专利名称：野生茄子耐盐基因StNHXl植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及了野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因Na+/H+反向转运体(StNHXl)植 物表达载体的构建，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
土壤盐渍化是一个世界性难题，全世界盐渍化土面积约10亿公顷；我国盐渍土面 积约3，460万公顷，耕地盐碱化760万公顷，近1/5耕地发生盐渍化，其中原生盐化型、次生 盐化型和各种碱化型分布分别占总面积的52%、40%和8%。盐对于植物的毒害作用主要是由于水分亏缺导致的渗透胁迫以及过量的Na+对重 要生化过程的毒害。植物克服盐胁迫的机制是Na+的外排和液泡区室化。质膜Na+/H+反向 转运蛋白利用质膜H+-ATPase产生的跨膜质子梯度将Na+排出细胞，减少Na+向叶片中的长 距离转运而保护光合组织免受盐的毒害。液泡膜Na+/H+反向转运蛋白则利用液泡膜质子泵 (H+-ATPase和H+-PPase)产生的跨膜质子梯度将Na+区室化进入液泡，不仅减轻了过多Na+ 的累积对细胞质的毒害，而且可以利用NaCl作为溶质维持渗透势以驱动水分进入细胞。因 此，NaVH+反向转运蛋白在植物耐盐性中发挥着重要作用.
发明内容
技术问题本发明涉及野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因Na+/H+反向转运体 (StNHXl)植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。构建的植物表达载体导入农作物，可 增强其耐盐性。技术方案野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因Na+/H+反向转运体植物表达载体的构建1)野生茄子‘Torvum Vigor’中StNHXl耐盐基因的克隆以野生茄子‘Torvum Vigor’(为日本砧木品种，购自日本Takii种苗株式会 社)幼嫩叶片为材料，提取叶片总RNA，取2μ g总RNA反转录cDNA。根据番茄中耐盐基因 NHXl (Venema K, Belver A, Marin-Manzano M C, Rodriguez-Rosales M P, Donaire J P. A novel intracellular K./H+antiporter related to Na./H+antiporters is important for K+ionhomeostasis in plants. J. Biol. Chem. 2003, 278(25) 22453-22459)白勺)ψ 列(AccessNO. :AJ306630. 1)设计引物，在‘Torvum Vigor’叶片cDNA中扩增耐盐基因 StNHXl 上游引物F 5，-GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG-3，下游引物R 5，-CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC-3，将PCR产物(1599bp)连接到pMD19_T载体(购自TaKaRa公司)上，命名为 pMD19-StNHXl，测序验证；2) StNHXl基因连接至pBI121质粒BamHI/Sac I双酶切质粒pMD19_StNHXl回收StNHXl片段，同样双酶切pBI121质粒(购自上海希匹吉生物技术有限公司)回收pBI121-GUS_(12947bp)；将回收的两片段用 T4连接酶连接，命名为pl21-GUS_-StNHXl，转化DH5a感受态细胞，后续试验备用；3) StNHXl基因连接至pCAMBIA1301质粒构建植物表达载体Hind III/EcoR I 双酶切 pBI121_GUS:StNHXl 回收 35S prom-StNHX 1-N0S term 片段(2685bp)，同样双酶切pCAMBIA1301质粒(购自澳大利亚CAMBIA公司)回收其大片段 (11786bp)；将回收的两片段用T4连接酶连接，命名为pCAMBIA1301-StNHXl，转化DH5a感 受态细胞(购自南京天为生物科技有限公司)后进行PCR和酶切验证，构建成功。有益效果野生茄子‘Torvum Vigor' (Solanum torvum Swartz)具有较强的耐盐性，可在含 SOmmol化4的NaCl营养液中正常生长。为了探讨植物的耐盐机理，培育出能在盐渍土壤中 生存的农作物新品种，将野生茄子的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(StNHXl)转入农作物 中，可望培育出转基因耐盐新品种(见参考文献①Xue Z Y，Zhi D Y, Xue G P, Zhang H， Zhao Y X, Xia G M. Enhanced salt tolerance of transgenic wheat(Tritivumaestivum L. )expressing a vacuolar Na./H+antiporter gene with improved grain yields insaline soils in the field and a reduced level ofleaf Na+· Plant Science, 2004,167 849-859 ；(② Wu Y Y, Chen Q J, Chen M, Chen J, Wang X C. Salt-tolerant transgenic perennial ryegrass(Lolium perenne L. )obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of thevacuolar Na+/H+antipoter gene. Plant Science, 2005，169 65-73)。因此，以野生茄子为材料，利用RT-PCR技术，从中分离野生茄 子液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因，并对获得的基因构建植物表达载体，为该基因的基因 进一步利用奠定基础。本发明构建的野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因StNHXl的植物表达载体 pCAMBIA1301-StNHXl为茄子中首次报道，可转染其它植株，增强其耐盐性，可进行植物品种 改良。
四
图1植物表达载体的双酶切鉴定1 =DNAMarker2、3 :pCAMBIA1301-StNHXl/BamHI/Sac I4 :DNA Marker5、6 :pCAMBIA1301-StNHXl/Hind III/EcoR I7 :DNA Marker图 235S prom-StNHX 1-N0S term 示意3pCAMBIAl301-StNHXl植物表达载体质粒图谱
五具体实施例方式野生茄子耐盐基因StNHXl植物表达载体的构建过程1.野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因StNHXl的克隆以野生茄子‘Torvum Vigor’为材料(日本砧木品种，购自日本Takii种苗株式会社)，待长至八片真叶时，IOOmmol · L^1NaCl处理三天后取幼嫩叶片，按照TaKaRa公司的
TotalRNA提取试剂盒说明书提取叶片总RNA，取2 μ g总RNA反转录cDNA ；根据番茄耐盐基
因 NHXl 序列(Access NO. :AJ306630. 1)设计引物上游引物 F 5，-GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG-3，下游引物 R 5，-CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC-3，野生茄子‘Torvum Vigor，耐盐基因StNHXl基因开放阅读框长1599bp，以反 转录的cDNA为模板进行PCR反应，反应体系(20yL) :ddH20 10. 2 μ L，5 X Buffer 4μ L, dNTP (2. 5mmol · L-1) 1. 6 μ L，F、R 弓 | 物(20 μ mol · L-1)各 1 μ L，cDNA( < 1 μ g) 1 μ L，DNA STARl μ L ；扩增程序94°C预变性4min，93°C变性 30s，56. 8°C退火 30s，72°C延伸 100s，30 个 循环，72°C温育IOmin ；将PCR产物连接到pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)上，命名为pMD19_StNHXl， 转化DH5ci感受态细胞(购自南京天为生物科技有限公司)，进行序列测定；2. StNHXl基因连接至pBI121质粒DBamH I/Sac I 双酶切 pMD19_StNHXl 质粒酶切体系(50μ L) :ddH20 31. 5 μ L，10 X Buffer E 5μ L, BSAO. 5 μ L, pMD19-StNHXlplasmid 10 μ L, BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1. 5 μ L ;37°C，反应 2h ;2) BamH I/Sac I 双酶切 pBI121 质粒酶切体系(50μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5μ L, BSA0. 5 μ L, pBI121plasmidlO μ L, BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1· 5 μ L ;37°C，反应 2h ;3)回收 pMD19-StNHXl 的 StNHXl 片段(1599bp)和 pBI121 的 pBI121_GUS-片段 (12947bp)，将回收的两片段用T4连接酶连接连接体系(IOyL):ddH20 3 μ L，StNHXl 片断 4 μ L，pBI121_GUS-l μ L， IOXBufferl μ L, T4 连接酶 1 μ L ;4°C，过夜连接；连接产物命名为ρ 12l-GUS_-StNHXl，转化DH5 α感受态细胞；3. StNHXl基因连接至pCAMBIA1301质粒构建植物表达载体l)Hind III/EcoR I 双酶切 pBI121_GUS:StNHXl酶切体系(50μL) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0· 5 μ L，plasmid 10 μ L，BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1· 5 μ L ;37°C，反应 2h ；2)Hind III/EcoR I 双酶切 pCAMBIA1301酶切体系(50μL) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0. 5 μ L, plasmid 10 μ L, BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1· 5 μ L ;37°C，反应 2h ;3)回收 pBI121-GUS:StNHXl 的 35S prom-StNHX 1-N0S term 片段(2685bp)和 PCAMBIA1301的pCAMBIA1301_片段(11786bp)，将回收的两片段用T4连接酶连接连接体系(10μ L) :ddH20 3 μ L,35S prom-StNHXl-NOS term 4 μ L, ρ0ΑΜΒΙΑ130Γ1 μ L, IOXBuffer 1 μ L, T4 连接酶 1 μ L ；连接产物命名为pCAMBIAl301-StNHXl，转化DH5 α感受态细胞后进行PCR和酶切 验证，构建成功。综上所述，本发明构建的野生茄子耐盐基因StNHXl植物表达载体为茄子中首次报道，导入植物中，可增强其耐盐性，进行植物品种改良。
权利要求
野生茄子耐盐基因StNHX1植物表达载体，其构建方法为1)野生茄子‘Torvum Vigor’中StNHX1耐盐基因的克隆以野生茄子‘Torvum Vigor’幼嫩叶片为材料，提取叶片总RNA，取2μg总RNA反转录cDNA，设计引物在野生茄子‘Torvum Vigor’叶片cDNA中扩增StNHX1基因上游引物F5’ GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG 3’下游引物R5’ CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC 3’将PCR产物连接到pMD19 T载体上，命名为pMD19 StNHX1，测序验证；2)StNHX1基因连接至pBI121质粒BamH I/Sac I双酶切质粒pMD19 StNHX1回收StNHX1片段，同样双酶切pBI121质粒回收pBI121 GUS ；将回收的两片段用T4连接酶连接，命名为p121 GUS StNHX1，转化DH5α感受态细胞；3)StNHX1基因连接至pCAMBIA1301质粒构建植物表达载体HindIII/EcoR I双酶切pBI121 GUS StNHX1回收35S prom StNHX1 NOS term片段，同样双酶切pCAMBIA1301质粒回收其大片段；将回收的两片段用T4连接酶连接，命名为pCAMBIA1301 StNHX1，转化DH5α感受态细胞后进行PCR和酶切验证，构建成功。
2.权利要求1所述植物表达载体pCAMBIA1301-StNHXl在提高作物的耐盐性方面的应用。
全文摘要
本发明涉及野生茄子‘Torvum Vigor’(Solanum torvum Swartz)Na+/H+反向转运体耐盐基因(Na+/H+antiporter gene，StNHX1)植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。根据番茄(Solanum lycopersicum)NHX1基因序列，设计引物在野生茄子中扩增StNHX1基因(含有BamH I、Sac I酶切位点)，将StNHX1片段替换pBI121的GUS CDS，酶切pBI121载体后将35S prom-StNHX1-NOS term片段连接到pCAMBIA1301质粒，构建成植物表达载体pCAMBIA1301-StNHX1。该植物表达载体转化大豆后将会提高其耐盐性，对提高我国大豆分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。
文档编号C12N15/82GK101955972SQ20101050181
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者朱月林, 杨立飞, 盖钧镒, 陈国户 申请人:南京农业大学