专利名称：：一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法
技术领域：
：一种竹黄菌发酵生产漆酶(Laccase)的方法，属于生物工程
技术领域：
。本发明涉及利用竹黄菌株(5iraiasp.)SUPER-H168保藏号为CCTCCNO=M207104，已在ZL200710132510.4公开，通过液态发酵获得漆酶。
背景技术：
：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物，不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素，去除许多有毒酚类物质如苯氧基类除草剂等的毒性，还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性；因此在造纸、环保、食品、医药卫生、生物检测等领域具有较大的研究和应用价值，近年来，人们对漆酶的研究越来越深入，其应用范围也越来越广泛。漆酶最早是由日本学者Yoshida于1883年在漆树、Rhusvennicifen)的汁液中发现的，后来由Bertraucl第一次命名为“漆酶(Lacease)”。此后随着研究的深入，发现漆酶广泛存在于多种植物，如马铃薯、毒莴苣、香蕉、桃子、咖啡豆、苜蓿花等，和部分细菌，如节杆菌(Arthrobacter)和链霉菌i^Streptomycete)等，以及各种真菌，如担子菌iBasidiomycetes)、子囊菌(Ascomycete)和半知菌(Adelomycete)。此夕卜,一些动物肾脏和血清中也有漆酶的发现。按其来源主要分为漆树漆酶(RhusLaccase)和真菌漆酶(FungalLaccase)两大类，其中真菌中的白腐菌(White-rotfungi)是漆酶的主要生产者。尽管漆酶在自然界中广泛分布，但真正具有较高漆酶产量的菌株并不多，其漆酶产量还不能满足工业生产所需的酶量，且发酵周期较长(714天)。当前用于漆酶生产的菌株主要有黄孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiuH色WM(Jrametesversicolor)、彩绒革盖菌{Coriolushisutus)、杂色云芝{Coriolusversicolor)、血红密孔菌、Pycnoporussanguineus)以及糙皮侧耳、Pleurotusostreatus)等，但目前未见竹黄菌、Shiraiabambusicola)产漆酶的研究报道。竹黄是一种药用真菌，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产漆酶具有发酵周期短和酶活力高的优势，同时发酵过程还可产生高活性的超氧化物歧化酶(SOD)和茈醌色素，开发前景广阔。
发明内容本发明的目的是，利用竹黄菌株(幼iraiasp.)SUPER-H168，保藏号为CCTCCNO=M207104，已在ZL200710132510.4公开，通过液态发酵法生产漆酶，通过调整各种培养基成份提高漆酶产量。本发明的技术方案一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法，出发菌株为竹黄菌株)SUPER-H168，保藏号为CCTCCNO=M207104；液态发酵培养基组成为碳源5-50g/L，氮源5-50g/L,K2HPO42-4g/L,KH2PO42-4g/L,马铃薯汁200g/L，用纯水配制；液态发酵条件为在发酵罐内装入发酵罐体积60%_70%(ν/ν)的液态发酵培养基，灭菌冷却后接入竹黄菌，接种量为5%-10%，种龄为10-48小时，起始ρΗ和发酵过程ρΗ均为自然，发酵温度为24-32°C，发酵周期为2-5天；在发酵过程中可以添加表面活性剂，以提高漆酶的产量。发酵过程中添加的表面活性剂主要有Tween20,Tween40,Tween60,Tween80、TritonX-100、TritonX-114,TritonX-116,TritonX-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AE0-3、AE0-7、AE0-9、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺。最终发酵液中漆酶活力最高可达500U/mL。所述的竹黄菌菌株，能够同时发酵产漆酶、超氧化物歧化酶SOD和茈醌色素。所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，可利用的产漆酶碳源为葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，可利用的产漆酶的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、或豆饼粉。所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，添加Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+可以提高竹黄菌的漆酶产量。最终发酵液中漆酶活力最高可达500U/mL。在漆酶发酵过程中，菌体还会生成茈醌色素，产量最高可达7g/L左右，其中竹红菌甲素占90%左右，竹红菌乙素占5%左右。同时发酵过程还能产生SOD酶，酶活达100-200U/mL。漆酶酶活测定是以2，6_二甲氧基酚(DMP)为底物，以每分钟氧化1μmol的DMP(ε=49.6L/(mmol·cm)所需要的酶量定义为1个酶活力单位，测定方法和活力定义详见DLitthauer,MJVanVuuren,AVanTonder,F。IWolfaardt(2007)PurificationandkineticsofathermostablelaccasefromPycnoporussanguineus.EnzymeMicrobTechnol,2007，40(4):563568.SOD酶活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用。SOD活力测定方法和SOD活力定义详见Chin-WenLin,Jeng-HuhYangandLieh-ChiSu,(1997)Theextractionandpropertiesofsuperoxidedismutasefromporcineblood,MeatScience,46(3):303-312.茈醌色素的产量采用液相色谱法测定，详见=Xiao-HuiLianga,Yu-JieCai,Xiang-RuLiao,Kangffu,LeiWang,Da-BingZhangandQiangMeng(2009).IsolationandidentificationofanewhypocrellinA—producingstrainShiraiaspSUPER-H168.MicrobiologicalResearch164(1):9-17.本发明有如下特点(1)用于Laccase发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆、豆饼粉。马铃薯汁既可以补充碳源也可以补充氮源，200g/L是指称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水IOOOmL煮沸半个小时，纱布过滤得到滤液，所有滤液加入到培养基中，培养基终体积为1000mL。(2)竹黄菌发酵漆酶可采用机械搅拌或气升式发酵罐。对于机械搅拌发酵罐，搅拌转速为70-150r/min，通风量1:0.1-1:0.5v/v/m。对于气升式发酵罐，通风量为1:0.3-1:1.5v/v/m。通风量数值与单位说明1:0.5v/v/m指1个体积的发酵液每分钟通0.5体积的无菌空气。发酵罐体积为5-500L，结合本领域的基本常识可根据生产情况调整发酵罐大小。(3)竹黄菌生产漆酶的过程，伴随着如下所示的三种母核为基本结构的茈醌色素的生成，其中主要是竹红菌甲素。同时该菌可产生以此三种母核结构进行基团修饰的多种茈醌类化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修饰上各种化学基团，如CH3、0CH3、C0CH3、CH(0H)CH3、CH0、0H、H等，这些化学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。随着发酵条件的不同，各茈醌色素的产量和比例会略有不同。伴随SOD产生的茈醌色素母核(4)竹黄菌生产漆酶的过程，伴随着SOD酶的生成。(5)为了提高漆酶的产量，本发明通过添加表面活性剂，以改善竹黄菌细胞膜的通透性。添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表面活性剂的浓度达0.1%-2%(w/w)，随后的发酵不再补加表面活性剂。结果表明所有表面活性剂对于漆酶的产量均有促进作用，其中Tween80添加量为0.8%时的效果最好。(6)为了提高漆酶的产量，本发明可通过添加金属离子，以刺激菌体生产漆酶。在发酵开始前添加离子，离子主要有Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+，浓度控制在0_4mmol/L。结果表明这些离子对于漆酶的产量均有一定的促进作用。本发明的有益效果目前未见竹黄菌、Shiraiabambusicola)产漆酶的研究报道。竹黄是一种药用真菌，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产漆酶具有发酵周期短和酶活力高的优势，同时发酵过程还可产生高活性的超氧化物歧化酶(SOD)和茈醌色素，开发前景广阔。图1碳源对漆酶、SOD酶、茈醌色素发酵的影响。图2氮源对漆酶、SOD酶、茈醌色素发酵的影响。图3表面活性剂对漆酶、SOD酶、茈醌色素发酵的影响。图4金属离子对漆酶、SOD酶、茈醌色素发酵的影响。具体实施例方式实施例15培养基组成为碳源20g/L，马铃薯200g/L，蛋白胨20g/L，NH4N0310g/L，玉米浆粉12g/L，K2HPO42g/L,KH2PO42g/L,pH自然，接种量为10%，种龄24小时，发酵温度为30V，300L气升式发酵罐，装液量70%，通风量为1:1.5v/v/m，发酵时间为3天。在此条件进行8批发酵，每批发酵所采用的碳源不同，依次为葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖，每批碳源浓度为20g/L。漆酶、SOD和茈醌色素的产量如图1所示。实施例2培养基组成为葡萄糖20g/L，氮源30g/L，K2HPO44g/L,KH2PO44g/L,pH自然，接种量为5%，种龄48小时，发酵温度为24°C，300L气升式发酵罐，装液量60%，通风量为11.5v/v/m，发酵时间为3天。在此条件进行9批发酵，每批发酵所采用的氮源不同，依次为氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆、豆饼粉，每批氮源浓度为30g/L。漆酶、SOD和茈醌色素的产量如图2所示。实施例3培养基组成为葡萄糖20g/L，NH4N0310g/L,KH2PO44g/L,蛋白胨10g/L，表面活性剂0.08g/L,pH自然。接种量为10%，种龄15小时，培养温度为28°C，50L机械搅拌发酵罐，装液量60%，通风量为1:0.5v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵时间为3天。当发酵开始后，发酵液中立即加入表面活性剂。在此条件进行18批发酵，每批发酵所采用的表面活性剂不同，依次为Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX-100、TritonX-114>TritonX-116、TritonX-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AE0-3、AE0-7、AE0-9、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺，每批表面活性剂浓度为0.08g/L。漆酶、SOD和茈醌色素的产量如图3所示。实施例4培养基组成为葡萄糖20g/L,K2HPO44g/L,牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆粉12g/L，某种金属离子2mmol/L，pH自然，接种量为10%，种龄24小时，发酵温度为26°C，5L机械搅拌发酵罐，装液量70%，通风量为1:0.3v/v/m，搅拌转速为100r/min，发酵时间为2天。在此条件进行8批发酵，每批发酵所添加的金属离子不同，依次为Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+。漆酶、SOD和茈醌色素的产量如图4所示。实施例5培养基组成为马铃薯200g/L，乳糖20g/L，NH4N0310g/L，Mg2+4mmol/L(MgSO4)、蛋白胨10g/L，pH自然。接种量为10%，种龄10小时，培养温度为30°C，500L机械搅拌发酵罐，装液量60%，通风量为1:0.5v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵时间为3天。当发酵开始后，发酵液中立即加入TritonX-1001.5%。在该条件下，发酵液中漆酶活力为428U/mL,SOD活力为316U/mL。茈醌色素产量为0.53g/L，其中竹红菌甲素占93%，竹红菌乙素占3%。实施例6培养基组成为，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，尿素10g/L，pH自然。接种量为10%，种龄48小时，培养温度为30500L机械搅拌发酵罐，装液量70%，通风量为1:0.4v/v/m，搅拌转速为120r/min，发酵时间为5天。当发酵开始后40小时，发酵液中立即加入Tween800.3%。在该条件下，发酵液中漆酶活力达460U/mL,SOD活力为380U/mL。茈醌色素产量为0.92g/L，其中竹红菌甲素占91%，竹红菌乙素占5%。权利要求一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于出发菌株为竹黄菌株(Shiraiasp.)SUPERH168，保藏号为CCTCCNOM207104；液态发酵培养基组成为碳源550g/L，氮源550g/L，K2HPO424g/L，KH2PO424g/L，马铃薯汁200g/L，用纯水配制；液态发酵条件为在发酵罐内装入发酵罐体积60%70%(v/v)的液态发酵培养基，灭菌冷却后接入竹黄菌，接种量为5%10%，种龄为1048小时，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为2432℃，发酵周期为25天；在发酵过程中添加表面活性剂，以提高漆酶的产量；所添加的表面活性剂选用Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX100、TritonX114、TritonX116、TritonX405、TX4、TX6、TX9、TX10、AEO3、AEO7、AEO9、一乙醇胺、二乙醇胺、或三乙醇胺。2.根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于竹黄菌株，能够同时发酵产漆酶、超氧化物歧化酶SOD和茈醌色素。3.根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于可利用的产漆酶碳源为葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。4.根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于可利用的产漆酶的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、或豆饼粉。5.根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于添加Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+可以提高竹黄菌的漆酶产量。全文摘要一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法，属于生物工程
技术领域：
。本发明涉及利用竹黄菌株Shiraiasp.SUPER-H168保藏号为CCTCCNOM207104，已在ZL200710132510.4公开，通过液态发酵获得漆酶。目前未见竹黄菌(Shiraiabambusicola)产漆酶的研究报道。竹黄是一种药用真菌，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产漆酶具有发酵周期短和酶活力高的优势，同时发酵过程还可产生高活性的超氧化物歧化酶(SOD)和苝醌色素，开发前景广阔。文档编号C12N9/02GK101942421SQ20101050121公开日2011年1月12日申请日期2010年10月9日优先权日2010年10月9日发明者丁彦蕊,廖祥儒,张大兵,李枝玲,胡明明,胡艳,蔡宇杰,马文寅申请人:江南大学