专利名称：一种大肠杆菌k88的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠杆菌K88的快速检测方法，尤其是涉及一种利用大肠杆菌 K88菌毛蛋白适配体对大肠杆菌K88进行快速检测的方法。
背景技术：
环境、食品携带病原菌致病是当今世界上最为普遍的问题之一。在环境卫生不良的情况下，大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia co/i)常随 粪便散布在周围环境中，若在水和食品中检出大肠杆菌，可认为是被粪便污染的指标，从而 证明可能有肠道病原菌存在。因此，大肠菌群数或大肠菌值常作为饮水和食物或药物的卫 生学标准。大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多数不致病，但在一定条件下可引起 肠道外感染。大肠杆菌菌毛株含有特定的菌毛蛋白，与细菌对宿主上皮细胞的吸附起到至 关重要的作用。它们大多数能产生耐热肠毒素与不耐热肠毒素黏附于小肠粘膜上皮并定居 繁殖产生肠毒素导致严重腹泻、脱水最后衰竭死亡。应用传统的检测方法检测大肠杆菌整个过程需要48_72h。利用快速检测技术与富 集培养基技术相结合，能使整个过程所需时间减少如利用大多数大肠杆菌血清型的运动 性能发展的选择运动性富集技术，预富集和选择富集的结合技术；阻抗微生物学技术；利 用过滤、离心和超声波从食品和竞争菌中移去目标菌并浓缩到一个小体积中的分离浓缩技 术。免疫学技术构成了最大一类选择性技术，它们包括荧光抗体技术，ELISA技术。为了增 加目标抗原量达到检测水平105-107cfU/ml，大多数市场可获得的ELISA方法均结合了传 统的预先和后选择富集培养基方法，整个检测过程还是需要24-56h。而核酸检测方法涉及 DNA杂交和PCR技术，也包括菌落杂交，水溶液中单相杂交和几种商业PCR检测试剂盒，它 们的检测下限为10°-102cfu/ml。从整体水平看，传统的检测技术要求低，不需要特殊的仪器，并且价廉。但最大的 缺点是耗时费力。选择性技术明显克服了传统方法的缺点，但富集过程复杂并且要求熟练 工人操作，而且由于要得到一个阳性结果需要较高数量的目标菌，也不能在一天内得到结 果。总之，现在还没有一种理想的技术用于检测环境中的大肠杆菌。
发明内容
本发明的目的在于克服现有大肠杆菌K88检测技术存在的缺陷，提供一种灵敏度 高，设备简单，操作简便的大肠杆菌K88的快速检测方法。本发明之大肠杆菌K88快速检测方法的技术方案是
研究表明，适配体(Aptamers )是能够与许多目标分子(包括蛋白、药物、无机或有机分 子等)发生高亲合性和特异性结合的一类单链核苷酸(DNA or RNA)，长度通常在30-70核 苷酸之间，能借助自身的折叠能力形成一个复杂的具有结合能力的口袋和沟糟三维结构， 将小分子结合到它们的核酸结构中或者整合到大分子结构中，具有pmol的解离常数。至今发现高亲和特异性适配体的方法是配体指数富集系统展开(SELEX)。与抗体比较，适配体优 势在于其大小和非蛋白质特性，并且在许多方面呈现较强的化学特性和生物学特性。最大 的优势是不需要使用动物生产并可用体外方法分离制备。也可用化学合成生产、修饰，以提 高它们的稳定性、亲合性、特异性、抗变性能力和寿命。本发明技术方案的原理是大肠杆菌K88菌毛蛋白的适配体能特异性的识别大肠 杆菌K88，标记有荧光基团(FAM)的适配体与大肠杆菌K88结合后，适配体上的荧光信号通 过荧光分光光度计捕捉，根据荧光信号的有无可以进行大肠杆菌K88的定性检测，根据不 同的荧光强度，可以实现对大肠杆菌K88的定量检测。 应用大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体检测大肠杆菌K88的具体方法，包括以下步 骤
(1)选择生化方法合成并完成荧光修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体5’端荧光基 团修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体，其基因序列是
将上述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体用灭菌的超纯水溶解，使浓度为5 μ Μ, -20°C保 存；使用之前，90-95°C处理5-10 min，置于冰上冷却至室温，使之变性；
(2)制备已知浓度的检测体系将1-3ml大肠杆菌K88接种于200_500ml LB培养基 中，35-37°C 180-200rpm培养26-32h后，进行平板计数，求出每毫升大肠杆菌的数目；按比 例稀释成 102、IO3UO4 UO5 UO6 UO7 UO8、109cfu/ml 8 个浓度；各浓度各取 500 μ 1 至 EP 管中，6000-8000g离心10-20分钟后弃上清，每个EP管中加100-200 μ 1磷酸缓冲液(所述 磷酸缓冲液简称“PBS”，市场有销售)悬浮菌体；
(3)将此大肠杆菌Κ88菌毛蛋白适配体与待测细菌结合在所述8个盛有不同浓度大 肠杆菌Κ88溶液的EP管中分别加入50 μ 1大肠杆菌Κ88菌毛蛋白适配体，再加入磷酸缓冲 液使终体积为500μ 1，37°C孵育l-2h后6000-8000g离心10-20min，弃上清；再分别加入 500-1000 μ 1 PBS吸打混勻8000g IOmin弃上清；重复3次，结合了适配体的菌体沉淀悬 浮于500 μ 1磷酸缓冲液中待用；
(4)用大肠杆菌Κ88菌毛蛋白适配体检测大肠杆菌Κ88，测定荧光值，绘制标准曲线 分别将8个EP管中的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定450nm激发波长时 520nm发射波长的荧光值；根据大肠杆菌K88浓度的对数值相应的荧光值绘制标准曲线；
(5)制备待测样品检测体系，测定待测样品的荧光值制备样品检测体系取 500-1000 μ 1 样品 6000-8000g 离心 10-20 min，弃上清；沉淀悬浮于 100-200 μ 1 PBS 中， 加入50 μ 1适配体至终体积500 μ 1 ；再加入磷酸缓冲液使终体积为500μ 1，37°C孵育 l-2h后6000-8000g，离心10-20min，弃上清；再加入500-1000 μ 1磷酸缓冲液吸打混勻， 6000-8000g离心10-20min弃上清；重复3次，结合了适配体的菌体沉淀悬浮于500 μ 1磷 酸缓冲液中待用；将溶液置于石英比色皿中，将溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计 测荧光值；
(6)根据测得的待测样品的荧光值，查大肠杆菌Κ88浓度的对数值与对应的荧光值标 准曲线，即求得样品中大肠杆菌Κ88的含量。本发明的优点灵敏度高，特异性强，操作简便，适合测定含大肠杆菌Κ88的各种 试样，在环境监测及食品分析等方面具有十分重要的意义。
图1为本发明实施例测定大肠杆菌K88的荧光浓度图谱(A，B, C, D, E, F, G, H分别代表着IO9UO8UO7 UO6 UO5UO4UO3UO2 cfu/ml的大肠杆菌K88的荧光值)。图2为大肠杆菌K88浓度的对数值与对应的荧光值标准曲线。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步说明。(1)选择由上海生工合成并完成荧光修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体5’端 荧光基团修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体，其基因序列是
将所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体用灭菌的超纯水溶解，使浓度为5 μ Μ, -20°C保 存；使用之前，95°C处理5 min，置于冰上冷却至室温，使之变性；
(2)制备已知浓度的检测体系将Iml大肠杆菌K88接种于200mlLB培养基中， 370C 200rpm培养26h后，进行平板计数，求出每毫升大肠杆菌的数目；按比例稀释成102、 IO3UO4 UO5 UO6 UO7 UO8、109cfu/ml 8个浓度；各浓度各取500 μ 1分别放于8个EP管 中，8000g离心10分钟后，弃上清，每个EP管中加100 μ 1 PBS悬浮菌体；
(3)将所述5’端荧光基团修饰的大肠杆菌Κ88菌毛蛋白适配体与待测细菌结合在所 述8个盛有不同浓度大肠杆菌Κ88溶液的EP管中分别加入50 μ 1大肠杆菌Κ88菌毛蛋白 适配体，吸打混勻，再分别加入PBS使终体积为500 μ 1，37°C孵育Ih后8000g离心lOmin， 弃上清；再分别加入500 μ IPBS吸打混勻，SOOOg离心lOmin，弃上清；重复3次，结合了所 述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体的菌体沉淀悬浮于500 μ 1 PBS中，待用；
(4)用大肠杆菌Κ88菌毛蛋白适配体生物传感器比色皿检测大肠杆菌Κ88，测定荧光 值，绘制标准曲线分别将8个所述EP管中的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测 定450nm激发波长时520nm发射波长的荧光值(大肠杆菌Κ88的荧光浓度图谱参见图1)； 根据大肠杆菌K88浓度的对数值相应的荧光值绘制标准曲线(参见图2)；
(5)制备待测样品检测体系，测定待测样品的荧光值取500μ 1样品SOOOg离心10 min，弃上清；沉淀悬浮于100 μ IPBS中，加入50 μ 1所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体至终 体积500 μ 1 ；再加入PBS使终体积为500μ 1，37°C孵育Ih后8000g，离心lOmin，弃上清； 再加入500 μ IPBS吸打混勻8000g IOmin弃上清；重复3次，结合了适配体的菌体沉淀悬 浮于500μ1 PBS中；将溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定450nm激发波长时 520nm发射波长的荧光值；
(6)根据样品测得的荧光值，查标准曲线，即可以求得样品中的大肠杆菌K88的含量。验证用本方法测定废水样品2份，用上述1-6步骤进行检测，检测结果是大肠杆 菌K88含量分别为3981 cfu/ml和501cfu/ml，证明本方法可靠。本发明实施例测定大肠杆菌K88的检出限为102cfu/ml。
权利要求
一种大肠杆菌K88的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)选择生化方法合成并完成荧光修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体5’端荧光基团修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体，其基因序列是将所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体用灭菌的超纯水溶解，使浓度为5μM， 20℃保存；使用之前，90 95℃处理5 10 min，置于冰上冷却至室温，使之变性；(2)制备已知浓度的检测体系将1 3 ml大肠杆菌K88 接种于200 500ml LB培养基中，35 37℃ 180 200rpm培养26 32h后，进行平板计数，求出每毫升大肠杆菌的数目；用灭菌的超纯水按比例稀释成102、103、104 、105 、106 、107 、108 、109cfu/ml 8个不同浓度溶液；各浓度溶液分别取500μl放于8个EP管中，6000 8000g离心10 20分钟后弃上清，每个EP管中加100 200μl 磷酸缓冲液悬浮菌体；(3)将所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体与待测细菌结合50μl所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体分别加入步骤(2)所述8个不同浓度的大肠杆菌K88溶液中吸打混匀，再加入磷酸缓冲液使终体积为500μl，37℃孵育1 2h后6000 8000g离心10 20min，弃上清；再分别加入500 1000μl PBS 吸打混匀， 8000g离心 10min 弃上清；重复3次，结合了大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体的菌体沉淀悬浮于500μl 磷酸缓冲液中待用；(4)用大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体检测大肠杆菌K88, 测定荧光值，绘制标准曲线分别将所述8个EP管中的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定450nm激发波长时520nm发射波长的荧光值；根据大肠杆菌K88浓度的对数值相应的荧光值绘制标准曲线；(5)制备待测样品检测体系，测定待测样品的荧光值取500 1000μl样品6000 8000g离心10 20 min，弃上清；沉淀悬浮于100 200μl PBS中，加入50μl大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体至终体积500μl；再加入磷酸缓冲液使终体积为500μl，37℃孵育1 2h后6000 8000g，离心10 20min，弃上清；再加入500 1000μl 磷酸缓冲液吸打混匀，6000 8000g离心10 20min 弃上清；重复3次，结合了大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体的菌体沉淀悬浮于500μl 磷酸缓冲液中待用；将溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测荧光值；(6)根据测得的待测样品的荧光值，查大肠杆菌K88浓度的对数值与对应的荧光值标准曲线，即求得样品中大肠杆菌K88的含量。365275dest_path_image002.jpg
全文摘要
一种大肠杆菌K88的快速检测方法，该方法是选择标记荧光基团(FAM)的适配体与大肠杆菌K88结合后，适配体上的荧光信号得到捕捉；制备已知大肠杆菌K88浓度的被测体系，在激发波长455nm处测量发射波长nm的荧光值，绘制标准曲线，再制备待测样品体系，根据其荧光值查对标准曲线，求得待测样品中的大肠杆菌K88含量。本发明灵敏度高，特异性强，测定范围宽，设备简单，操作简便，适合测定含大肠杆菌K88各种样品中大肠杆菌K88含量，在环境监测及食品分析等方面具有十分重要的应用价值。
文档编号C12Q1/06GK101968447SQ20101029199
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者丁兴华, 彭智辉, 李华, 邓乐 申请人:邓乐