专利名称：乌贼墨寡肽及其酶解制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乌贼墨寡肽，本发明还公开了利用胰蛋白酶进行乌贼墨寡肽酶解 的制备方法，本发明进一步还公开了该乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。
背景技术：
乌贼(Si5Pia)属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科。乌贼的营养丰富，除可食 用外，还具有很好的药用价值。尤其是乌贼的墨汁，早在《本草拾遗》中就有“腹中墨， 主治血刺心痛”的记载。乌贼墨囊一般是作为废弃物，自从日本表森县产业技术开发中 心和弘前大学医学部发现乌贼墨含有抗肿瘤物质以来，科学家们对其抗肿瘤活性进行 研究，发现其具有多种抗肿廇机制，如乌贼墨有提高免疫功能，诱生细胞因子，抑制癌细 胞生长的作用。国内的公开文献可以参考《现代食品科技》Vol 21 No. 1，文章篇号为 1007-2764(2005)01-0069-21，杜铁平等著的“乌贼墨抗菌活性的分离与研究”，又可以参考 《中国肿瘤》2005年第14卷第3期，刘淑萍所著的“乌贼墨抗肿瘤作用研究进展”，再可以参 考《中国药师》2003年第6卷第10期，李孝东和袁建华所著的“乌贼墨抗肿瘤机制研究进 展”。这些充分显示了乌贼墨在抗肿瘤药物开发具有十分显著的潜在价值，因此挖掘其潜在 的药用价值对充分利用海洋资源、扩大药源也有深远意义。生物活性肽的制备主要有三条途径一是从自然界的生物体中提取其本身固有的 各种天然活性肽类物质；二是通过蛋白质降解的途径可以获得具有各种生理功能的生物活 性物质；三是应用合成方法来制备生物活性肽。将这三种方法的优缺点进行比较，蛋白质酶 降解法生产活性肽安全性极高，能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水 解过程易控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种活性高、抗肿瘤显 著的乌贼墨寡肽。本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种活性高、反应条件易于控制的乌贼 墨寡肽酶解制备方法。本发明所要解决的再一个问题是提供一种乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为乌贼墨寡肽，其特征在于该乌贼 墨寡肽的N端氨基酸序列为Gln-Pro-Lys。一种乌贼墨寡肽酶解制备方法，其特征在于包括如下步骤①样品的制备，将鲜乌贼墨原料勻浆，乌贼墨勻浆后原料与超纯水的比值1 0 1 3，调节PH值至7.0 8. 5 ；②加入胰蛋白酶，加酶量为0. 032g/ml 0. 096g/ml，在水浴箱中酶解，酶解温度 为35 53°C，灭活，离心，取上清液；③分离与纯化，经过超滤和S印hadex G_25层析分离；
④收集，于280nm处检测，收集各峰洗脱液。作为优选，步骤③所述的超滤为将样品清液加入超滤杯，收集3KD分子量以下的 酶解液，进行冷冻干燥。作为优选，步骤③所述的Si^phadex G-25层析分离为将样品用蒸馏水进行溶解，离 心，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，取样品溶液过S印hadex G-25柱，用蒸馏水为洗脱液， 平衡和洗脱。作为优选，步骤①中料液比为1 1，ρΗ值为8，步骤②中的酶解时间为8 20小 时，酶解温度为45 51 °C，加酶量为0. 064g/ml。进一步，还包括步骤⑤对收集后的样品进行纯度检测。乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于采用胰蛋白酶进行酶解，结合优化的反应条 件，所得产物氨基氮含量高，即代表所得寡肽含量高，纯度高，并且，整个过程易于控制，同 时，所得的酶解物寡肽对人前列腺癌细胞DU-145有明显的抑制增殖作用，且随着药物浓度 和作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，因此具有医学药用价值。
图1为不同时间各酶氨基氮生成比较柱状图。图2为G-25洗脱峰值图。图3为胰蛋白酶酶解后样品的高效液相检测乌贼墨寡肽纯度检测图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。1、材料1. 1动物乌贼购于舟山南珍菜场1. 2细胞株人前列腺癌细胞株DU-145株购自中国科学院上海细胞生物学研究所 细胞库。1. 3主要试剂HamF12培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制 品有限公司；CCK-8，杭州昊天生物技术有限公司；胰蛋白酶，北京西美杰科技公司；胃蛋白 酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，亚太恒信生物科技有限公司；福林酚，上海如吉生物发展有限 公司1. 4主要仪器SSW-420-2S恒温水浴锅，上海民仪电子有限公司；BSW-100-Z⑶自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；BT1-IOO恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；
PHS-250PH计，上海理达仪器厂；CF16RXII日立低温离心机，日本日立公司；DS-I组织捣碎机，上海标本模型厂；752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司
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高效液相色谱仪(P1201依利特)，大连依利特分析仪器有限公司G-25分子筛凝胶，上海如吉生物发展有限公司超滤杯、超滤膜，上海摩速科学器材有限公司；超净台F0rma3111，上海智城分析仪器制造有限公司；细胞培养箱ZHJM-C12090，杭州宝城生物科技有限公司；酶标仪(美国BI0-RAD)；杭州宝城生物科技有限公司；微量震荡器，上海精密仪器有限公司2、方法2. 1细胞培养人前列腺癌DU-145细胞接种于含10% (体积分数)FBS、双抗溶液 (青霉素G 100IU/mL、链霉素100IU/mL)的HamF12培养基中，置于37°C、5% C02、95%饱和 湿度条件下的孵箱中常规培养，细胞贴壁生长，每2 3天换液1次，当细胞生长汇合时，按 1 3传代，每周传代1 2次。用0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA混合消化液消化，收集对 数生长期细胞进行实验。2. 2细胞增殖抑制试验(CCK-8法)将DU-145细胞以每孔5 X IO3个细胞数接种 于96孔培养板中，每孔培养液200 μ L0贴壁生长后，每组细胞分别加入药物浓度5mg/ml， 10mg/ml, 15mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml乌贼墨提取物，对照组加入等体积培养液，每 个药物浓度设8个复孔。置于37°C，5% C02条件下分别孵育24h。每孔加入CCK-8溶液 IOy L，置37°C，5% C02条件下继续孵育4h终止培养。选择450nm波长，在酶标仪上测定 各孔光密度值D450，重复实验3次。按下列公式计算细胞抑制率肿瘤细胞抑制率(％)= (对照组D45tl-用药组D45tl) /对照组D45tlX 100%。2. 3氨基态氮以及酶活力的测定氨基态氮采用中性甲醛滴定法。于250ml烧杯 中加个60蒸馏水，加入酶解上清液5ml，开动磁力搅拌器，用0. 05M的NaOH标准液滴定到 酸度计指示PH8. 2，记录消耗NaOH的ml数；再加入10ml40%的中性甲醛，混勻。用上述的 NaOH标准溶液继续滴定到pH9. 2，记录消耗NaOH标准溶液的ml数，同时做空白试验。
权利要求
一种乌贼墨寡肽，其特征在于该乌贼墨寡肽的N端氨基酸序列为Gln Pro Lys。
2.一种乌贼墨寡肽酶解制备方法，其特征在于包括如下步骤①样品的制备，将鲜乌贼墨原料勻浆，乌贼墨勻浆后原料与超纯水的比值1 0 1 3，调节pH值至7.0 8.5 ；②加入胰蛋白酶，加酶量为0.032g/ml 0. 096g/ml，在水浴箱中酶解，酶解温度为 35 53°C，灭活，离心，取上清液；③分离与纯化，经过超滤和Si^phadexG-25层析分离；④收集，于280nm处检测，收集各峰洗脱液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤③所述的超滤为将样品清液加入 超滤杯，收集3KD分子量以下的酶解液，进行冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤③所述的Si^phadexG-25层析 分离为将样品用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，取样品溶液过 Sephadex G_25柱，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①中料液比为1 1，pH值为8， 步骤②中的酶解时间为8 20小时，酶解温度为45 51°C，加酶量为0. 064g/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于还包括步骤⑤对收集后的样品进行纯 度检测。
7.—种如权利要求1所述的乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。
全文摘要
一种乌贼墨寡肽，其特征在于该乌贼墨寡肽的N端氨基酸序列为Gln-Pro-Lys。本发明还公开了乌贼墨寡肽利用胰蛋白酶进行酶解制备的方法，本发明还公开了该乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于采用胰蛋白酶进行酶解，结合优化的反应条件，所得产物氨基氮含量高，即代表所得寡肽含量高，纯度高，并且，整个过程易于控制，同时，所得的酶解物寡肽对人前列腺癌细胞DU-145有明显的抑制增殖作用，且随着药物浓度和作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，因此具有医学药用价值。
文档编号C12P21/06GK101983968SQ20101029612
公开日2011年3月9日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者丁国芳, 庄黛娜, 徐银峰, 杨最素, 杨永芳, 郁迪, 郑玉寅, 黄芳芳 申请人:浙江海洋学院