专利名称：一种促进微藻快速增殖的培养基及培养方法
技术领域：
本发明涉及一种促进微藻快速增殖的培养基及培养方法。
背景技术：
微藻是一类在水中生长的，种类繁多且分布极其广泛的低等植物，具有高效的光合作用反应系统。微藻通过(X)2的固定，可以将光能转化为化学能，并以油脂或淀粉等有机物的形式储存在体细胞内。随着资源短缺的压力和环境问题日益严峻，利用微藻进行生物柴油及其部分化石能源替代产品的开发，已成为目前研究的热点。相对于一般的自养生物来说，微藻增殖较快，并且需要的养料不多——主要是阳光、水和二氧化碳，不会引起与农业用地、牧业用地竞争的矛盾。总之，微藻的应用前景广阔，它的开发将为我国提供一种新的可再生资源。通过微藻进行生物柴油生产是一个复杂的系统工程，涵盖多个技术环节，包括微藻藻种的筛选和培育、微藻的规模培养和诱导产油脂、油脂的收集和加工等几个方面。微藻作为生物柴油原料的研究始于20世纪60年代，近年来，随着生物技术的发展，通过对藻种的生物改造，已获得丰富的具有高产油能力的微藻资源，因此这种新型的生物柴油生产模式非常具有应用前景。然而，由于微藻是一种处于进化最末端的光能自养型生物，其代谢通路上的限制性因素很多，培养液中(X)2的浓度、溶氧、光强等条件均对微藻的生长构成影响。另外，微藻的产能效率低下，藻类繁殖一代的时间较长，是很多工业微生物几十倍甚至几百倍，因此， 在工业应用中，如何促进微藻快速增殖，进而实现微藻的高密度培养，是发展微藻生物质能源的基础性课题。目前，在微藻培养基营养成分的选择及培养条件的优化方面，已取得了一些工作进展。CN01134147. 5描述了一种将大型藻类细胞浸提液作为培养基，用于进行微藻培养的方法。该方法制备工艺简单，同时营养组分丰富，等同于一种纯天然的培养基，但是，由于这种培养基成分的不确定性，一些代谢机理不明晰，因此很难进行大规模的工业应用。由于微藻是一种光能自养微生物，产能水平及CO2固定效率很低，因此，其生物量增长速率明显低于一般的化能微生物。在微藻培养条件的优化方面，主要的研究热点在于CO2的供给形式的改进，其目的是通过提高(X)2固定效率，以加速生物量的增长。CN2009102(^971. 3公开了一种在微藻培养过程中的供气方式，其主要手段是将(X)2气体以微米级气泡形式注入微藻光合反应器中，以解决(X)2利用率低的问题。CN1109936. 4公开了一种微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其主要手段是从耦合池底部通入富含(X)2溶气水，对藻液进行补碳，在溶气水气化过程中完成细胞溶剂化补碳与气浮法采收。这两种方法均从不同角度增加了 CO2气体与培养液的接触时间，避免了 CO2气体来不及被藻体细胞吸收即被溢出的问题。但是，水生的微藻在进行(X)2固定的过程中一般利用CO:或HC03_，微藻对(X)2的耐受一般在一个较窄的范围，过多的CO2气体通入，不利于微藻生物量的积累。由此看见， 仅仅通过改变(X)2的供给，对提高微藻生物量累计的促进作用有限。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种促进微藻快速增殖的培养基及培养方法。 该培养基配制方法简单、成本低，适于工业应用；采用该培养基进行微藻培养在无需复杂的 CO2供应设备及光照条件下，就可以快速提高微藻自养代谢效率及CO2的固定效率，从而解决微藻生物量积累缓慢的问题。—种促进微藻快速增殖的培养基，在常规培养基中加入含羟基的三碳有机物，含羟基的三碳有机物在培养基中浓度不大于lg/L，优选0. 05g/L 0. 8g/L。本发明中，所述的含羟基的三碳有机物包括甘油、1，3-丙二醇、1、2-丙二醇、丙醇、异丙醇、甘油酸、甘油醛，优选甘油。本发明中，所述的常规培养基的组成为0. 05g/L 0. lg/L K2HPO4 ·3Η20、0. lg/L 0. 3g/L ΚΗ2Ρ04、0· 05g/L 0. lg/L MgSO4 · 7Η20、0· 01g/L 0. lg/LCaCl2 · 2Η20、0· 01g/L 0. 05g/L NaCl、0· 00lg/L 0. 01g/L FeCl3 · 6Η20、0· lg/L 0. 5g/L NaNO3 或 KNO30一种促进微藻快速增殖的培养方法，微藻液体积和含羟基化合物的培养基体积按 1 15 1 30比例在生物反应器内混合，生物反应器内初始微藻生物量为40mg/L 80mg/L，培养温度为20°C 37°C，搅拌速度为IOOrpm 500rpm，光照强度为lOOOlux 50001ux。本发明在进行微藻低生物量培养初期无需气体输送设备，通过开放式的培养方式进行微藻培养。本发明中，微藻可以来自于任何具有完整光能磷酸化体系及C3循环的藻类，如蓝藻、绿藻等，优选绿藻中的球藻。与现有技术相比本发明促进微藻快速增殖的培养基及培养方法具有如下优点1、本发明促进微藻快速增殖的培养基是在常规的培养基中加入少量的含羟基三碳有机物，具有配制方法简单、成本低，适于工业应用等优点。2、从现有技术可知，在微藻的培养过程中，葡萄糖是一种优良的碳源，相同条件下使用葡萄糖作为碳源微藻的生长速度最快，但从本发明的实施例和比较例中可以看出，随着培养时间的增加，含有葡萄糖的培养基中的小球藻的生长速度随着葡萄糖的消耗明显放缓，小球藻生长曲线呈S型，而使用含羟基三碳有机物的培养基中小球藻的快速生长具有持续性，在达到稳定期前，生长曲线几乎成线性，因此甘油、丙醇、丙二醇、甘油醛等这些含羟基的三碳有机物并不是作为传统意义上碳源，含羟基的三碳有机物在二氧化碳的代谢途径中的作用和葡萄糖有明显区别。3、采用本发明的培养基进行微藻培养能够快速提高微藻自养代谢效率及(X)2的固定效率，高于含有相同浓度的葡萄糖的培养基，从而解决微藻生物量积累缓慢的问题。由于光能自养微藻是以C3循环的形式进行(X)2固定的，即(X)2在核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧BS (ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)白勺作用下，核Sll 糖-1，5- 二磷酸羧化为2-羧-3-酮-核糖醇-1，5- 二磷酸，然后2-羧-3-酮-核糖醇-1， 5-二磷酸被裂解为两个3-磷酸甘油酸，从此进入细胞内代谢途径。在常规培养基中加入了含羟基三碳有机物，如甘油、丙醇、丙二醇、甘油醛等，作为一种诱导物，即在微藻的培养初期作为C3循环代谢过程中底物类似物，它的加入可以诱导代谢过程中一些相关酶类(如磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油醛脱氢酶等)的过分表达，由于生物代谢过程是一个链式反应体系，限速反应影响着整个代谢链的效率，因此直接引入了三碳有机物进入微藻的生长循环， 提升了 C3循环代谢效率，即提高了(X)2的固定效率。4、本发明中，主要根据光能自养微生物氧化磷酸化过程及(X)2固定的代谢途径研究，发现了含羟基三碳有机物衔接着整个(X)2羧化和五碳化合物再生过程，因此在培养基配制过程中有针对的添加了含羟基的三碳有机物及其底物类似物，通过底物诱导作用，促进微藻细胞光合反应，从而提高了 (X)2的转化率，提升了整个(X)2固定效率，能够促进微藻在前期培养过程中得以快速生长。与传统的通过各种形式，单纯依靠增加(X)2的通气量，以提高 CO2转化率，实现微藻快速增殖的方法相比，本方法不但针对性更强、效果更明显，而且对培养条件要求更低，设备简单，能耗需求更少，在大规模生产中更容易实现。
图1是实施例中不同甘油浓度下小球藻生物量积累随时间变化曲线图。图2是比较例中不同葡萄糖浓度下小球藻生物量积累随时间变化曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本发明的效果，但不构成对本发明的限制。本发明中，以689nm为扫描波长，建立了 OD值与生物量之间的标准曲线，通过对菌液OD值测量，从而确定计算反应体系内的生物量的浓度，同时，在实际培养过程中可以利用分光光度计，定时测量反应体系的OD值，以确定微藻生物量的积累情况。实施例1(1)常规培养基中加入甘油，使培养基中的甘油浓度为0. lg/L，常规培养基的具体组成为 0. 075g/L K2HPO4 · 3Η20、0· 175g/L ΚΗ2Ρ04、0· 075g/LMgS04 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 · 6Η20、0· 25g/LNaN03。(2)取液体保藏的一种球藻(chlorella vulgaris) IOmL,浓度为 800mg/L，按 1 19体积比，加入190mL新配制的含有甘油的培养基，培养液中微藻菌体浓度为40mg/L 水平。用透气滤菌膜对三角瓶口进行封口处理，以利于培养环境的空气流通。(3)选择振荡摇床进行培养，振荡转速设置为140rpm。利用摇床的照明系统为培养体系提供一个持续的光照条件，光照强度为30001UX水平。整个培养系统的温度设置为 25°C。定时取样以分光光度仪分析摇瓶中OD值，从而计算出藻体浓度。实施例2(1)常规培养基中加入甘油，使培养基中的甘油浓度为0. 25g/L，常规培养基的具体组成为 0. 075g/L K2HPO4 · 3Η20、0· 175g/L ΚΗ2Ρ04、0· 075g/LMgS04 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 · 6Η20、0· 25g/LNaN03。(2)取液体保藏的一种球藻(chlorella vulgaris) 10mL，浓度约为 1200mg/L，按 1 19体积比，加入190mL新配制的含有甘油的培养基，培养液中微藻菌体浓度约为60mg/ L水平。用透气滤菌膜对三角瓶口进行封口处理，以利于培养环境的空气流通。(3)选择振荡摇床进行培养，振荡转速设置为120rpm。利用摇床的照明系统为培养体系提供一个持续的光照条件，光照强度为30001UX水平。整个培养系统的温度设置为27°C。定时取样以分光光度仪分析摇瓶中OD值，从而计算出藻体浓度。实施例3(1)常规培养基中加入甘油，使培养基中的甘油浓度为0.5g/L，常规培养基的具体组成为 0. 075g/L K2HPO4 · 3Η20、0· 175g/L ΚΗ2Ρ04、0· 075g/LMgS04 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 · 6Η20、0· 25g/LNaN03。(2)取液体保藏的一种球藻(chlorella vulgaris) 10mL，浓度约为 1600mg/L，按 1 19体积比，加入190mL新配制的含有甘油的培养基，培养液中微藻菌体浓度约为SOmg/ L水平。用透气滤菌膜对三角瓶口进行封口处理，以利于培养环境的空气流通。(3)选择振荡摇床进行培养，振荡转速设置为160rpm。利用摇床的照明系统为培养体系提供一个持续的光照条件，光照强度为40001UX水平。整个培养系统的温度设置为 25°C。定时取样以分光光度仪分析摇瓶中OD值，从而计算出藻体浓度。比较例常规培养基中加入葡萄糖，配制培养基中的葡萄糖浓度分别为0. Ig/L,0. 25/ L、0. 5g/L的三种含葡萄糖的培养基，常规培养基的具体组成为0. 075g/LK2HP04 · 3H20、 0. 175g/L KH2P04、0. 075g/L MgSO4 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 ·6Η20、0. 25g/L NaNO30其余条件同实施例1至3，定时取样以分光光度仪分析摇瓶中 OD值，从而计算出藻体浓度。按照实施例1 3的培养方式，通过几天的培养，微藻生物量的积累情况见图1，可以看出在培养基中添加适量浓度的甘油，在培养的初期，由于甘油的加入，使得微藻藻种很快度过延滞期，更有利于微藻生物量的积累。按照比较例1 3的培养方式，通过几天的培养，生物量的积累情况见图2，可以看出，由于葡萄糖是一种广谱碳源，因此加入葡萄糖会引起球藻进行异养生长，在葡萄糖浓度较低的情况下，生物量的积累速度与培养基中葡萄糖的浓度成正比。从实施例和比较例分析，甘油和葡萄糖都能对小球藻生物量的积累起到促进作用，但两者的机理完全不同，尤其是在低浓度范围内，甘油的效果更佳显著。一方面，葡萄糖等碳源的加入，直接引起了微藻异养生长，其生长速度随着碳源的消耗而逐渐降低，从而在其生长曲线上表现为S型，但甘油等三碳化合物完全是作为诱导物形式起作用，当培养液中存在一个最适浓度即可持久的产生作用。另一方面，在进行异养培养时，一般碳源应该持在一个较高浓度，因此通过比较可以看出，含羟基三碳有机物的诱导作用效果明显优于低浓度碳源的效果。
权利要求
1.一种促进微藻快速增殖的培养基，其特征在于所述的培养基是在常规培养基中加入含羟基的三碳有机物，含羟基的三碳有机物在培养基中浓度不高于lg/L。
2.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于含羟基的三碳有机物在培养基中浓度为 0. 05g/L 0. 8g/L。
3.按照权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述的含羟基的三碳有机物包括甘油、1，3-丙二醇、1、2_丙二醇、丙醇、异丙醇、甘油酸、甘油醛。
4.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于常规培养基的组成为0.05g/L 0.Ig/ L K2HPO4 ·3Η20、0· lg/L 0. 3g/L ΚΗ2Ρ04、0· 05g/L 0. lg/LMgS04 ·7Η20、0· Olg/L 0. lg/L CaCl2 ·2Η20、0· Olg/L 0. 05g/L NaCl、0· OOlg/L 0. Olg/L FeCl3 · 6Η20、0· lg/L 0. 5g/ L NaNO3 或 KNO3。
5.一种促进微藻快速增殖的培养方法，其特征在于微藻液体积和权利要求1所述的含羟基三碳有机物的培养基体积按1 15 1 30比例在生物反应器内混合，生物反应器内初始微藻生物量为40mg/L 80mg/L，培养温度为20°C 37°C，搅拌速度为IOOrpm 500rpm，光照强度为 IOOOIux 50001ux。
6.按照权利要求5所述的培养方法，其特征在于微藻为具有完整光能磷酸化体系及 C3循环的藻类。
7.按照权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于微藻为绿藻中的球藻。
全文摘要
本发明公开一种促进微藻快速增殖的培养基及培养方法，所述的促进微藻快速增殖的培养基是在常规培养基中加入含羟基的三碳有机物，含羟基的三碳有机物在培养基中浓度不大于1g/L，优选0.05g/L～0.8g/L，含羟基的三碳有机物包括甘油、1，3-丙二醇、1、2-丙二醇、丙醇、异丙醇、甘油酸、甘油醛。一种促进微藻快速增殖的培养方法，微藻液体积和含羟基三碳有机物的培养基体积按1∶15～1∶30比例在生物反应器内混合，生物反应器内初始微藻生物量为40mg/L～80mg/L，培养温度为20℃～37℃，搅拌速度为100rpm～500rpm，光照强度为1000lux～5000lux。本发明的培养基配制方法简单、成本低，适于工业应用；采用该培养基进行微藻培养在无需复杂的CO2供应设备及光照条件下，就可以快速提高微藻自养代谢效率及CO2的固定效率，从而解决微藻生物量积累缓慢的问题。
文档编号C12N1/38GK102443562SQ201010511190
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者师文静, 张霖, 李晓姝, 王领民 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院