专利名称：一种花生二价铁转运蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种花生根系的二价铁转运蛋白及其 编码基因与应用。
背景技术：
微量营养元素铁是各种生物生长发育的必需元素，植物缺铁会严重抑制植物的生 长发育，导致产量和品质下降。而植物又是动物和人类最根本的食物来源，因此促进植物 对环境中铁的吸收、植物体内合理运转和籽粒铁的累积对于提高作物产量和品质进而促进 人体健康具有重要的意义。对植物生长而言铁是第三大限制性营养元素，这主要是由于在 有氧环境中铁的溶解性很低(Yi et al.，1994)。实际上，全世界三分之一以上的土壤都缺 铁，为了适应缺铁胁迫，植物在长期进化过程中形成了从土壤中获取铁的机理I和机理II 适应性反应的生物学机制(Romheld et al.，1986)。机理I植物包括双子叶和非禾本科单 子叶植物。缺铁时根系伸长受阻，根尖部分直径增加，并产生根毛，根部形态发生变化，Fe3+ 还原酶的活性增加，受ATP酶控制的质子分泌增加，使根际pH降低，提高铁的有效性。机 理II植物主要是禾本科单子叶植物，它们在缺铁时无机理I植物的上述根形态学和生理学 上的变化，而只是根系中植物铁载体的合成和释放量增加。随着研究的不断和分子生物学 技术的快速发展，植物吸收利用铁的分子机制也逐渐研究清楚，具体而言，机理I植物缺铁 时主要表现为根细胞质膜上铁还原酶基因FRO将三价铁还原成二价铁(Yi et al.，1996)， 然后通过根细胞质膜上的二价铁转运蛋白IRT将二价铁转运到根细胞内供植物吸收利用 (Vert et al.，2002)。而对于机理II植物而言，在缺铁条件下主要通过体内合成并分泌麦 根酸铁载体，释放到根际麦根酸将铁螯合，再通过细胞质膜上的YSl转运蛋白将麦根酸铁 螯合物转运到根细胞内(Curie et al.，2001)。在植物中第一个分离鉴定的Fe (II)转运蛋 白基因是IRTl (iron-regulated transporter 1)，随着研究的不断深入，研究者们逐渐发 现植物中除了 IRTl基因能转运Fe (II)外，还有其它的Fe(II)转运蛋白，即NRAMP基因家 族。NRAMP为天然抗性相关的巨噬细胞蛋白(Natural Resistance-Associated Macrophage Protein, NRAMP)，该基因家族是能够编码疏水的膜蛋白，在不同物种的进化上具有高度的 保守性(Cellier et al.，1995)。在模式植物拟南芥中NRAMPl基因研究得相对比较清楚， 研究表明拟南芥中AtNRAMPl基因能够跨膜运输铁，当植物细胞需要铁时，贮存在液泡内 的铁通过跨膜运输进入细胞质，以保证植物对铁的需求平衡(Curie et al.，2000)，同时 AtNRAMPl也能够转运锰，参与了植物根系从土壤中吸收锰(Cailliatte et al.，2010)。而 对于番茄中LeNRAMPl而言则可能对铁在微管组织中的转运起到重要作用(Bereczky et al.，2003)。因此，NRAMP基因家族对于控制铁在植物根细胞内平衡和向籽粒中转运等过程 中具有重要的作用，该基因家族功能的研究对通过生物学手段培育富含高铁含量和人体能 够有效吸收的作物籽粒并进而改善人类铁营养缺乏具有较大的优势和潜力。花生(Arachis hypogaea L.)是继大豆之后另一个重要的油料作物，同时也是能 够进行生物固氮的豆科植物，然而，花生缺铁黄化现象在北方石灰性土壤地区极其普遍，是花生高产、稳产的主要限制因子之一(Zuo et al.，2000)。实际上，许多双子叶植物在石灰 性土壤上都不同程度的存在缺铁问题，提高花生铁的利用效率和生物固氮具有重要的实践 意义和生态意义。花生作为机理I植物，目前有关花生二价铁转运蛋白AhNRAMPl基因还没有相关的 研究报道，因此，该基因家族功能的研究将为提高和促进作物对环境中铁的吸收、体内运输 和向籽粒转移的提供重要的理论依据和技术依据，从而进一步为从分子育种或基因工程培 育耐铁花生品种提供重要的技术途径。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种花生二价铁转运蛋白AhNRAMPl。本发明从豆科植物花生中分离到花生二价铁转运蛋白基因AhNRAMPl，核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示，共有2041bp，包括5'端非编码区，一个完整的开放阅读框和包含 PloyA尾巴的3'端非编码区，表明是完整的核苷酸编码序列，SEQ ID No. 1所述序列自5' 端第32-1666碱基为该基因的编码区，编码了 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本发明所提供的花生二价铁转运蛋白AhNRAMPl蛋白，其为1)由SEQ ID No. 2所 示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2)在SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添 加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。该AhNRAMPl蛋白由545个氨 基酸组成，具有12个跨膜区域。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活 性区段，将第(91)位的(L)替换为(S)，或是将第(30)位的(I)缺失，或是在(172位后面) 增加(一个K)。因此，本发明的花生AhNRAMPl蛋白还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、 替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有花生AhNRAMPl蛋白同等活性的由花生AhNRAMPl 蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到 密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特 定物种表达的密码子。本发明另一个目的是提供AhNRAMPl基因在植物耐低铁胁迫或提高植物种子中铁 含量中的应用。具体是将花生AhRNAMPl基因转化到植物中，提高转基因植物对低铁胁迫的 耐受能力或者提高转基因植物种子中铁的含量。优选的植物为豆科植物，更为优选的为花生。本发明提供的AhNRAMPl基因主要在花生根系中表达，且受缺铁诱导高效表达，加 铁抑制该基因表达；将AhNRAMPl基因转化到缺失铁转运基因的酵母突变株中，缺铁条件下 转入AhNRAMPl基因的酵母明显比转入空载体的酵母长势好，结果表明该花生AhNRAMPl基 因对二价铁具有转运作用，促进了缺失铁转运基因的酵母突变株的生长；将AhNRAMPl基因 转化到洋葱表皮细胞中，结果表明该花生AhNRAMPl基因主要定位在洋葱表皮细胞的细胞 膜上；综合上述，本发明获得的AhNRAMPl基因是一个定位于细胞膜上，且在转录水平上受 缺铁诱导的二价铁转运蛋白，可以应用于培育富铁花生品种和耐低铁花生品种中的应用。本发明首次公开了一个花生根系二价铁转运蛋白，获得了该基因cDNA全长，并得到了其编码的蛋白序列，同时运用分子生物学及基因工程技术从不同角度验证说明了大田 作物花生中该基因具有跨膜运输铁的生物学功能，同时基于此研究结果，为通过基因工程 或分子育种提高豆科植物铁利用效率和籽粒铁的富集提供了必要的理论依据和技术支持， 具有较大的应用前景。
图1为本发明花生根系AhNRAMPl基因的3’ RACE PCR扩增结果。图2为本发明花生根系AhNRAMPl基因的5’ RACE PCR扩增结果。图3为本发明酵母表达载体pDR195-AhNRAMPl图谱。图4为本发明洋葱表皮细胞表达载体35SGFP_AhNRAMPl图谱。图5为AhNRAMPl蛋白跨膜结构域分析。图6为AhNRAMP 1与其它植物NRAMP1进化树分析。图7为AhNRAMPl基因在加铁和缺铁条件下转录水平基因表达差异比较结果。图8为AhNRAMPl基因酵母功能互补试验结果。图9为AhNRAMPl基因洋葱表皮细胞亚细胞定位结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1将花生种子‘鲁花14’(购于中国农业科学院)用10%双氧水消毒20-30分钟， 清洗干净后置于饱和硫酸钙溶液中约8小时，并同时通气避光，然后置于铺有吸水纸的托 盘中，并用几层吸水纸盖好，浇适量的水后避光置于人工培养室中。培养室设置条件为光 照14小时30°C，黑暗10小时22°C。1_2天左右花生发芽后移入石英砂中培养，待长出1_2 片叶子后转入水培营养液中培养。水培营养液配方如下=KH2PO4(0. 5mM)、K2SO4(0. 75mM)、 KCl (0. ImM)、MgSO4. 7H20 (0. 65mM)、CaSO4. 2H20 (2mM)、H3BO3 (1 μ Μ)、MnSO4. 4H20 (1 μ Μ)、 ZnSO4. 7H20 (1 μ Μ)、CuSO4. 5Η20 (0· 1 μ Μ)、(NH4) 6Μο7024· 4Η20 (0· 005 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，ρΗ 为5· 8 6。实施例2将已取好保存于-80度冰箱的花生根系及叶片样品放入已经用液氮预冷的研 钵中，加入液氮迅速研磨植物样品直至成粉末状，取出约0. 1克粉末样品于1. 5毫升无 RNase离心管中，迅速加入1毫升RNA提取液Trizol(购自Invitrogen)。并立即将此样 品与Trizol的混合液用涡旋震荡器剧烈震荡15秒左右，使核蛋白充分解离，室温静止5 分钟，加入200微升氯仿后，充分混勻，静止5分钟，放入事先已经预冷到4°C的离心机中以 12000 X g的速度离心15分钟，取上清液入新的1. 5毫升的离心管中，加入500微升异丙醇， 上下颠倒充分混勻，室温放置10分钟，然后4°C 12000 Xg离心10分钟，取出后倒掉上清液， 加入1毫升75%的乙醇，涡旋震荡数秒以便洗涤沉淀，4°C 7500Xg离心5分钟，重复洗涤 两次，取出后倒掉乙醇，并吸出所有上清液后置于超净台中室温下风干。风干后加入适量的DEPC水和RNA酶抑制剂，轻弹离心管让沉淀充分溶解后放于-20°C或-80°C冰箱中贮存备用。实施例3利用CLONTECH PCR-Select cDNA Subtraction Kit (购自 Clontech 公司)，用 花生单作，花生/玉米间作中的花生根系样品进行抑制性差减杂交，具体步骤详见试剂盒 说明书，获得了 490bp的花生AhNRAMPl基因片段。用已知的片段序列设计引物，以花生根系RNA为模板，用Invitrogen公司Super ScriptII逆转录酶试剂盒，01igo(dT)15为引物，42°C反应得到反转录CDNA模板。通过 Clonetech 公司 RACE 试剂盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)进行 PCR 反应，分 别克隆测序得到AhNRAMPl基因5’及3，端(方法参见所述试剂盒说明书)。5’端克隆引 物为AhNRAMP-5’ -GSP GCCAATCCACGAAGGCAGTGATGAGG3’端克隆引物为AhNRAMP-3’ -GSP AACACAGCAATGCAAACCCATGTGGA扩增得到约1500bp的3’端序列(图1)，500bp的5’端序列(图2)，再将之前获 得的中间片段一起拼接得到全长序列。利用拼接的理论全长序列，设计扩增该基因全长的引物，分别为Ahnramp-F GACTCATCACTTGGATTGACTGTAhnramp-R CTCATACATACATAGCTCAAGTCACTPCR反应体系为反转后的根系cDNA稀释5倍后用2 μ 1，IOX反应缓冲液2 μ 1， dNTPs(10mM)0. 5μ 1，MgCl2 (50mM) 0. 5 μ 1，正向引物 Ahnramp-F(0. OlmM) 0. 5 μ 1，反向引物 Ahnramp-R(0. OlmM) 0. 5 μ LddH2O 13. 7 μ l，Taq DNA 聚合酶(Invitrogen 公司)0· 3 μ 1。将 上述混合后进行PCR反应，程序为94°C预变性3min ；94°C变性 30s ；55°C退火 30s ；72°C延伸 2min ；30 个循 环；72°C延伸 IOmin0PCR反应后琼脂糖凝胶电泳得到预期约1. 6kb的DNA条带，然后进行胶回收纯化， 获得该DNA全长。然后将回收得到的DNA连接到pMD20-T载体(TaKaRa公司)，16°C过夜 反应，再转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞(TIANGEN公司)，涂于含Amp抗生素的LB板后 37°C过夜培养，挑单克隆于LB液体37°C过夜摇菌，送菌液测序(上海生物工程公司)，将测 序确认为正确的质粒命名为pMD20-AhNRAMPl质粒。经测序，AhNRAMPl核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。利用DNAman软件翻译得到该基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2所示。实施例4一、水培培养花生，设置正常供铁，缺铁1，4，7，11天，再重新供铁1，3天7个处理。 水培的方法参见实施例1，其中正常供铁的水培营养液配方如实施例1所述，缺铁的水培营 养液是指去除实施例1所述的配方中的EDTA-Fe后的营养液。分别提取花生根系及叶片 RNA (方法同实施例2)，利用DNase消化去除可能污染的基因组DNA，然后进行反转录，通过 相对定量Real-time PCR方法，利用18srRNA基因作为内参基因，分析AhNRAMPl基因在不 同的供铁条件下其转录水平表达情况。二、相对定量 Real time PCR
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在制备标准曲线时，首先需要分别含有AhNRAMPl基因及内参基因Ahl8srRNA基因 的质粒。含有AhNRAMPl基因的质粒直接用前述构建好的pMD20-AhNRAMPl质粒，Ahl8srRNA 基因质粒构建过程如下首先用KOD-pIus DNA聚合酶(购自Τ0Υ0Β0)进行PCR反应。反应体系为KOD-pIus DNA 聚合酶 0. 4 μ 1，10XK0D-plus 缓冲液 2 μ 1，2mM dNTPs 2 μ l,25mM MgS040. 8 μ 1，Q18S-F 正向引物 IOuMO. 6 μ 1、Q18S_R 反向引物 IOuM 0. 6μ 1，花 生根系cDNA 1 μ 1，最后用灭菌水补足到20 μ 1体系。PCR 反应程序为 940C 2min, 94°C 15s, 55°C 30s，68°C 30s, 30 个循环，72°C lOmin。PCR反应后电泳检测，鉴定得到单一条带且条带大小无误后利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (购自 Invitrogen 公司)，将剩下的 PCR 产物取 1 μ 1，加 0. 5 μ 1 salt soluti。n，ly 1灭菌水，及0. 5yLPCR BlimtTOPO载体，室温连接约30分钟，然后将3 μ 1连 接反应液加到ToplO感受态细胞中(购自Invitrogen公司)进行转化，冰上放置30分钟 左右，然后42度水浴放置约45秒，迅速放到冰上，3分钟后加200 μ 1LB,置于37度摇床摇1 小时，然后把该菌液涂到含有卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上，37度培养箱过夜培养约 13-15小时后，可见单一的小菌落，挑单菌落于2mlLB培养基中在37度摇床摇12小时左右， 提取质粒得到T0P0-Ahl8srRNA质粒，进一步测序鉴定分析，保证所有碱基序列无误后选择 该质粒待用。把pMD20-AhNRAMPl质粒及内参基因TOPO-Ahl8srRNA质粒稀释成不同的浓度梯 度，使拷贝数分别为IO3, IO4, IO5, IO6, IO7,分别以此为模板1 μ 1，同时用花生的根系及叶片 样品RNA反转录后的cDNA稀释5倍加2 μ 1为模板，反应体系为TaKaRa SYBR Greenpremix 6. 25 μ 1，ROX Reference Dye 0. 25 μ 1，正向反向引物各0. 2 μ mol，然后以灭菌水补足到 12. 5μ 1 体系，应用 Applied BiosystemsStepOne Plus Real Time PCR System 进行 PCR 反应。PCR反应程序为95°C预变性2min30s ；95°C变性15s ；58°C退火30s ；72°C延伸30s， 同时收集荧光；40个循环；溶解曲线95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s。最后通过计算得到 AhNRAMPl基因在不同处理下的相对表达值。结果如图7所示。结果表明该花生AhNRAMPl基因主要在根系中表达，且表达量在 缺铁的条件下明显增强，加铁时表达受到抑制，说明AhNRAMPl基因是一个受缺铁条件诱导 的基因。相对定量Real time PCR引物通过引物设计软件primerpremier5. 0及结合 oiigoe软件设计获得，引物分别为Q18S-F CCGTCTCAAACAAGAACAAAACCQ18S-R TCACACCAAGTATCGCATTTCGQnramp-F CCTCATCACTGCCTTCGTQnramp-R ATTGCTGTGTTATCCTTGGTC实施例5在已知的AhNRAMPl基因序列编码区两端设计引物，包括编码区，且反向引物包括 终止密码子，并在正反向引物5’端分别加上酶切位点Xba I和Sac I，引物为YNramp-Xba I-F TCTAGAATGGCAAGCGTTCTTAGACAYNramp-Sac I-R GAGCTCTTATTCCGGTAGTGGGATAT
用KOD-plus DNA聚合酶PCR扩增加酶切位点AhNRAMPl基因全长，PCR反应体系为 10XK0D-plus 缓冲液 2μ l，2mM dNTPs 2 μ l,25mM MgS040. 8 μ 1，正向反向引物分别 IOuM 0. 6μ 1，花生根系cDNAly l，K0D-plus DNA聚合酶0. 4 μ 1，加灭菌水至20 μ 1体系。PCR反 应体系为 94°C 2min，94°C 15s，57°C 30s, 68°C lmin30s，30 个循环，72°C IOmin0 PCR 反应后 电泳检测鉴定条带大小正确后，取1 μ IPCR产物，利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit 进行连接反应，然后转化涂板，提取质粒，经测序分析确定该质粒序列无误(具体同前)。实施例6将实施例5构建的质粒用Xba I和Sac I进行酶切，双酶切体系为质粒20 μ 1， Buffer M 5μ 1，Xba I和Sac I酶各2 μ 1，灭菌水21 μ 1以补足到50 μ 1体系。并同时酶 切载体质粒PDR195 (Inoue et al.，2009)，体系同上，电泳并切胶回收含有Xba I和Sac I 酶切位点的AhNRAMPlcDNA全长的目的条带即XbaISac IAhNRAMPl。用Xba I和Sac I酶切后的载体质粒PDR195进行碱性磷酸酶处理，体系为45 μ 1 酶切后质粒，5 μ 1 H缓冲液，1μ 1碱性磷酸酶(购自NEB，New England Biolabs)，49 μ 1灭 菌水，37度放置1小时。然后用苯酚氯仿异戊醇抽提载体PDR195的酶切片段，无水乙醇沉 淀及70%乙醇洗涤，干燥沉淀后用20 μ 1的灭菌双蒸水溶解。随后用Takaraligation Kit Mix连接酶切处理后的载体PDR195和XbaISac IAhNRAMPl基因。连接反应体系为PDR195 载体 0. 5 μ 1，XbaISac IAhNRAMPl 基因 4 μ 1，ligation Kit solution 4·5μ1，连接反应 过夜。然后进行大肠杆菌转化，提取质粒，酶切鉴定，测序进一步确定序列的正确性，获得 PDR195-AhNRAMPl 质粒。酵母转化及酵母功能互补试验主要试剂配制10XTE 0. IM Tris, IOmM EDTA 调节 pH 至 7. 5，121 度高压灭菌 20minIOXLiAc 即IM醋酸锂，称取10. 2g醋酸锂加适量高纯水溶解，用冰醋酸调节PH 值到7. 5，定容到100ml, 121度高压灭菌20min50% PEG :50g PEG 加水定容到 100ml，120 度高压灭菌 20minYPD培养基20g蛋白胨、IOg酵母提取物、20g葡萄糖，加水定容到1L，调节pH为 4. 7SD 平板(IL) (NH4) 2S045g、MgS04500mg、NaCl 500mg、CaCl2500mg、KH2P048 50mg、 K2HP04150mg、H3B03500 μ g、CuS0440 μ g、KI 100 μ g、FeCl3200 μ g、MnS04400 μ g、 Na6Mo7024200 μ g、ZnS04400 μ g、生物素 20 μ g、泛酸 2mg、叶酸 2ug、肌醇 10mg、烟酸 400 μ g、 对氨基苯酸200 μ g、维生素B6400 μ g、核黄素200 μ g、维生素B1400 μ g、色氨酸20mg、亮氨 酸100mg、组氨酸20mg、葡萄糖20g、琼脂粉20g，加水定容至1L，121度高压灭菌后倒约30 个平板。将缺失高亲和力及低亲和力铁转运基因fet3、fet4的酵母突变体株 DEY1453 (Inoue et al.，2009)接种少量加入 3ml YPD，pH 为 4. 7 的培养液中，30 °C 摇 16-18小时至饱和，测定0D600值，再用三角瓶装50mlYPD中加适量该菌液使0D600值调 节至0. 2-0. 3, 30 0C摇3-4小时至0D600约0. 4-0. 6，把得到的菌液IOOOg 5min 25 "C离 心，去上清加8ml TE，混勻后1000g 5min 25°C离心，去上清后在沉淀的菌中加入1200 μ 1 灭菌水、150 μ 1 10 X TE及150 μ 1 10 X LiAc，震荡数秒使菌株悬浮起来。同时取PDR195， PDR195-AhNRAMPl分别10 μ 1加入80 μ 1灭菌水和10 μ 1已经过煮沸处理的鲑鱼精DNA，将
8前面已处理好的含TE及LiAc的突变株菌悬浮液100 μ 1也分别加入到该质粒溶液中，震荡 混勻，加 480 μ 1 50% PEG,60 μ 1 10ΧΤΕ 及 60 μ 1 10 X LiAc 后 30 度摇 30min，再加 70ul DMSO (二甲基亚砜)温和混勻，然后42度水浴15min，冰上放置90s，短暂离心后去上清，加 200 μ 1灭菌双蒸水并轻轻混勻。取100 μ 1涂于加铁的SD平板上。约2天左右长出菌落。挑单菌落30度过夜摇菌后，测定0D600值，再用三角瓶装的25ml YPD将0D600值 调节稀释为0. 2，接着摇4-5小时后，分别取Iml菌液离心30s，去上清，加Iml灭菌水涡旋混 勻，离心30s，去上清，再加ImllOXTE涡旋混勻，离心30s，去上清，再加Iml灭菌水重复洗 2遍，最后加300ul灭菌水涡旋混勻，测定0D600值，用灭菌水将0D600值稀释调节为0. 1， 然后依次稀释10倍，得到0D600值分别为10—1，ΙΟ"2, ΙΟ"3,10_4浓度梯度的菌液，然后分别将 该菌液依次点10 μ 1于缺铁的SD平板，放置30°C培养室培养2天左右，比较酵母的生长状 况。结果如图8所示，结果表明在缺铁条件下，转入AhNRAMPl基因的酵母长势明显优 于转入空载体的酵母，说明该AhNRAMPl基因具有转运二价铁的能力。实施例7根据载体上的酶切位点及参考AhNRAMPl基因序列选择合适的酶切位点，设计加 酶切位点PCR引物获得全长，引物为Nramp-Xho I-F CTCGAGATGGCAAGCGTTCTTAGACANramp-Bgl II-R AGATCTGTTCCGGTAGTGGGATATCAG用KOD-plus DNA聚合酶进行PCR反应，具体方法同前，确定序列准确无误后，用 TaKaRa ligation Kit Mix连接酶将酶切处理后的35S-GFP载体和含有Xho I及Bgl II 酶切位点的AhNRAMPl基因连接，得到35S-GFP-Ahnramp载体质粒，转化后用QIAGEN质粒提 取试剂盒获得高纯度的质粒，然后将准备好的质粒1 μ g进行金粉包裹处理，加10 μ 1金粉， 10 μ 1 2. 5Μ CaCl2及4111 0. IM亚精胺并充分涡旋混勻。同时做对照处理空载体质粒。利 用 Biolistic PDS-1000/He ParticleDelivery System(Bio-Rad，Tokyo，Japan)，将处理好 的载体转入洋葱表皮细胞中，28度避光孵育4小时左右后用激光共聚焦显微镜(LSM510， Karl Zeiss)观察表达的GFP荧光。结果如9所示，结果表明该AhNRAMPl基因定位于洋葱表皮细胞膜上。
权利要求
花生根系AhNRAMP1蛋白，其为1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的蛋白的花生AhRNAMPl基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.权利要求2或3所述的基因在植物耐低铁胁迫或提高植物种子中铁含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将花生AhRNAMPl基因转化到植物中，提高 转基因植物对低铁胁迫的耐受能力或者提高转基因植物种子中铁的含量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为豆科植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为花生。
全文摘要
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种花生二价铁转运蛋白基因及其编码基因与应用。本发明公开了花生二价铁转运蛋白AhNRAMP1，其为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还公开了编码上述蛋白的基因。运用本发明提供的AhNRAMP1培育的豆科植物新品种可以提高对铁利用的效率和提高籽粒中铁的含量。
文档编号C12N15/29GK101955522SQ20101050402
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者左元梅, 张福锁, 熊宏春, 王朋飞, 申红芸 申请人:中国农业大学