专利名称：动物双歧杆菌及其制备双歧杆菌发酵饮料的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株动物双歧杆菌及其在制备双歧杆菌发酵饮料中的应用，特别涉 及一动物双歧杆菌菌株及其发酵雪莲果复合汁制备发酵饮料的工艺。
背景技术：
人体肠道内存在数以百万亿个细菌，这些菌大多数与人和平共处有益而无害， 称为人体正常菌群。人体肠道菌群的总重量约占人体总重量的1/50 1/60，其中95% 以上是活菌，每天在人体肠道内进行着活跃的生长代谢活动。堪称人体第六大器官。人 体的营养、消化、生物拮抗、免疫、抗肿瘤、药物效能和抗衰老等与人体肠道微生物密 切相关。双歧杆菌是人体消化道菌群中的优势益生菌之一，自婴儿出生2 3天开始增 殖，5 7天达高峰，并占绝对优势。口服抗菌药物、手术、饮食变化，疾病和衰老等 均能使肠道双歧杆菌数量发生变化，随着年龄的增长，歧杆菌数量逐渐减少，体弱多病 的老人肠道内该菌几乎消失，而健康人双歧杆菌保持着恒定的数量约108 109CFU/ml。 这反映出人体肠道内双歧杆菌的数量乃是检验人是否健康的指标之一。随着微生态学的发展和对双歧杆菌的认识，大量研究证实了双歧杆菌在人体内 发挥着多种生理活性功能，包括拮抗致病菌，调节肠道菌群平衡，调节免疫，抗癌， 抗肿瘤，延缓衰老等。因此双歧杆菌在食品及医学界受到广泛关注。目前国内外已开发了多种双歧杆 菌制品。医药产品有1)片剂形式，如金双岐三联活菌片2)胶囊或冲剂，如胶囊形式的 丽珠肠乐胶囊，冲剂形式的优菌多颗粒、女士优菌多颗粒、龙宝宝益生菌冲剂等。3)液 体制剂如三株口服液、株王常维舒口服液。这些产品在治疗肠道菌群失调引起的腹泻、 慢性腹泻、抗生素治疗无效的腹泻及便秘的等方面发挥了很大的作用，同时也是某些临 床疾病的良好的辅助药物。双歧杆菌保健品及食品有昂立一号；双歧杆菌与保加利亚 乳杆菌、嗜热链球菌混合发酵的酸奶，酸豆乳；添加双歧杆菌代谢产物的食品如日本的 L-乳酸的新型保健糖果等。近年来兴起了对于以其它食材为原料，生产双歧杆菌及其代谢产物或保健食品 的研究。目前还未见以雪莲果为原料的双歧杆菌饮品或制剂上市。雪莲果，学名Smallanthus sanchifalius，别名晶薯、菊薯、神果、地参果。属
菊科，葵花属植物，故又称为菊薯，原产自南美洲的安第斯山脉，是当地印第安人的一 种传统根茎食品，已有500年历史。1985年日本琦玉县引种成功，近年来通过多种途径 进入中国，目前已在云南、福建、海南、贵州、湖南、湖北、山东、河南、河北引种栽 培成功。生产示范面积逾96公顷。产品多用于出口，部分进入超市。
发明内容
本发明的目的是提供一株动物双歧杆菌及其在制备双歧杆菌发酵饮料中的应用。动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis) 01已于2005年04月13日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCM.1353。动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis) 01，其保藏编号为 CGMCC 1353。本发明还提供一种雪莲果双歧杆菌发酵饮料的制备方法，是将动物双歧杆菌 (Bifidobacterium animalis) 01 CGMCC 1353活化，扩大培养，接种在含有雪莲果果浆的液 体中，36-38°C厌氧培养至pH为3.8-4.8，结束发酵，获得雪莲果双歧杆菌发酵饮料。1上述方法中，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)01 CGMCC 1353接种前 经过种子活化培养，方法如下所述1) 一代种子的制备将动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis) 01 CGMCC 1353 接种到 MRS 液体培养
基中，在37°C厌氧培养24h_48h得到一代种子。2) 二代种子的制备将一代种子接种在MRS液体培养基中37°C厌氧培养14_16h得到第二代种子。3)三代种子的制备将二代种子接种在MRS培养基中厌氧培养14h得到第三代种子。4)种子扩大培养将步骤3)获得的第三代种子发酵液，以体积比为3%接种量接种至复合果 汁-MRS液体培养基(制备方法如下所示)进行扩大培养。复合果汁-MRS改良液体培养基的制备复合雪莲果汁(含雪莲果果浆的液体)与MRS液体培养基以体积比1 2-2 1 混合，pH7.0，115°C高压灭菌15-20min。复合雪莲果汁与MRS液体培养基体积比优选 为 1 1。2上述方法中，所述含雪莲果果浆的液体按下述方法制备1)雪莲果清洗切分，在85-100°C水中烫漂灭酶，然后捞出雪莲果肉，以雪莲果 肉和水的质量比1 1-5的比例加入水混合打浆，得到雪莲果浆；2)添加是雪莲果浆体积的1-10%的脱脂复原乳和是雪莲果浆体积的1-8%西红 柿汁，混合均质后，得到混合果汁；所述脱脂复原乳的制备方法为10 12.5g脱脂乳加 入1L饮用水，充分搅拌溶解获得脱脂复原乳；3)在混合果汁里充氮，使氧还电位降至-0.03ev以下，灭菌得到复合雪莲果汁。所述含雪莲果果浆的液体制备方法的步骤1)中，所述烫漂灭酶的温度优选为 100 °C,时间优选为10分钟。所述含雪莲果果浆的液体制备方法的步骤1)中，所述雪莲果肉和水的质量比优 选为1 2。所述含雪莲果果浆的液体制备方法的步骤2)中，所述脱脂复原乳的添加量优选 为雪莲果浆体积的5% ；所述西红柿汁的添加量优选为雪莲果浆体积的3%。3所述方法中，所述厌氧培养的温度为37°C ；所述动物双歧杆菌(Bifidobacteri umanimalis)01 CGMCC 1353 的接种量为 1 X 105-1 X 107cfu/ml,优选为 1 X 106cfu/mlcfo/ml。本发明提供的动物双歧杆菌，保藏编号为1353，可用于制备双歧杆菌发酵饮 料。动物双歧杆菌01具有耐受消化道逆环境，抗氧化等保健功效。本发明还利用上述动物双歧杆菌，选择了富含双歧因子且价格低廉的雪莲果， 制备了一种雪莲果双歧杆菌发酵饮料，并优化了该雪莲果双歧杆菌发酵饮料的生产工 艺，其中包括雪莲果复合汁的制备工艺，双歧杆菌种子的制备工艺。在雪莲果汁加入辅 料充氮灭菌，突破了传统乳原料的束缚，配之以营养丰富的脱脂复原乳，并配以西红柿 辅料制成复合果汁，复合果汁经该株双歧杆菌的发酵产生乙酸和乳酸，B族维生素等多 种具有重要生理活性的代谢产物，形成了良好的感官和营养品质。实验证明，成品无菌 灌装，在4°C条件下贮藏15天内双歧杆菌活菌数保持在106CFU/mL以上，大肠菌群在 30天内呈阴性。本发明制备的雪莲果双歧杆菌发酵饮料色泽温和(图1)，口感好，风味 佳，货架期较长，具有良好的保健效果的保健饮品。
图1为本发明的雪莲果双歧杆菌发酵饮料样品(包装形式之一)。图2为基于hsp60序列的动物双歧杆菌01系统发育树
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis) 01CGMCC 1353 的获得一、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis) 01CGMCC 1353 的获得及其鉴定无菌厌氧取得广西巴马长寿老人新鲜粪便25g，置于无菌预还原225mL生理盐 水中。充分混勻，采用亨盖特厌氧稀释技术对样品进行10倍系列稀释，选取稀释倍数为 105、106、107以亨盖特厌氧滚管法进行分离，置于37°C恒温箱培养48 72h。挑选菌落 特征为光滑、凸圆、边缘整齐、乳白色或微带黄色、质地柔软的中小菌落，接种于MRS 液体培养基，厌氧培养24 48h，进行革兰氏染色。挑选具有双歧杆菌形态等特征的 菌落，再进行需氧和厌氧培养，选取仅在厌氧培养条件下生长的菌落，再一次显微镜观 察，选取形态不规则的疑似双歧杆菌菌株，进行鉴定。最终获得一株菌株命名为01。对菌株01进行生理生化与hsp60序列鉴定。GroEL (Hsp60)是分子伴侣家族中 一类，Hsp60广泛存在于原核生物，真核动植物中。其基因序列具有高度保守性。被用 于各物种间亲缘关系的分析。有研究表明双歧杆菌的16S序列非常接近，而hsp60的序 列在双歧杆菌各种之间差异较大，能够更好的区分双歧杆菌所属种。01菌株生理生化检 测结果见表2，动物双歧杆菌01的hsp60基因序列鉴定方法如下1、基因组的提取1)双歧杆菌总DNA的提取基因组提取试剂盒(北京三博志远生物技术有限责任公司)提取双歧杆菌总 DNA。2、目的片段的扩增1)简并引物
H60F 5 ‘ -GG (ATGC) GA (CT) GG (ATGC) AC (ATGC) AC (ATGC) AC (ATGC) GC (ATGC) AC (ATGC) GT-3 ‘H60R 5 ‘ -TC (ATGC) CC (AG) AA (ATGC) CC (ATGC) GG (ATGC) GC (CT) TT (ATGC) AC (ATGC) GC-3 ‘引物的合成由上海英俊生物技术有限公司完成。2)PCR反应体系20u 1 双蒸水14.25ul ； DNTP 2.5ul ；上游引物l.Oul ；下游引 物 l.Oul ； Teq 酶 0.25ul ；模板 l.Oul ；PCR 反应程序初始变性 95°C，5min。退火 46°C，30s ；延伸 72°C，lmin ； 30 个循环；终延伸72°C，lOmin。3、目的片段序列测定与系统发育树构建 将PCR反映体系混合物送至测序公司测序，动物双歧杆菌01的hsp60基因序列 如序列表中序列1所示，将测序得到的hsp60序列与基因bank中序列进行比对，用得到 被测菌株与模式菌株保守序列的相似度。以seqnconverter软件转换序列格式，MEGA3.0软件构建系统发育树。图2显示了动物双歧杆菌01基于hsp60基因序列的 系统发育树。双歧杆菌现有报道的菌种有32种。我们的01菌株在系统发育树中与如双 歧杆菌及动物双歧杆菌在同一个分支上，有人认为乳双歧杆菌为动物双歧杆菌的一个亚 种。另有试验结果证明01菌株的16SrDNA序列更接近动物双歧杆菌。结合生理生化鉴 定结果，将01菌株鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis) 01已于2005年04月13日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCM.1353。表2动物双歧杆菌01的生理生化特性
权利要求
1.动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)01，其保藏编号为 CGMCC 1353。
2.动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis) OICGMCC 1353在制备双歧杆菌发酵饮料中的应用。
3.—种雪莲果双歧杆菌发酵饮料的制备方法，是将动物双歧杆菌(Bifidobacteriuma nimalis) OICGMCC 1353接种在含有雪莲果果浆的培养基中，36_38°C厌氧培养至pH为 4.2-4.5，结束发酵，获得雪莲果双歧杆菌发酵饮料。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述含有雪莲果果浆的培养基是含雪 莲果果浆的液体与MRS液体培养基混合得到的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述含雪莲果果浆的液体按下述方法 制备1)雪莲果清洗切分，在85-100°C水中烫漂灭酶，然后捞出雪莲果肉，以雪莲果肉和 水的质量比1 1-5的比例加入水混合打浆，得到雪莲果浆；2)添加是雪莲果浆体积的1-10%的脱脂复原乳和是雪莲果浆体积的1-8%西红柿 汁，混合均质后，得到混合果汁；3)在混合果汁里充氮，使氧还电位降至-0.03ev以下，灭菌得到含雪莲果果浆的液体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述含雪莲果果浆的液体制备方法的 步骤1)中，所述烫漂灭酶的温度为100°C，时间为10分钟。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述含雪莲果果浆的液体制备方法 的步骤1)中，所述雪莲果肉和水的质量比为1 2。
8.根据权利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述含雪莲果果浆的液体 制备方法的步骤2)中，所述脱脂复原乳的添加量是雪莲果浆体积的5% ；所述西红柿汁 的添加量是雪莲果浆体积的3% ；所述含雪莲果果浆的液体与MRS液体培养基混合的体 积比例是2 1-1 2，优选为1 1。
9.根据权利要求4-8中任意一项所述的方法，其特征在于所述厌氧培养的温 度为37°C ；所述动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)OlCGMCC 1353的接种量为 1 X IO5-I X 107cfu/ml,优选为1 X 106cfo/ml ；所述脱脂复原乳的制备方法为10 12.5g脱 脂乳加入IL饮用水，充分搅拌溶解获得脱脂复原乳。
10.权利要求3-9中任意一项所述的方法制备的雪莲果双歧杆菌发酵饮料。
全文摘要
本发明公开了动物双歧杆菌及其在制备双歧杆菌发酵饮料的应用。该动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)01，其保藏编号为CGMCC 1353。动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)01CGMCC 1353可用于制备双歧杆菌发酵饮料。本发明制备的雪莲果双歧杆菌发酵饮料色泽温和(图1)，口感好，风味佳，货架期较长，具有良好的保健效果的保健饮品。
文档编号C12N1/20GK102010845SQ20101029489
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者刘国荣, 旭日花, 李平兰, 王洋 申请人:中国农业大学