基酸序列 相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替 换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。发明还包括荠菜冷诱导蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然冷诱导蛋白多肽 的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而 有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通 过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技 术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有
5非天然存在的或合成的氨基酸(如0、氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并 不限于上述列举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸 酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在 生产本发明的荠菜冷诱导蛋白多肽时，可以将荠菜冷诱导蛋白编码序列可操作地连于表达 调控序列，从而形成荠菜冷诱导蛋白表达载体。表 权利要求
一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜冷诱导基因CbCOR15a，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中碱基第1 674位的序列所示。
2.一种包含荠菜冷诱导基因伐OMVfe的重组质粒，其特征在于，它含有权利要求1所 述的核苷酸序列。
3.一种荠菜冷诱导蛋白CbC0R15a，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
4.按照权利要求3所述的荠菜冷诱导蛋白CbCOR，其特征在于，所述的荠菜冷诱导蛋白 CbC0R15a由137个氨基酸构成的蛋白质。
5.如权利要求1所述的荠菜冷诱导基因CbC0R15a的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤(1)材料的培养，将荠菜种子经过消毒后，播种于含培养基的培养罐内；(2)提取冷驯化后的荠菜中RNA，经1%非变性琼脂糖凝胶电泳，用260-280nm波长的紫 外扫描来分析其质量；(3)采用RACE方法克隆得到荠菜冷诱导基因伐OMVfe的全长序列，RACE采用的引 物为 5’ CbC0R15al 5'-CTCTCCTGCTTTACCCTCCGCGAA-3'，5’ CbC0R15a2 5' -TTCTTTTCCT TTCTCCTCCACATA-3'。
6.如权利要求2所述的包括荠菜冷诱导基因伐OMVfe的重组质粒的制备方法，其特征 在于，包括以下步骤(1)根据如权利要求1所述的荠菜冷诱导基因CbC0R15a的核苷酸序列，设计一对能扩 增出完整开放阅读框(0RF)的引物，在正向引物和反向引物上分别引入限制性酶切位点；(2)将上述扩增得到的荠菜冷诱导基因CbC0R15a的0RF克隆到中间载体pMD18_T，进 一步克隆到植物表达载体P1304上；(3)将上述表达载体转入根癌农杆菌EHA105中，用于转化模式植物烟草。
7.如权利要求3所述的荠菜冷诱导蛋白CbC0R15a的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤(1)构建原核表达载体pQE30-CbC0R，并转化大肠杆菌M15；(2)荠菜冷诱导蛋白CbC0R15a的诱导表达及SDS-PAGE检测；(3)荠菜冷诱导蛋白CbC0R15a的纯化先超声破碎，再煮沸，然后通过M亲和层析柱， 最后PEG浓缩。
8.如权利要求2所述的包含荠菜冷诱导基因伐OMVfe的重组质粒在改良植物抗寒性 与耐寒性中应用。
9.如权利要求8所述的荠菜冷诱导基因伐OMVfe在植物抗寒性与耐寒性中应用，其特 征在于，所述植物为水稻、小麦、玉米、棉花、油菜或番茄。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种荠菜冷诱导CbCOR15a基因及其在改良植物的抗寒性中的应用。该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，CbCOR15a基因是具有序列表SEQIDNO:1中碱基第1-674位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个受零上低温诱导表达，在正常温度下停止表达或降低表达，表达后能促进细胞产生抗冷力的基因。利用该基因片段构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时表达。本发明还提供基于上述基因培育抗寒植物的应用方法，用于农作物品种的改良。
文档编号C12N15/63GK101979578SQ201010289038
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者吴丽华, 周明琦, 林娟, 沈忱 申请人:复旦大学