专利名称：玉米赤霉烯酮毒素的分子检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物检验检疫技术领域，具体地说涉及一种镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮的检验检疫方法，与分子检测技术有关。
背景技术：
由禾谷镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是世界范围内危害小麦、大麦、玉米等作物的一种重要病害，不仅严重影响作物产量，而且镰刀菌可以产生大量对人畜有毒害作用的次级代谢物，即镰刀菌毒素，使粮食或饲料的品质降低。由于镰刀菌毒素的稳定性高、不易降解，所以可随食品、饲料加工过程进入食物链，进而威胁到人畜健康。玉米赤霉烯酮(ZEN)是禾谷镰刀菌产生的最重要的镰刀菌毒素之一，广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物和奶类品中。玉米赤霉烯酮是一种雌激素类的聚酮化学物，具有很强的生殖毒性和致畸作用，可导致家畜生长下降、免疫紊乱、繁殖障碍等，给畜牧业带来很大的经济损失。鉴于玉米赤霉烯酮的巨大危害性，欧盟已制定了该毒素在食品和饲料中的限量标准，各国政府检验检疫部门也加强了对这种毒素的检测监控研究。目前玉米赤霉烯酮的检测方法主要是相色谱-质谱(LC/MS)化学分析法，但该方法涉及到毒素的提取、纯化等流程，操作比较费时和复杂，而且需要昂贵的仪器设备。随着国际贸易中各国之间粮食进出口规模不断扩大，各国口岸加强了对小麦和玉米的出入境管理，检疫实践中急需一种快速、灵敏、准确地检测出进口粮食或饲料中是否存在ZEN毒素污染，以判断其是否合格，能否进关。近年来随着禾谷镰刀菌分子生物学研究的快速发展，一些参与玉米赤霉烯酮生物合成的基因被鉴定出来。最新的研究结果表明，在禾谷镰刀菌中PKS4基因是玉米赤霉烯酮生物合成的关键基因(Erik et al. ThePKS4 gene of Fusarium graminearum is essential for Zearalenone production. Appl. Environ. Microb. ,2006,72 3924-3932 ； Kim et al. Two different polyketide synthase genes are required for synthesis of Zearalenone inGibberella zeae. Mol. Microbiol. ,2005,58 :1102-1113. Gaffoor et al. Characterization oftwo polyketide synthasegenes involved in Zearalenone biosynthesis in Gibberella zeae. Appl. Environ. Microb. , 2006, 72 :1793_1799),借鉴伏马菌素和单端孢霉烯族毒素分子鉴定方法的思路，基于这些最新的分子生物学研究结果和相关基因序列信息，同样可以建立玉米赤霉烯酮毒素的分子鉴定技术，并应用于谷物或饲料中的毒素检测。
发明内容
本发明的目的在于研制出一种能够快速准确检测禾谷镰刀菌菌株本身产生玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)和谷物或饲料中玉米赤霉烯酮毒素污染的分子鉴定方法，以达到准确、快速、低成本地检测出玉米赤霉烯酮毒素的目的。本发明是这样实现的
利用NCBI数据库中已经公开发表的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)的毒素合成基因PKS4序列(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，设计一对特异性引物，可从产ZEN毒素的菌株基因组中扩增出单一的片段，而不产ZEN毒素的菌株扩不出任何条带。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的有无及大小快速鉴定ZEN毒素。具体步骤如下一种产ZEN毒素禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe) PKS4基因的特异片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列全长为271bp。用于扩增上述ZEN毒素的PKS4基因特异片段的引物，它们的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示所示。一种产玉米赤霉烯酮毒素(简称ZEN毒素)禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)PKS13基因的特异片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示，序列全长为 302bp。用于扩增上述ZEN毒素的PKS13基因特异片段的引物，它们的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO 5 和 SEQIDN0 6 所示所示。ZEN毒素的分子检测方法，其步骤分别如下(1)分离、纯化禾谷镰刀菌，鉴定后保存；(2)将步骤(1)得到的菌株置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上25°C、黑暗条件下培养7天，收集的菌丝在液氮中研磨成粉末，用常规的CTAB法抽提菌丝DNA ；(3)取0. 5g左右待检测的生物样品在液态氮中磨碎后，用常规的CTAB法提取 DNA，用 50ul TE 溶解，加 2ul 10mg/ml RNA 酶，37°C水浴 30min 后，用体积比为 25 24 1 的苯酚氯仿异戊醇溶液纯化DNA，重复沉淀DNA —次，最后再用50ul TE溶解DNA，其中待检测的生物样品是受镰刀菌毒素污染的籽粒、饲料或食品，或是受镰刀菌毒素病菌侵染的植物的植株和组织；(4)用序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的引物对进行PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO 1所示的特异片段或无扩增产物；(5)用序列表SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的引物对进行PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO :4所示的特异片段或无扩增产物；(6)用步骤(4)和(5)得到的扩增产物检测所述的镰刀菌菌株是否可产ZEN毒素或/和被测生物材料是否存在所述的ZEN毒素；ZEN毒素PKS4基因和PKS13基因的特异性条带分别为27 Ibp和302bp。上述步骤(4)和(5)所说的PCR具体步骤是1)扩增反应体系在20ul PCR反应液中，含有50ng模板DNA，2ul 10XPCR缓冲液 (配方20mM Tri-HClpH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 2OmM MgSO4)，2ul 1. 25mM dNTPs, 0. 5ul Primer Pl (10 μ M)，0. 5ul Primer P2(10yM),lU Taq DNA 聚合酶；2)PCR 反应条件:94°C 4min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；及终延伸 72 °C 8min ；3)反应完成后，取4ul PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的有无及大小判定结果。本发明的有益的效果
利用已公布的ZEN毒素生物合成关键基因PKS4和PKS13序列信息，设计了两对特异引物，经PCR扩增，即可简单快速可靠地鉴定出禾谷镰刀菌是否产生ZEN毒素。通过对5 个禾谷镰刀菌菌株(见表1和表2，根据本领域的常识，上述菌株或材料仅仅是一些检测的媒介菌株，运用本领域的常规方法只要鉴定为禾谷镰刀菌的菌株就可以作为本发明实施例的试验材料，不限于表1或表2所示的菌株或材料，鉴定禾谷镰刀菌菌株的方法不需要创造性劳动)进行LC/MS化学分析，结果显示5个禾谷镰刀菌菌株都可以产生ZEN毒素。从图2 和图4可以看出，利用设计的引物PKS4-P1/2进行扩增，5个禾谷镰刀菌产生了一条271bp 的片段，被禾谷镰刀菌侵染的样品DNA中均扩增出271bp的片段，健康的籽粒因为没有外来菌株的侵染，也就没有相关毒素的累积和污染，故没有扩增出条带。图3和图5显示，利用引物PKS13-P1/2进行扩增，5个禾谷镰刀菌产生了一条302bp的片段，被禾谷镰刀菌侵染的样品DNA中均扩增出302bp的片段，健康的籽粒没有扩增出条带。这些分析结果充分说明了本发明具有特异性高、准确度高和灵敏度高的特点。据此，该发明不仅可以用于鉴定某一禾谷镰刀菌是否产生ZEN毒素，而且能简单快速地检测出粮食、饲料和食品安全中毒素ZEN 的污染状况。目前有关ZEN毒素分子鉴定的研究一直停滞不前，本发明首次基于PKS4和 PKS13基因序列信息来鉴定ZEN毒素的产生情况，所以本发明在ZEN毒素分子检测领域迈出了具有重要意义的一步，有效地将分子生物学检测方法应用到ZEN毒素的检测实践中。
SEQ ID NO :1是禾谷镰刀菌合成ZEN毒素PKS4基因的特异片段，序列全长为 271bp。SEQ ID NO :2和3是发明设计的扩增ZEN毒素PKS4基因的引物序列。SEQ ID NO :4是禾谷镰刀菌合成ZEN毒素PKS13基因的特异片段，序列全长为 302bp。SEQ ID NO :5和6是发明设计的扩增ZEN毒素PKS13基因的引物序列。图1，是本发明的技术流程图。图2，是本发明中应用特异性引物PKS4-P1/2扩增不同禾谷镰刀菌菌株基因组DNA 后获得的产物的电泳结果。泳道M为IOObp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照，无模板 DNA ；泳道1 5对应的菌株依次为5035，12002,B51066,M57034和M57046，本发明试验所用菌株的来源及编号见表1和表2。图3，是本发明中应用特异性引物PKS13-P1/2扩增不同禾谷镰刀菌菌株基因组 DNA后获得的产物的电泳结果。泳道M为IOObp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照，无模板DNA ；泳道1 5对应的菌株依次为5035，12002，B51066，M57034和M57046，本发明试验所用菌株的来源及编号见表1和表2。图4，是应用特异性引物PKS4-P1/2检测小麦感染赤霉病籽粒中的毒素ZEN的片断。泳道M为IOObp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照，无模板DNA ；泳道1为健康籽粒样品DNA扩增结果；泳道2 6分别为产生ZEN毒素的菌株5035，12002，B51066，M57034 和M57046感染的籽粒样品DNA扩增的片段，菌株来源编号见表1。图5，是应用特异性引物PKS13-P1/2检测小麦感染赤霉病籽粒中的毒素ZEN的片断。泳道M为IOObp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照，无模板DNA ；泳道1为健康籽粒样品DNA扩增结果；泳道2 6分别为产生ZEN毒素的菌株5035，12002，B51066，M57034 和M57046感染的籽粒样品DNA扩增的片段菌株来源编号见表1。
具体实施例方式实施例1制备实施例1.检测用相关菌株的收集从中国不同地区收集的小麦、大麦和玉米赤霉病病穗样品，经过组织分离和单孢纯化培养，经形态标准程序鉴定后，得到的禾谷镰刀菌菌株如表1所示。表1本发明所采用的禾谷镰刀菌菌株
菌株编号来源省份寄主ZEN毒素检测结果
5035湖北小麦产ZEN毒素
12002四川小麦产ZEN毒素
B51066湖北大麦产ZEN毒素
M57034湖北玉米产ZEN毒素
M57046_mt__产 ZEN 毒素_注本表是利用LC/MS化学分析测定的结果。2.基本检测方法的建立2. 1.禾谷镰刀菌孢子悬浮液的制备将纯化、鉴定后的禾谷镰刀菌菌株(表1)在PDA培养基(配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，121°C高压蒸汽灭菌20min后使用)上活化培养5d后， 挑取边缘菌丝接种于CMC液体培养基(配方羧甲基纤维素7. 5g，NH4NO3O. 5g，KH2PO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 25g，酵母膏0. 5g，加蒸馏水定容至1L，121°C高压蒸汽灭菌20min后使用， PH 7.0)中振荡培养(25°C，150rpm)产生分生孢子后，用血球计数板计数，将孢子浓度调为 5 X IO4个/毫升左右用于接种。2. 2.花期接种及毒素化学检测在感病小麦品种“安农8455”扬花期，用微型喷雾器均勻喷雾麦穗，每穗喷雾浓度为5X IO4个/毫升的禾谷镰刀菌孢子液约1ml，每个菌株接种30个麦穗。然后套塑料袋保湿3d，3d后摘除塑料袋。小麦成熟后采集麦穗，用于毒素化学分析和籽粒DNA的提取。接种的小麦样品经搅拌器研磨粉碎，然后称取5g样品至50ml三角瓶中，加入 25ml乙腈-水(体积比为84 16)，150r/min振荡抽提16h。提取物经Whatman (110_ Dia，购自英国Whatman公司)滤纸过滤，收集滤液，取4ml过柱(Bond Elut Mycotoxin, Varian)纯化，收集纯化后的滤液参照 Romagnoli et al. (Romagnoli et al. Simultaneous determination of deoxynivalenol, zearalenone, T~2 and ΗΤ—2 toxins in breakfastcereals and baby food by high-performance liquid chromatography and tandemmass spectrometry. J. MASSSpectrom. ,2010,45 1075-1080)的方法上机进行液相色谱-质谱(LC/MS)分析。表2特异性PCR检测的禾谷镰刀菌扩增结果
权利要求
1.一种禾谷镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮PKS4基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，序列全长为27 Ibp。
2.一种禾谷镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮PKS13基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示，序列全长为302bp。
3.用于扩增权利要求1或2所述的基因片段的引物，其核苷酸序列分别如下所示PKS4-P1 GATCGCCAACCGAATCTCCCACT ；PKS4-P2 :ACCACATCCTTCACCACGCCCAT ；PKS13-P1 CTCCAGCAGCCTGTTTCTAAGTC ；PKS13-P2 TCTGGCAACTCTTCTTCCATCAC。
4.一种应用PKS4基因片段对禾谷镰刀菌玉米赤霉烯酮毒素的分子鉴定方法，该基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其步骤包括(1)从被测的生物材料中抽提总DNA，得到DNA样品；(2)用权利要求3中PKS4-P1和PKS4-P2引物对步骤(1)所述的DNA样品进行PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO :1所示的基因片段;(3)用步骤(2)得到的基因片段，检测所述的生物材料中是否存在玉米赤霉烯酮毒素； 其中步骤(2)所述的PCR步骤包括1)扩增反应体系在20ulPCR反应体系中，含有约50ng模板DNA，2ul 10XPCR缓冲液，2ul 1. 25mM dNTPs，0. 5ul 引物 PKS4-P1 (10 μ Μ)，0. 5ul 引物 PKS4-P2 (10 μ Μ)，IU TaqDNA聚合酶；2)PCR反应条件94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；最后 72°C延伸 8min ；3)电泳检测反应完成后，取4ulPCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的大小判定结果，其中步骤1)所述的PCR缓冲液组成如下20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgS04。
5.一种应用PKS13基因片段对禾谷镰刀菌玉米赤霉烯酮毒素的分子鉴定方法，该基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，其步骤包括(1)从被测的生物材料中抽提总DNA，得到DNA样品；(2)用权利要求3中PKS13-P1和PKS13-P2引物对步骤(1)所述的DNA样品进行PCR 扩增，得到如序列表SEQ ID NO :4所示的基因片段；(3)用步骤(2)的基因片段，检测所述的生物材料中是否存在所述的玉米赤霉烯酮毒素；其中步骤⑵所述的PCR步骤包括1)扩增反应体系在20ulPCR反应体系中，含有约50ng模板DNA，2ul 10XPCR缓冲液，2ul 1. 25mM dNTPs，0. 5ul 引物 PKS13-P1 (10 μ Μ)，0. 5ul 引物 PKS13-P2 (10 μ Μ)，IUTaq DNA聚合酶；2)PCR反应条件94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；最后 72°C延伸 8min ；3)电泳检测反应完成后，取4ulPCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的大小判定结果，其中步骤1)所述的PCR缓冲液组成如下20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM (ΝΗ4) 2804 , 20mM MgS04。
6.权利要求4或5所述的方法在检测玉米赤霉烯酮毒素中的应用，其中包括在检测谷物籽粒、饲料或食品中的玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
7.权利要求1或2所述的基因片段在检测玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
8.权利要求3所述的引物在鉴定玉米赤霉烯酮毒素中的应用，其中包括在检测谷物籽粒、饲料或食品中的玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
全文摘要
本发明属于植物检验检疫技术领域，具体涉及一种镰刀菌毒素ZEN的分子检测方法及应用。其特征是，针对玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)，通过PKS4和PKS13基因序列信息设计了两对PCR引物PKS4-P1和PKS4-P2以及PKS13-P1和PKS13-P12，分别从产ZEN毒素的禾谷镰刀菌基因组中分离得到271bp、302bp的特异片段，采用PCR反应，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物，直接根据产物片段的有无及大小，即可检测出禾谷镰刀菌产毒素ZEN的情况。本发明可用于谷物、饲料和食品安全中ZEN毒素的检测分析。
文档编号C12Q1/68GK102453721SQ20101051177
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者廖玉才, 张静柏, 李和平, 王建华, 瞿波, 黄涛 申请人:华中农业大学