专利名称：一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备β -甘露聚糖酶的方法及专用菌株。
背景技术：
β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase ；EC31211178)是一类降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主链3-l，4-D-甘露吡喃糖的酶，它在利用现存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕榈树的坚果、瓜尔豆、洋槐、咖啡树以及魔芋的块茎中的各种甘露聚糖有着潜在的重要性。国内外现主要用于造纸工业纸浆的漂白、油井的破胶、降解植物胶生产低聚糖用作双歧杆菌促生长因子，防病抗衰老的保健食品以及饲料工业中作为抗营养因子。β -甘露聚糖酶按其最适PH值的不同有酸性、中性、碱性之分，其中碱性β -甘露聚糖酶是指在碱性条件下催化活力最高的β -甘露聚糖酶，其研究相对较晚，发现主要由嗜碱芽孢杆菌产生，某些地衣芽孢杆菌也产生碱性β -甘露聚糖酶，如杨文博等报道了一株地衣芽孢杆菌ΝΚ-27，其最适ρΗ值为9.0。一般情况下枯草芽孢杆菌，放线菌等产生中性 β-甘露聚糖酶，而霉菌产生酸性β-甘露聚糖酶。第一个碱性甘露聚糖酶由Akino等发现。马延和等于1991报道了嗜碱芽孢杆菌Ν16-5的三个胞外碱性甘露聚糖酶的纯化及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年发现了芽孢杆菌属的一个菌株JAMB-602产碱性甘露聚糖酶，此酶属于GH家族5，最适ρΗ为 9。目前所发现的嗜碱甘露聚糖酶的最适PH值最高为10，由Takeda等于2004年报道。碱性β-甘露聚糖酶不仅可以生产用作双歧杆菌促生长因子的低聚糖，而且在需碱性环境的纸浆漂白等工业方面具有广泛的应用前景。但到目前为止，碱性甘露聚糖酶的制备仍旧是限制其工业应用的瓶颈，前人的报道中无论是使用碱性β -甘露聚糖酶的原产菌株还是使用重组菌株生产，其产量都比较低。马延和等于1991报道了嗜碱芽孢杆菌Ν16-5的三个胞外碱性甘露聚糖酶的纯化及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列，其基因的编码区序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位所示。PTM1 溶液将 Cu SO4 ·5Η20 6g，KI 0. 08g, MnSO4 2. 68g, H3BO3 0. 02g, Na2MoO4 ·2Η20 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 20g, FeSO4 · 7H20 65g, CoCl2 · 6H20 0. 916，H2S045mL,生物素 0. 2g 混合， 用水定容至1升，得到PTM1溶液。每1升BMGY液体培养基按照如下方法制备将8克-12克或10克酵母提取物、18 克-22克或20克蛋白胨、12克-15克或13. 4克YNB、3X 10_4克-5X 10_4克或4X 10_4克生物素和8克-12克或10克甘油溶于水中，用水定容至1升，得到BMGY液体培养基。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌。本发明所提供的重组菌，是将甘露聚糖酶的编码基因导入出发菌株，得到的重组菌；所述β -甘露聚糖酶的编码基因序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位核苷酸所示。上述重组菌中，所述β-甘露聚糖酶的编码基因是通过重组载体导入出发菌株的；所述重组载体为如下(1)或( 或C3)所示(1)将 SEQ ID NO 1 所示 DNA 片段插入 pA0815alpha 的 XhoI 和 EcoRI 酶切位点间，得到的重组载体，记作ρΑΟ α-Isman ；其中，XhoI酶切位点位于SEQ ID NO :1所示DNA片段的5'端上游，EcoRI酶切位点位于SEQ ID NO 1所示DNA片段的3‘端下游；(2)用 BamHI/Bglll 双酶切 ρΑΟ α -Isman,回收 2932bp 片段；用 BamHI 单酶切 ρΑΟ α-Isman,回收载体大片段；将所述^32bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作 ρΑΟ α -2sman ；(3)用 BamHI/Bglll 双酶切 ρΑΟ α -2sman,回收 5864bp 片段；用 BamHI 单酶切 pA0a-2sman,回收载体大片段；将所述5864bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作 PAO α -4sman ；所述pA0815alpha按照如下方法得到将载体pPICZ α用McI/EcoRI双酶切，收集IOOObp片段；用McI/EcoRI双酶切载体pA0815，回收载体大片段；将所述IOOObp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体即为pA0815alpha ；所述出发菌株为酵母菌，优选为毕赤酵母菌，再优选为巴斯德毕赤酵母菌株 GS115。上述重组菌中，所述重组菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS4SMAN，其保藏编号为 CGMCC N0. 4095。本发明的另一个目的是提供一种制备甘露聚糖酶的方法。本发明所提供的制备甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤将上述任一所述重组菌接种于发酵培养基中，发酵培养，得到甘露聚糖酶；将发酵容器内的所有物质记作发酵体系。上述方法中，所述发酵培养基为用于培养毕赤酵母菌的培养基，且其中含有甘油；所述发酵培养依次按照如下三个阶段进行阶段一包括如下步骤从接种开始培养至发酵体系中的甘油耗尽；阶段二 包括如下步骤在发酵体系中的甘油耗尽时，开始流加甘油或甘油溶液， 培养至发酵体系的0D_值达到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；阶段三为如下1)或2)所示1)包括如下步骤在发酵体系中的甘油耗尽时，向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，进行诱导表达；2)包括如下步骤在发酵体系中的甘油耗尽时，将发酵体系的温度调至^TC 四°C或沈°C或27°C或观°C或四°C，向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，进行诱导表达；所述甘油溶液由甘油、PTM1溶液和水组成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM1溶液和水组成。上述方法中，所述山梨醇与甲醇的混合水溶液中，山梨醇与甲醇的质量比为1 20 1 5 或 1 20 或 1 10 或 1 5。上述方法中，所述山梨醇与甲醇的混合水溶液中，山梨醇的浓度为36g/L_144g/L 或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的浓度为720g/L。上述方法中，所述阶段一和所述阶段二中的培养在pH值为6. 0、温度为30°C、溶氧为30%以上的条件下进行；上述方法中，所述阶段三中的1)中，诱导表达在PH值为6. 0、温度为30°C、溶氧为 30%以上的条件下进行；上述方法中，所述阶段三中的2)中，诱导表达在pH值为6.0、温度为 或或27°C或或^°C、溶氧为30%以上的条件下进行。上述方法中，所述阶段三中，诱导表达的时间为60h_160h，具体为iai_84h或 36h-84h 或 48h-84h 或 60h_84h 或 19h_i;34h 或 43h_i;34h 或 64h_i;34h 或 86h_i;Mh 或 lllh-134h ；再具体为 12h、36h、48h、60h、72h、84h 或 19h、43h、64h、86h、Illh 或 134h ；上述方法中，所述阶段一中，所述接种量为5% ；上述方法中，所述阶段三中，所述在发酵体系中的甘油耗尽时为从停止流加甘油时计起，0.5 Ih后；(在补加甲醇前，将温度降至沈 四1，菌体及饥饿0.5 111，以耗尽甘油，达到AOXl启动子去阻遏的目的)。上述方法中，所述溶氧为30%以上为溶氧为30% -100% ；上述方法中，所述发酵培养基为BMGY液体培养基；上述方法中，所述甘油溶液按照如下方法制备将600g-650g或625g甘油、 1 Oml-Hml或12mL PTM1溶液混合，用水定容至1升。上述方法中，所述阶段三中，所述向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的方式为先向发酵体系中加入甲醇，使甲醇在发酵体系中的体积浓度为3/1000-7/1000或5/1000，1. 5小时-2. 5小时或2小时后，再向发酵体系中流加山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液；上述方法中，所述阶段一中，所述溶氧为30%以上是通过向发酵体系中通入空气并调节通入空气的速率和搅拌发酵体系并调节搅拌发酵体系的速率实现的；所述搅拌速率为200rpm-900rpm ；所述通入空气的速率为0. 5L/L发酵培养基/min-1. 5L/L发酵培养基/ min ；上述方法中，所述阶段二中，所述溶氧为30%以上是通过向发酵体系中通入空气并调节通入空气的速率、搅拌发酵体系并调节搅拌发酵体系的速率、和调节甘油或甘油溶液的流加速率实现的，所述搅拌速率为200rpm-900rpm ；所述通入空气的速率为0. 5L/L发酵培养基/min-1. 5L/L发酵培养基/min ；所述流加甘油或甘油溶液的速率为5ml甘油或甘油溶液/L发酵培养基/h-15ml甘油或甘油溶液/L发酵培养基/h ；上述方法中，所述阶段三中，所述溶氧为30%以上是通过向发酵体系中通入空气并调节通入空气的速率、搅拌发酵体系并调节搅拌发酵体系的速率、和调节山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的流加速率实现的，所述搅拌速率为200rpm-900rpm ；所述通入空气的速率为0. 5L/L发酵培养基/min-1. 5L/L发酵培养基/min ；所述流加山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的速率为anl山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液/L发酵培养基/h-6ml山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液/L发酵培养基/h。本发明公开的重组菌含有多个拷贝的、由甲醇诱导表达的甘露聚糖酶基因。实验证明，本发明的用该重组菌进行高密度发酵生产碱性甘露聚糖酶的工艺，可使最终碱性甘露聚糖酶在84h的诱导周期内，酶活达到6336u/ml。本发明方法成本低、操作简单、产率高。 因此，本发明方法在甘露聚糖酶的制备领域具有广阔的应用前景。
图1为分泌型表达载体pA0815alpha的构建示意图。图2为重组表达载体ρΑΟ α -lsman, ρΑΟ α -2sman, ρΑΟ α -4sman的构建示意图。图3为重组菌GS4SMAN在甲醇诱导高密度发酵结果。图4为重组菌GS4SMAN在山梨醇混合补料，30°C诱导时高密度发酵结果图5为重组菌GS4SMAN在山梨醇混合补料，诱导时高密度发酵结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、碱性甘露聚糖酶分泌表达载体的构建一、碱性甘露聚糖酶基因的克隆设计和合成引物引物 I(Forward) 5’ ATATCTCGAGAAAAGATCCCCATCAGAAGC 3'引物 2 (Reverse) 5’ CGGGCGAATTCTATCTTAAAGTAACATTAT 3，在α -mating因子信号肽编码序列下游有一个BioI酶切位点(CTCGAG，对应氨基酸为Leu-Glu)，其后紧跟一个Kex2蛋白酶识别位点(AAAAGA，对应氨基酸序列Lys-Arg)，因此，引物1的设计是在甘露聚糖酶基因之前引入》ιοΙ位点和Kex2蛋白酶识别位点序列。通过该设计，即可将甘露聚糖酶基因直接连接在信号肽序列之后，这样蛋白翻译后，在毕赤酵母自身Kex2蛋白酶的作用下，即可切表达出氨基酸不变的目的蛋白(而不会因酶切位点的原因引入额外的氨基酸残基)。引物2包含终止密码子TAG，并引入一个EcoRI酶切位点。以嗜碱芽孢杆菌附6_5总DNA为模板(或以人工合成的SEQ ID NO :1所示基因为模板)，加入引物1、引物2、HiFi Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下:94V 5min ；94°C 30s, 60-50°C 30s, 72°C 90s，每个循环降 1°C，共 10 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，共 25 个循环。PCR扩增得到1400bp的片段，命名为sman，用Omega纯化试剂盒纯化后，连接入 PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，得到重组载体pMD18_sman，将pMD18_sman送北京奥科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段中含有SEQ ID NO :1所示序列。二、分泌表达载体的构建构建流程如图1和图2所示。pA0815alpha 的制备 JfpPICZa (购自 Invitrogen 公司)用 SacI/EcoRI 双酶切， 收集IOOObp片段(即含有α -mating因子信号肽编码基因的片段)；用McI/EcoRI双酶切pA0815载体(购自hvitrogen公司)，回收载体大片段；将所述IOOObp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体即为pA0815alpha ；1、单拷贝碱性甘露聚糖酶分泌表达载体的构建将步骤一得到的pMD18_sman用XhoI和EcoRI双酶切，与同样经过XhoI和EcoRI 双酶切的pA0815alpha质粒连接，形成单拷贝碱性甘露聚糖酶分泌表达载体ρΑΟ α -Isman02、2拷贝sman的菌株的获得将步骤1中得到的重组表达载体ρΑΟ α -Isman用BamHI/BglII双酶切，回收 2932bp 片段(即 BamHI-sman-Bglll 片段)；用 BamHI 单酶切 ρΑΟ α -lsman,回收载体大片段；将所述^32bp片段和所述载体大片段连接，即可得2拷贝sman的表达载体 ρΑΟα -2sman ；3、4拷贝sman的菌株的获得用BamHI/Bglll 双酶切 ρΑΟ α -2sman,回收 5864bp 片段(艮口 BamHI-sman-sman-Bglll片段)；用BamHI单酶切pAOa -2sman，回收载体大片段；将所述 5864bp片段和所述载体大片段连接，即可得4拷贝sman的表达载体ρΑΟ α -4sman。三、表达甘露聚糖酶的酵母菌株的获得1、电转化巴斯德毕赤酵母细胞的制备接种巴斯德毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen，Ca. 18100)于500ml YPD培养基(10 克/升酵母膏、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、15克/升琼脂糖)，30°C，200r/min培养至0D600 = 1.3-1.5。4°C，l，500g离心5min收集菌体，分别用500ml、250ml预冷的灭菌水和20ml预冷的lmol/L山梨醇各洗一次。每次洗后均在4°C，1，500g下离心5min收集菌体，最后用Iml预冷的lmol/L山梨醇悬浮，即获得电击感受态细胞。2、重组表达质粒电转化酵母细胞将实验二中构建正确的重组表达质粒ρΑΟ α -lsman、pA0 α -2sman和ρΑΟ α -4sman 各约IOug分别用MlI酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于IOul无菌水中。将上述线性化DNA与80ul GS115感受态细胞混合，转入预冷的0. 2cm电转杯中。采用美国 BIO-RAD公司电转化仪，根据所使用电转化仪预设的毕赤酵母参数进行电击。电击结束后立即加入Iml预冷的IM山梨醇至电击杯中，然后将电击杯中的溶液全部转移至一无菌离心管中，37°C孵育l_2h，取500ul涂布MD O克/升葡萄糖、13. 4克/升YNB、4X 10_4克/升生物素、1. 5克/升琼脂)平板，于30°C倒置培养2-4天直至菌落出现。至此，得到含1、2、4拷贝sman的重组毕赤酵母菌株。含有1拷贝sman的重组毕赤酵母菌株(即转入ρΑΟ α -Isman的重组毕赤酵母菌株)的分子鉴定方法以GAP基因为内参基因，用荧光定量PCR法测定该菌株sman的拷贝数为1拷贝。具体测定方法参见Taicheng Zhu et al.，Efficient generation of multi-copystrains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeast Pichiapastoris, Journal of Applied Microbiology,2009,107 954-963 ；含有2拷贝sman的重组毕赤酵母菌株(即转入ρΑΟ α -2sman的重组毕赤酵母菌株)的分子鉴定方法以GAP基因为内参基因，用荧光定量PCR法测定该菌株sman的拷贝数为2拷贝。含有4拷贝sman的重组毕赤酵母菌株(即转入ρΑΟ α -4sman的重组毕赤酵母菌株)的分子鉴定方法以GAP基因为内参基因，用荧光定量PCR法测定该菌株sman的拷贝数为4拷贝。四、重组菌株的摇瓶发酵1、重组菌的发酵培养将步骤三中获得的表达碱性甘露聚糖酶的单拷贝sman的菌株、2拷贝sman的菌株和4拷贝sman的菌株分别接种于25ml BMGY液体培养基中(10克/升酵母精提物、20克/ 升蛋白胨，121°C灭菌20min后，温度降至室温时加入13. 4克/升YNB、4X 10_4克/升生物素、10克/升甘油)，于30°C，200r/min摇床培养48h，OD600达20，3000r/min离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1-2次。将菌体用BMMY诱导培养基(10克/升酵母精提物、20克/升蛋白胨，121°C灭菌20min后，温度降至室温时加入13. 4克/升YNB、4X 10_4 克/升生物素、0. 5%甲醇)，稀释至OD6tltl = 10，用4层纱布代替棉花塞，于30°C，200r/min 摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0.5% (V/V)。在30°C培养3天后，取发酵液进行酶活检测。将发酵容器中的所有物质记作发酵液。2、胞外酶活的测定吸取发酵液ImL于离心管中，以lOOOOr/min离心lOmin，吸取上清液于试管中。加 Λ 0. Olml稀释的样品溶液和0. 19mL反应液，72°C保温IOmin ；加入0. 2ml DNS,煮沸5min ； 取上清液在540nm处测定吸光值。以灭过活的酶液做空白对照，空白对照的处理方法与样品的处理一样。酶活定义在37°C、pH值为9. O的条件下，每分钟降解甘露聚糖释放1 μ mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。灭过活的酶液的制备方法将步骤1得到的上清液在100°C煮沸5min，得到灭过活的酶液。槐豆胶购自Sigma，产品目录号为G0753。槐豆胶的主要成分为甘露聚糖。反应液配制方法将0. 5g槐豆胶放入250ml烧杯中，加入90ml在70°C预热的 pH9. 0,0. 05M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50ml0. 2M甘氨酸+8. 8ml0. 2N氢氧化钠，加水稀释至200ml)磁力搅拌混勻，然后用水定容到500ml，得到反应液。DNS 称取酒石酸钾钠182. 0g，溶于500mL蒸馏水中，加热(不超过50°C )，于热溶液中依次加入3，5- 二硝基水杨酸6. 3g，NaOH 21. 0g,苯酚5. Og,无水亚硫酸钠5. Og,搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至IOOOmL,贮存于棕色瓶中，室温保存。酶活与OD54tl的换算公式为发酵液酶活=[(0D540+0. 187)/0. 025/18] X发酵液稀释倍数。实验设3次重复，结果取平均数。诱导发酵7 后，1-4拷贝菌株摇瓶发酵液酶活见表1。同时以转入pA0815alpha 的毕赤酵母菌株GS115为对照，结果对照与空白对照结果相同，检测不到酶活。表1.不同拷贝菌株的酶活
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权利要求
1.一种重组菌，是将甘露聚糖酶的编码基因导入出发菌株，得到的重组菌；所述 β -甘露聚糖酶的编码基因序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位核苷酸所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述甘露聚糖酶的编码基因是通过重组载体导入出发菌株的；所述重组载体为如下(1)或( 或C3)所示(1)将SEQID NO 1所示DNA片段插入pA0815alpha的XhoI和EcoRI酶切位点间，得到的重组载体，记作ρΑΟ α -Isman ；其中，XhoI酶切位点位于SEQ ID NO=I所示DNA片段的 5'端上游，EcoRI酶切位点位于SEQ ID NO :1所示DNA片段的3'端下游；(2)用BamHI/Bglll 双酶切 ρΑΟ α -Isman,回收 2932bp 片段；用 BamHI 单酶切 ρΑΟ α-Isman,回收载体大片段；将所述^32bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作 ρΑΟ α -2sman ；(3)用BamHI/Bglll 双酶切 pAOa -2sman，回收 5864bp 片段；用 BamHI 单酶切 pA0a-2sman,回收载体大片段；将所述5864bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作 PAO α -4sman ；所述pA0815alpha按照如下方法得到将载体pPICZa用McI/EcoRI双酶切，收集 IOOObp片段；用McI/EcoRI双酶切载体pA0815，回收载体大片段；将所述IOOObp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体即为pA0815alpha ；所述出发菌株为酵母菌，优选为毕赤酵母菌，再优选为巴斯德毕赤酵母菌株GS115。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS4SMAN，其保藏编号为 CGMCC N0. 4095。
4.一种制备β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤将权利要求1-3中任一所述重组菌接种于发酵培养基中，发酵培养，得到甘露聚糖酶；将发酵容器内的所有物质记作发酵体系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基为用于培养毕赤酵母菌的培养基，且其中含有甘油；所述发酵培养依次按照如下三个阶段进行阶段一包括如下步骤从接种开始培养至发酵体系中的甘油耗尽；阶段二 包括如下步骤在发酵体系中的甘油耗尽时，开始流加甘油或甘油溶液，培养至发酵体系的0D_值达到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；阶段三为如下1)或2)所示1)包括如下步骤在发酵体系中的甘油耗尽时，向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，进行诱导表达；2)包括如下步骤在发酵体系中的甘油耗尽时，将发酵体系的温度调至^rc ^rc或沈°C或27 °C或观°C或四°C，向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，进行诱导表达；所述甘油溶液由甘油、PTM1溶液和水组成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM1溶液和水组成。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述山梨醇与甲醇的混合水溶液中， 山梨醇与甲醇的质量比为1 20 1 5或1 20或1 10或1 5。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述山梨醇与甲醇的混合水溶液中，山梨醇的浓度为36g/L-144g/L或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的浓度为720g/L。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述阶段一和所述阶段二中的培养在PH值为6. 0、温度为30°C、溶氧为30%以上的条件下进行；所述阶段三中的1)中，诱导表达在PH值为6. 0、温度为30°C、溶氧为30%以上的条件下进行；所述阶段三中的2)中，诱导表达在pH值为6. 0、温度为 或或27°C或观！或四！、溶氧为30%以上的条件下进行。
9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述阶段三中，诱导表达的时间为 60h-160h，具体为 12h-84h 或 36h_84h 或 48h_84h 或 60h_84h 或 19h_i;34h 或 43h_i;34h 或 64h-134h 或 86h_134h 或 lllh_134h ；再具体为 12h、36h、48h、60h、72h、84h 或 19h、43h、 64h、86h、lllh 或 134h ；所述阶段一中，所述接种量为5% ；所述阶段三中，所述在发酵体系中的甘油耗尽时为从停止流加甘油时计起，0. 5 Ih后；所述溶氧为30%以上为溶氧为30% -100% ；所述发酵培养基为BMGY液体培养基；所述甘油溶液按照如下方法制备将600g-650g或625g甘油、IOml-Hml或UmLPTM1 溶液混合，用水定容至1升。
10.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述阶段三中，所述向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的方式为先向发酵体系中加入甲醇，使甲醇在发酵体系中的体积浓度为3/1000-7/1000 或5/1000，1. 5小时-2. 5小时或2小时后，再向发酵体系中流加山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液；所述阶段一中，所述溶氧为30%以上是通过向发酵体系中通入空气并调节通入空气的速率和搅拌发酵体系并调节搅拌发酵体系的速率实现的；所述搅拌速率为 200rpm-900rpm ；所述通入空气的速率为0. 5L/L发酵培养基/min-1. 5L/L发酵培养基/ min ；所述阶段二中，所述溶氧为30%以上是通过向发酵体系中通入空气并调节通入空气的速率、搅拌发酵体系并调节搅拌发酵体系的速率、和调节甘油或甘油溶液的流加速率实现的，所述搅拌速率为200rpm-900rpm ；所述通入空气的速率为0. 5L/L发酵培养基/ min-1. 5L/L发酵培养基/min ；所述流加甘油或甘油溶液的速率为5ml甘油或甘油溶液/L 发酵培养基/h_15ml甘油或甘油溶液/L发酵培养基/h ；所述阶段三中，所述溶氧为30%以上是通过向发酵体系中通入空气并调节通入空气的速率、搅拌发酵体系并调节搅拌发酵体系的速率、和调节山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的流加速率实现的，所述搅拌速率为200rpm-900rpm ；所述通入空气的速率为0. 5L/L发酵培养基/min-1. 5L/L发酵培养基/min ；所述流加山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇的速率为2ml/L发酵培养基/h-6ml/L发酵培养基/h。
全文摘要
本发明公开了一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株。该菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS4SMAN CGMCC NO.4095。本发明公开的重组菌含有多个拷贝的、由甲醇诱导表达的甘露聚糖酶基因。实验证明，本发明的用该重组菌进行高密度发酵生产碱性甘露聚糖酶的工艺，可使最终碱性甘露聚糖酶在84h的诱导周期内，酶活达到6336u/ml。本发明方法成本低、操作简单、产率高。因此，本发明方法在甘露聚糖酶的制备领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/19GK102433267SQ20101029713
公开日2012年5月2日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者朱泰承, 李寅, 游丽金, 薛燕芬, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所