专利名称：：不同类型食用菌新品种选育筛选方法的建立的制作方法
技术领域：
：本发明属于食用菌中锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶定性鉴定方法。
背景技术：
：木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶可用于纸浆生物漂白、有机污染物降解(如土壤生物修复、印染废水及化工废水的生物处理)等等，其应用非常广泛，近几年来对能够产生锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的食用菌种类及新品种的研究也越来越多，但是目前人工选择育种、诱变育种、原生质体融合等食用菌常规育种手段选育新品种时缺乏筛选标记，融合菌株筛选工作量大，鉴定费时费力，特别是对于是否含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶不同类型食用菌的融合菌株不能快速定性的鉴定和监测。
发明内容本发明的目的是提供一种不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，解决现有技术中食用菌或新品种中是否具有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的鉴定缺乏明显筛选标志、费时、工作量大，不能快速定性的鉴定和监测的问题，该方法可以直接、方便且灵敏的定性判断食用菌中是否具有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶，特别适合用来定性检测两种不同类型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株，检测成本低廉。本发明的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法以苯胺蓝为原料之一配制固体培养基，将不同类型食用菌融合后的菌种接种在所述固体培养基上，培养后观察苯胺蓝固体培养基的变色情况，筛选鉴定该菌株是否为类型1即含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种酶的菌株；或者类型2含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶两种酶的菌株；或者类型3本身不含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株与本身含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株融合后的新品种，该新品种为含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株；或者类型4本身不含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株与本身含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株融合后的新品种，该新品种为不含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株。本发明的显著优点是本发明根据锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶与苯胺蓝(苯胺蓝又名醇溶蓝，为棕色粉末，溶于乙醇而不溶于水，主要用于制墨水蓝。它是由碱性副品红与苯胺加热縮合，再用盐酸酸析而得。)发生反应使苯胺蓝的原本颜色发生改变，由原来的蓝色变成黄色，从而判断某菌是不是产生锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶，因此可以利用此方法检测和筛选产生锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的菌种和不产生此酶系的菌种的融合菌株，建立食用菌遗传育种筛选鉴定的新方法，该方法具有操作简单、直接、方便且灵敏的特点，可以快速监测杂交种，该方法将会改变目前各种新品种选育方法缺乏明显筛选标志、费时、工作量大的现状，极大的推动食用菌的遗传育种研究及新品种的应用推广，并为木素氧化酶系在食用菌中的应用提供研究基础，加快木素氧化酶的研究步伐，同时进一步扩大了木素氧化酶的应用范围。图1是本发明的实施例1雪莲菇的苯胺蓝平板变色情况照片。图2是本发明的实施例1白色茶树菇的苯胺蓝平板变色情况照片。图3是本发明的实施例1红平菇的苯胺蓝平板变色情况照片。图4是本发明的实施例1台湾1号(袖珍菇)的苯胺蓝平板变色情况照片。图5是本发明的实施例1鸡腿菇的苯胺蓝平板变色情况照片。图6是本发明的实施例1滑菇的苯胺蓝平板变色情况照片。图7是本发明的实施例1香菇的苯胺蓝平板变色情况照片。图8是本发明的实施例1灰树花的苯胺蓝平板变色情况照片。具体实施例方式具体步骤包括(1)配制苯胺蓝固体培养基酵母膏10g，葡萄糖10g，苯胺蓝0.lg，琼脂18-20g，pH自然，自来水定容到1000mL，在12rC下进行高压灭菌20分钟；(2)将苯胺蓝固体培养基在微波炉中加热，待溶解后放于超净工作台中，待温度冷却到45t:后倒平板；(3)待平板凝固后，将活化7天后的食用菌的菌种接种到PDA固体培养基平板上，置于2『C恒温箱中培养7天；将长满PDA固体培养基平板上的菌种用lcm的打孔器取一个直径约lcm的圆形菌体放在已经凝固好的苯胺蓝固体培养基平板上，置于2『C恒温箱中培养10天；观察其对苯胺蓝固体培养基平板的变色作用，以变色圈的大小来衡量菌对苯胺蓝染料的脱色能力(根据变色圈颜色的深浅初步定性的判断菌株中锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的活性大小，如变色圈黄色明显的菌株中锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的活性越大，反之越小)，每天记录一次并拍照；10天后进行苯胺蓝固体培养基的变色情况对比，定性鉴定出该食用菌是否含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的食用菌。观察苯胺蓝固体培养基的变色情况，当所述固体培养基的颜色由原来的蓝色变成黄色时，鉴定出培养的食用菌中含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶；当所述固体培养基的颜色为原来的蓝色没有发生变化时，鉴定出培养的食用菌中不含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶。所述食用菌的菌种活化7天的培养步骤为1、配制PDA固体斜面培养基土豆200g，葡萄糖20g，ffl自然，定容到1000ml，再分装到18*180规格的试管中，每支约装5ml。2、将分装好的试管培养基在12rC、高压灭菌20分钟。3、待灭菌锅压强降到Opa时，打开锅将试管培养基进行摆斜面，斜面高度不能超过试管的三分之二。4、将冰箱中的食用菌菌种取出和PDA斜面一起放在超净工作台中紫外灭菌20分钟后进行接种，接种时用接种铲铲取一块菌块放在斜面上即可。5、接种完成后，将接种好的斜面放在2『C恒温培养箱中培养7天即可。食用菌的菌种接种到平板上为将活化好的试管斜面菌种用接种铲铲取一小块菌种放在已经凝固好的PDA固体培养基平板上，用封口膜封好后放在2『C恒温培养箱中培养7天后待用。本发明的方法适用于各种食用菌；特别适用于定性检测两种不同类型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株。以下是本发明的几个具体实施例，并结合附图进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。以下实施例中每个食用菌菌种的检测的具体步骤都是将长满PDA固体培养基平板上的菌种用lcm的打孔器取一个菌塞放在已经凝固好的苯胺蓝固体培养基平板上，用封口膜封好后放在2『C恒温培养箱中培养10天。其中每天记录各个菌种菌丝圈的直径和变色圈的直径大小，并拍照。其余的培养步骤均按照具体实施方式中的进行。(1)苯胺蓝平板变色实施例1雪莲菇结果如图1中从图l可以看出，在苯胺蓝固体培养基平板上雪莲菇菌丝圈直径和苯胺蓝变色圈直径是同等的，说明雪莲菇产木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶或两种酶的能力很强。实施例2白色茶树菇结果如图2中从图2可以发现白色茶树菇在十天后苯胺蓝固体培养基平板变色非常明显，且和菌丝一起占满整个平皿。说明其以上两种酶或其中一种很强。实施例3红平菇结果如图3中从图3可以看出红平菇在十天后平板也发生变色，但是颜色不如雪莲菇和白色茶树菇好，说明它产酶能力一般。实施例4台湾1号(袖珍菇)结果如图4中从图4从上面的相片可以看出台湾1号(袖珍菇)在十天后平板也会发生变色，但还不如红平菇颜色变化明显，由此可知它的产酶能力不如以上三种好。(2)苯胺蓝平板不变色实施例5鸡腿菇结果如图5中从图5可以看出鸡腿菇在十天内菌丝圈直径每天都有所增加十天后长满整个平皿，可是苯胺蓝固体培养基平板一直没有变色，说明鸡腿菇不能产生木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶。实施例6滑菇结果如图6中从图6可以看出滑菇在十天后菌丝长满整个平皿但是平板颜色没有发生改变，说明滑菇也不产以上任何一种酶。实施例7香菇结果如图7中由图7可以看出香菇在十天后长满了整个平皿，可是平板颜色并未发生改变，说明香菇不产以上任何一种酶。实施例8灰树花6结果如图8中由图8可以看出灰树花在十天内一直没有长满整个平皿且平板颜色也没有发生改变，所以灰树花也不产以上两种任何一种酶。食用菌种类繁多，各具有优缺点，由上面的例子可以看出通过苯胺蓝平板变色法检测有些食用菌含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶，使苯胺蓝的原本颜色发生改变，由原来的蓝色变成黄色；有些食用菌不含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶，平板中培养基苯胺蓝颜色没有发生变化，因此苯胺蓝平板法适合用来定性检测这两种不同类型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株，且该法直接、方便且灵敏。验证试验亚甲基蓝(MB)法检测木素过氧化物酶(Lip)Lip的定性反应混合液2.7mL酶液，0.lmLlmmol/L的MB，0.3mL0.5mol/L的酒石酸钠缓冲液(pH4.0)，加入0.lmL4.5mmol/L的H202启动反应。用灭活的酶液体系做空白对照。愈创木酚法检测锰过氧化物酶(Mnp)Mnp的定性反应混合液2mL酶液，含有终浓度为0.4mmol/L的愈创木酚，0.lmmol/L的H202，0.2,1/L的MnS04及50,1/L的琥珀酸钠缓冲体系，调节pH至4.5，加入H202启动反应。用灭活的酶液体系做空白对照。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从以上表中的结果中可以得出采用验证试验验证本发明定性判断的这几种菌种中的确含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中的一种或两种，说明采用本发明的方法是完全可以定性的判断出菌种中是否含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中的一种或两种或初步筛选类型3。权利要求一种不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于以苯胺蓝为原料之一配制固体培养基，将不同类型食用菌融合后的菌种接种在所述固体培养基上，培养后观察苯胺蓝固体培养基的变色情况，筛选鉴定该菌株是否为类型1即含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种酶的菌株；或者类型2含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶两种酶的菌株；或者类型3本身不含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株与本身含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株融合后的新品种，该新品种为含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株；或者类型4本身不含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株与本身含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株融合后的新品种，该新品种为不含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶中一种或两种酶的菌株。2.根据权利要求1所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于观察苯胺蓝固体培养基的变色情况，当所述固体培养基的颜色由原来的蓝色变成黄色时，鉴定出培养的食用菌中含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶或两种酶均有；当所述固体培养基的颜色为原来的蓝色没有发生变化时，鉴定出培养的食用菌中不含有锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶。3.根据权利要求1所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于所述方法适用于各种食用菌。4.根据权利要求3所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于所述方法适用于定性筛选和鉴定两种不同类型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株。5.根据权利要求1所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于具体步骤包括(1)配制苯胺蓝固体培养基酵母膏10g，葡萄糖lOg，苯胺蓝O.lg，琼脂18-20g，pH自然，自来水定容到1000mL，在12rC下进行高压灭菌20分钟；(2)将苯胺蓝固体培养基在微波炉中加热，待溶解后放于超净工作台中，待温度冷却到45。C后倒平板；(3)待平板凝固后，将活化7天后的食用菌的菌种接种到PDA固体培养基平板上进行培养，然后将长满PDA固体培养基平板上的菌种用lcm的打孔器取一个直径lcm的圆形菌体放在步骤(2)已经凝固好的苯胺蓝固体培养基平板上，用封口膜封好后放在28t:恒温培养箱中培养10天，观察其对苯胺蓝固体培养基平板的变色作用，10天后进行苯胺蓝固体培养基平板的变色情况对比，定性鉴定出该食用菌是否含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的食用菌。6.根据权利要求5所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于步骤(3)中对接种菌株后的苯胺蓝固体培养基平板进行观察，以变色圈颜色的深浅来衡量菌对苯胺蓝染料的脱色能力，每天记录各个菌种菌丝圈的直径和变色圈的直径大小，并拍照；根据变色圈颜色的深浅初步定性的判断菌株中锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的活性大小。7.根据权利要求5所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于所述食用菌的菌种活化7天的培养步骤为(1)配制PDA固体斜面培养基土豆200g，葡萄糖20g，pH自然，定容到1000ml，再分装到18*180规格的试管中，每支装5ml;(2)将分装好的试管培养基在12rC、高压灭菌20分钟；(3)待灭菌锅压强降到Opa时，打开锅将试管培养基进行摆斜面，斜面高度不能超过试管的三分之二；(4)将冰箱中的食用菌菌种取出和PDA斜面一起放在超净工作台中紫外灭菌20分钟后进行接种，接种时用接种铲铲取一块菌块放在斜面上即可；(5)接种完成后，将接种好的斜面放在2『C恒温培养箱中培养7天即可。8.根据权利要求5所述的不同类型食用菌新品种筛选鉴定的新方法，其特征在于所述步骤(3)的活化后的食用菌的菌种接种到平板上为将活化好的试管斜面菌种用接种铲铲取一小块菌种放在已经凝固好的PDA固体培养基平板上，用封口膜封好后放在2『C恒温培养箱中培养7天后待用。全文摘要本发明提供一种食用菌遗传育种新品种筛选鉴定的新方法，解决现有技术中食用菌或新品种中是否具有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶的鉴定缺乏明显筛选标志、费时、工作量大，不能快速定性的鉴定和监测的问题，以苯胺蓝为原料之一配制固体培养基，将食用菌的菌种接种在所述固体培养基上，培养后观察苯胺蓝固体培养基的变色情况，鉴定出该食用菌是否含有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶或其两种酶的食用菌。本发明的方法可以直接、方便且灵敏的定性判断食用菌中是否具有锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶，特别适合用来定性检测两种不同类型的木腐菌或其他真菌的融合新菌株，检测成本低廉。文档编号C12Q1/04GK101760505SQ20101030054公开日2010年6月30日申请日期2010年1月21日优先权日2010年1月21日发明者孙淑静,张俊兰,徐建中,林胤煌,胡开辉申请人:福建农林大学