专利名称：一株酿酒酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株酿酒酵母菌株及其应用。
背景技术：
酵母菌是一类单细胞真菌的总称，并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明 史中被应用得最早的微生物。目前已知有1000多种酵母菌，根据酵母菌产生孢子(子囊孢 子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类形成孢子的株系属于子囊菌或担子菌，不形成孢 子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”(Kreger-van R，Groningen N Y. The yeasts -.a taxonomic study. Third revisedand enlarged edition[M]. The Netherlands =Elsevier science publishers B. V，1984.)。目前已知大部分酵母被分类到 子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如，在水 果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见(于景芝.酵母生产与应用手册 [M],中国轻工业出版社，2005)。酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。 在缺乏氧气时酵母进行无氧呼吸，其中发酵型的酵母可以通过糖酵解途径(EMP途径)将糖 类转化成为丙酮酸，丙酮酸再被进一步转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量(王镜岩，朱 胜庚，徐长法.生物化学(第三版，下册).北京高等教育出版社.2002:82)。在酒精工业 上，利用发酵型的酵母无氧呼吸可产乙醇的特点，将酵母可以利用的发酵性糖转化为酒精。乙醇作为可再生能源，可直接作为液体燃料或者同汽油混合使用，燃料乙醇作为 新的燃料替代品，可减少对不可再生能源-石油的依赖，保障国家能源的安全。现行酒精工 业生产采用较多的是发酵法采用各种含糖(双糖)、淀粉(多糖)的农产品或农林业副产 物为原料，经过水解(即糖化)多糖转化为单糖后发酵、或直接发酵双糖转化为乙醇。淀粉 质在淀粉酶类的作用下，水解为葡萄糖，再进一步发酵生成乙醇(马赞华.酒精高效清洁生 产新工艺[M].化学工业出版社，2003)。广西地处亚热带地区，非粮经济作物甘蔗和木薯的种植面积和产量皆为全国第 一。甘蔗主要用于制糖，糖蜜是甘蔗制糖的副产物，含有大量酵母可发酵性糖。鲜木薯块 根的淀粉含量达30%，木薯淀粉经过α -淀粉酶液化和糖化酶糖化后转化为酵母可发酵性 糖-葡萄糖。糖蜜和木薯淀粉是酵母发酵产酒精的优良生产原料。2008年，广西中粮生物 质能源有限公司已在广西北海建成并投产以糖蜜和木薯为原料年产20万吨燃料乙醇的生 产设备。另外，广西还有2家公司较大规模地以糖蜜和木薯为原料生产乙醇，分别为位于钦 州市的新天德股份有限公司和位于平果县的平果凯特生物化工股份有限公司。酿酒酵母是酒精工业发酵生产上常用的微生物菌种。酒精工业生产中对菌株的要 求越来越高，首先要求酵母菌具有极高的产酒效率，对发酵性糖的转化率高，不造成糖质原 料的浪费；其次是发酵液成熟之后酒精含量高，降低蒸馏能耗；再次是发酵速度快，提高设 备的利用率，降低生产成本(江宁.生物液体燃料——燃料酒精[J]. Chinese Journal of Nature, 2007, 29(1) 30-33)。限制这三大要求的主要因素是酵母对高浓度发酵性糖和酒精的耐受力、对原料的转化率和对各种不利发酵条件(如高温、低PH和有毒物质等)的耐受 力。国内酒精工业生产中广泛应用的酿酒酵母为湖北安琪酵母股份公司生产的耐高温活性 干酵母(安琪酵母，简称为AQ)，虽然发酵特性较好，但也难以满足工业上的更高要求。
发明内容
本发明的目的是提供一株酿酒酵母菌株及其应用。本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为ZM1-5，简称酿酒酵 母ZM1-5或ZM1-5，分离自广西壮族自治区钦州市果园土壤，已于2010年4月23日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 3761。酿酒酵母ZM1-5可用于生产酒精。用于生产酒精时，酿酒酵母ZM1-5可以单独使用，也可与其它酿酒酵母混合使用。应用所述酿酒酵母ZM1-5生产酒精时，pH值为3-9，温度为28-42°C。应用所述酿 酒酵母ZM1-5生产酒精时，pH值优选为4-5。应用所述酿酒酵母ZM1-5生产酒精时，温度优 选为28-40°C，温度最优选为32°C。本发明还保护一种生产酒精的方法，是通过发酵酿酒酵母ZM1-5，得到酒精。所述方法中，用于发酵的底物具体可为葡萄糖和/或蔗糖。所述方法中，用于发酵的底物可为木薯产品(如木薯粉液化醪)、糖蜜和甘蔗汁中 的至少一种。所述发酵的温度可为32°C至42°C中的任一温度，如32°C、37°C、40°C或42°C。所述发酵起始时，所述酿酒酵母ZM1-5在发酵体系中的浓度可为1. 5X IO7至 2. 5 X IO7 个细胞 /mL，优选为 1. 5 X 107-2. 0 X IO7 个细胞 /mL 或 2. 0 X 107-2. 5 X IO7 个细胞 /mL,如 1. 5 X IO7 个细胞 /mL、2. 0 X IO7 个细胞 /mL 或 2. 5 X IO7 个细胞 /mL。酿酒酵母ZM1-5具有以下生理特征(1)在酵母粉蛋白胨琼脂平板上32°C培养 2-3天，菌落为乳白色、隆起、表面光滑、边缘整齐；细胞圆形或椭圆形，无性繁殖方式为芽 殖；(2)菌株最适生长和发酵温度32°C;pH范围3-9 ；最适生长pH4_5 ； (3)该菌株在32°C、 37°C和42°C的生长速率快于安琪酵母；(4)该菌株能在50%的葡萄糖培养基上生长；该菌 株能在含有抑制物1.6mol/L妝(1、16%乙醇、48/1乙酸、20(^8/1^418的￥ 0培养基上生 长；(5)应用于以木薯粉液化醪、糖蜜和甘蔗汁为原料发酵生产酒精时，酒精产量和发酵效 率比目前工业生产用安琪耐高温活性干酵母高。与现有工业生产常用的安琪耐高温酵母菌比较，酵母菌株ZM1-5具有生长快、酒 精产量高、耐高温、耐高糖、耐高浓度乙醇和耐酸等多个优点。酿酒酵母ZM1-5可应用于以 木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等为原料的浓醪发酵产酒精工艺(同步糖化发酵)中，解决工业生产 中酵母菌不能耐受高渗透压、高浓度乙醇和发酵后期效率低等问题，降低酒精工业生产的 成本。与安琪耐高温酵母菌相比，酿酒酵母ZM1-5在高温条件下发酵具有更高的酒精产量。 酵母菌株ZM1-5用于同步糖化发酵产酒精工艺中，有望解决浓醪发酵中底物浓度高(渗透 压高)、发酵罐内温度高、发酵后期酵母菌受高浓度酒精抑制等问题。
图1为ZM1-5和AQ在各种高温条件下在YPD平板上的照片。图2为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度NaCl的YPD平板上的照片。图3为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙醇的YPD平板上的照片。图4为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙酸的YPD平板上的照片。图5为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度G418的YPD平板上的照片。图6为30°C时ZM1-5和AQ在50%葡萄糖的YPD平板上的照片。图7为ZM1-5和AQ在不同培养温度下在YPD平板上的形态；A =AQ在32°C的菌落 形态；B :ΖΜ1-5在32°C的菌落形态；C :AQ在37°C的菌落形态；D :ZM1_5在37°C的菌落形态； E =AQ在42°C的菌落形态；F :ΖΜ1-5在42°C的菌落形态。图8为ZM1-5和AQ在电子扫描显微镜下的形态；A =AQ在32 °C培养时细胞的显 微形态；B :ΖΜ1-5在32°C培养时细胞的显微形态；C =AQ在42°C培养时细胞的显微形态；D ZM1-5在42°C培养时细胞的显微形态。图9为ZM1-5与AQ在不同pH条件下生长24h的菌体量比较。图10为ZM1-5与AQ在不同温度条件下生长20h的菌体量比较。图11为ZM1-5与AQ在不同温度条件下的生长曲线比较；A =AQ ；B :ZM1_5。图12为ZM1-5与AQ在不同温度下发酵葡萄糖72h后的酒份比较。图13为ZM1-5与AQ在不同温度下发酵蔗糖72h后的酒份比较。图14为ZM1-5与AQ发酵木薯粉液化醪结果分析；A 酒份；B 活菌浓度；C 残总 糖；D 残还原糖。图15为ZM1-5与AQ发酵甘蔗汁产物结果分析；A 酒份(灭菌甘蔗汁为底物)；B 酒份(新鲜甘蔗汁为底物)；C 残糖含量(灭菌甘蔗汁为底物)；D 残糖含量(新鲜甘蔗汁 为底物)；E =CO2失重(灭菌甘蔗汁为底物)；F =CO2失重(新鲜甘蔗汁为底物)。图16为ZM1-5与AQ在不同温度下发酵甘蔗糖蜜结果分析；A 酒份；B =CO2失重。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。安琪酵母(AQ，耐高温活性干酵母)购自湖北安琪酵母股 份公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。YPD培养基(pH4. 5)酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，固体培养基 含琼脂15g/L。YPD+50% Glu 培养基(ρΗ4· 5) 固体培养基含琼脂15g/L。YPD+20% Glu 培养基(ρΗ4· 5) 固体培养基含琼脂15g/L。YPD+20% Sue 培养基(ρΗ4· 5) 体培养基含琼脂15g/L。实施例1、酵母菌株ZM1-5的获得酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖500g/L， 酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖200g/L， 酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、蔗糖200g/L，固
一、酵母菌株ZM1-5的获得1、样本采集样品果园土壤。采集地点广西壮族自治区钦州市农村。2、酵母菌株的分离采用稀释涂平板法进行分离称取Ig 土壤于IOOmL三角瓶中，加入IOmL灭菌蒸馏 水，置于28°C、转速为ISOrpm的恒温摇床震荡2小时，取ImL悬浊液稀释至10入10_2、10_3、 10_4、10_5稀释度，各稀释梯度分别取100 μ L涂布YPD平板，置于32°C恒温培养箱培养2天 后挑出单菌落。3、酵母菌株的筛选酵母菌的具体筛选步骤如下①观察平板上长出的菌落形态，并镜检其细胞形态，对其中确定为酵母菌的菌落 进行纯化，纯化后作为备选菌株进行菌株耐高温生长试验；②纯化后的菌株分别置于32°C、37°C、42°C培养3_5天，观察菌体生长情况，选出 耐高温酵母菌株。③各耐高温酵母菌株分别点接于YPD培养基上，32°C培养48小时，长出菌落后倒 入TTC上层培养基(红四氮唑TTC 0.058，葡萄糖0.58，琼脂1.5g，水IOOmL)，避光保温 2-3h，选出显色较深的酵母菌株。 ④TTC筛选得到的酵母菌株分别接入YPD液体培养基中，28。C、ISOrpm摇床过夜培 养，菌液按OD6tltl = 0. 01的终浓度接入带有杜氏小管的YPD液体培养基中，分别置于32°C、 37°C、40°C、42°C下培养，分别在12h、24h和48h观察和记录杜氏小管中产气情况，选出产气 较多的酵母菌株。⑤杜氏发酵检测产气快且多的菌株接入50mLYPD液体培养基，28°C、ISOrpm摇床 培养24h，按10%的接种量(体积百分含量)接入装有IOOmL含YPD+20%Glu液体培养基 的250mL三角瓶，发酵72h后蒸馏检测其酒精产量。⑥酵母菌在各种培养基上的抗逆性生长检测采用休止细胞梯度生长实验，将酵母菌接种于20mL的YPD液体培养基中， 32 0C培养12h (OD600 = 0 . 7)，离心收集菌体，制备休止细胞。调节菌液浓度为0D_ = 1.0，并稀释至IOciUO-1UO-2UO-3UO-4的浓度，分别取4μ1点接于各种高渗透压培养基 [YPD+NaCl (1. 2mol/L, 1. 4mol/L, 1. 6mol/L)，YPD+50 % Glu]平板，以及 YPD+ 乙醇(12%, 14%,16% ), YPD+ 乙酸(3g/L, 4g/L), YPD+G418 (100 μ g/L, 200 μ g/L)平板，经 32°C 培养 2-3天，观察菌落生长情况。本段中的％均为体积百分含量。通过以上分离和筛选，得到33株酵母菌，其中一株各方面性状良好，将其命名为 菌株ZM1-5。ZM1-5和AQ在各种高温条件下在YPD平板上的照片见图1。30°C时ZM1-5和AQ 在各种浓度NaCl条件下在YPD平板上的照片见图2。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙醇 条件下在YPD平板上的照片见图3。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙酸条件下在YPD平板 上的照片见图4。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度G418条件下在YPD平板上的照片见图5。 30°C时ZM1-5和AQ在50%葡萄糖条件下在YPD平板上的照片见图6。二、酿酒酵母ZM1-5的鉴定
ZM1-5 分别在 YPD 平板上 32°C、37°C、42°C培养 2 天，32°C、37°C 生长旺盛，42°C也 能生长。菌落为乳白色、隆起、表面光滑、边缘整齐(见图7)。显微镜下细胞圆形或椭圆形， 无性繁殖方式为多边芽殖(见图8)。ZM1-5可同化果糖、棉子糖、半乳糖、麦芽糖、纤维二糖、蜜二糖、海藻糖、松三糖、 α-甲基D葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺；ΖΜ1-5可同化硫酸铵、硝酸钾；ΖΜ1-5可发酵葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不可发酵乳糖。根据ΖΜ1-5的形态与生理生化特征，参考《The Yeast))和《常见与常用真菌》，将 ZM1-5鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。将酿酒酵母ZM1-5保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 3761。实施例2、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长pH值的比较酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ采用完全相同的条件进行处理，确定最适生长pH 值。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)过夜培养，检测菌液的0D_值。2、按OD6tltl = 0.01终浓度将菌液接入不同pH值(3、4、5、6、7、8或9)的YPD液体培 养基中，28°C、ISOrpm培养24小时，用分光光度计于600nm波长下测定光密度值(0D_值)。设置三次重复试验，结果取平均值。ZM1-5与AQ生长24h的菌体量比较见图9。酿 酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长pH均为4-5。实施例3、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长温度的比较酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ采用完全相同的条件进行处理，确定最适生长温度。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)过夜培养，检测菌液的0D_值。2、按OD6tltl = 0.01终浓度将菌液接入YPD液体培养基(pH4. 5)中，不同温度(28°C、 32°C、35°C、37°C、40°C或 42°C )、180rpm 培养 20 小时，检测菌液的 OD600 值。设置三次重复试验，结果取平均值。ZM1-5与AQ在不同温度条件下生长20h的菌体 量比较见图10。酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长温度均为32°C，酿酒酵母ZM1-5 在28-42°C温度下生长量均比安琪酵母AQ高。实施例4、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ在不同温度下生长曲线的比较酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ采用完全相同的条件进行处理，比较不同温度下的 生长曲线。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)过夜培养，检测菌液的0D_值。2、按0D_ = 0.01终浓度将菌液接入YPD液体培养基(pH4. 5)中，分别不同温度 (281、321、351、371、401或42°0、180卬111培养72 小时，分别在 4h、16h、22h、28h、48h、 68h取样，检测菌液的0D_值。设置三次重复试验，结果取平均值。ZM1-5与AQ在不同温度条件下的生长曲线比 较见图11。两者于22h基本达到稳定期，22h之后安琪酵母AQ在32°C时的生长曲线趋于平 稳，而酿酒酵母ZM1-5在22h后仍趋于缓慢生长阶段。两株菌均在32°C时生长最快，菌量最 多。在42°C，酿酒酵母ZM1-5存活能力明显高于安琪酵母AQ，说明酿酒酵母ZM1-5比安琪 酵母AQ有更强的耐受高温的能力。实施例5、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ发酵葡萄糖的比较将酵母菌菌液(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)接入IOOmL的YPD+20% Glu液体培养基，接种量为1.5X107个/mL(终浓度)，分别置于不同温度(32°C、37°C、40°C或42°C) 下发酵，发酵72h后取发酵液测酒精度(酒份)。酒精度检测方法取IOOml发酵液加入IOOmL蒸馏水，混勻后加热蒸馏。收集 IOOmL馏出液，加入蒸馏水IOOmL,混勻，用酒精计测定酒精度，温度计测定混合液温度；得 到的值查酒度温度校正表换算成20°C时的酒精度％ (体积百分含量)，再乘以2，即得发酵 液的酒精度。设置三个重复，结果取平均值。ZM1-5与AQ在不同温度下发酵葡萄糖72h后的 酒份比较见图12。酿酒酵母ZM1-5在32°C时酒份达到最高(11. 3% )，37°C时酒份稍低 (10.8% )，40°C时酒份为10. 5%，42°C时酒份为7.4%0安琪酵母AQ，40°C时酒份为9.9%, 42°C时酒份为6. 7%。40°C、42°C时酿酒酵母ZM1-5酒份均显著高于安琪酵母AQ，说明酿酒 酵母ZM1-5高温下利用葡萄糖产酒能力比安琪酵母AQ更强。实施例6、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ发酵蔗糖比较将酵母菌菌液(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)接入IOOmL的YPD+20% Sue液体 培养基，接种量为1.5X107个/mL(终浓度)，分别置于不同温度(32°C、37°C、40°C或42°C) 下发酵，发酵72h取发酵液测酒精度(酒份)。酒精度检测方法同实施例5。设置三个重复，结果取平均值。ZM1-5与AQ在不同温度下发酵蔗糖72h后的酒份 比较见图13。两个菌株均是在32°C发酵时酒份最高，37°C、40°C时酒精产量稍低。42°C时， 酿酒酵母ZM1-5的酒份显著高于安琪酵母AQ，说明了酿酒酵母ZM1-5高温下利用蔗糖产酒 能力比安琪酵母AQ更强。实施例7、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ利用木薯粉液化醪发酵产酒精比较木薯粉液化醪广西中粮生物质能源有限公司，每IOOmL醪液含27g总糖。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液体培养基中28°C、180rpm 摇床培养约24h，使活菌浓度达到OD6tltl = 2. 0以上，于显微镜下血球计数板计算菌液浓度。2、分别按1. 5 X IO7个细胞/mL，2. OXlO7个细胞/mL，2. 5 X IO7个细胞/mL的接种 量(终浓度)将菌液接入9个装有500mL木薯粉液化醪的IL三角瓶中(每个接种量3瓶)， 32°C培养70小时，得到发酵液。3、测定发酵液中各种成分(酒精，活菌数、残总糖、残还原糖)的含量。酒精度检测方法同实施例5。活菌数检测方法(平板计数法)以10倍为梯度稀释发酵液，各梯度取100 μ 1涂 布YPD平板三块，32°C恒温培养2-3天，依次观察涂布各个稀释液的平板，用涂布最大稀释 度的稀释液且有单菌落生长的平板进行计算，计算生长的单菌落个数(能生长菌落的最大 稀释度的平板上)；计算公式活菌数/ml =(三块平板上生长的单菌落个数/3) XlOX稀
释倍数。残总糖的测定①取ImL发酵液加入5mL ddH20、ImL浓盐酸；②于沸水中反应 20min后于冷水中冷却；③加入一滴酚酞，并用4M NaOH水溶液滴至微红，最后将溶液定容 至IOOmL,得到反应液；④取400 μ L的反应液加入800 μ L DNS溶液(四水合酒石酸钾钠 200g，氢氧化钠10g，无水亚硫酸钠0. 5g，结晶酚2g，DNS 10g，蒸馏水1L，室温避光静置7天 后可用)，沸水浴5min后冷水冷却，取200 μ L于酶标板，OD540处测值；⑤所得的值代入葡萄 糖标准曲线即得还原糖的量(残总糖的量)。
残还原糖的测定①取ImL发酵液加入19mL ddH20,混勻；②取400 μ L混勻液加 入800 μ L的DNS溶液，沸水浴煮5min后冷水冷却，取200 μ L于酶标板，OD540处测值；③所 得的值代入葡萄糖标准曲线即得还原糖的量(残还原糖的量)。实验设置三次重复，结果取平均值。结果见图14。在接种量为2. 0X IO7个/mL时，酿酒酵母ZM1-5发酵的酒份最高，达到15. 2%，比 安琪酵母 AQ 高 0. 8% (t-test, ρ < 0. 05)。在各个接种量，酿酒酵母ZM1-5的活菌数均比安琪酵母AQ显著高；在接种量为
1.5X IO7个细胞/mL并经过70小时的发酵后，酿酒酵母ZM1-5增殖到3. 20X IO8个/mL活 菌浓度；说明酿酒酵母ZM1-5在浓醪、高酒精环境下能较好地存活。酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ在接种浓度为2. OX IO7个细胞/mL时的残总糖 量比其它两个接种量低，说明接种量为2. OX IO7个细胞/mL时发酵效果最好；在接种量为
2.OX IO7个细胞/mL时，酿酒酵母ZM1-5的残总糖量和残还原糖量分别比安琪酵母AQ低 0. 2g/100mL和 0. 09g/100mL。实施例8、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ利用甘蔗汁发酵产酒精比较1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液体培养基中28°C、180rpm 摇床培养约24h，使活菌浓度达到OD6tltl = 2. 0以上。2、取IOmL步骤1的菌液接入装有IOOmL甘蔗汁(新鲜糖蔗压榨取得，总糖含量为 18% )的250mL三角瓶中，分别置于不同温度(32°C、37°C、40°C、或42°C )下培养70小时， 得到发酵液。3、取IOmL步骤1的菌液接入装有IOOmL灭菌甘蔗汁(新鲜糖蔗压榨取得，总糖含 量为18%，分装三角瓶后121°C灭菌20分钟)的250mL三角瓶中，分别置于不同温度(32°C、 37°C、40°C、或42°C )下培养70小时，得到发酵液。4、测定步骤2和步骤3的发酵液的二氧化碳失重以及发酵液中各种成分(酒精、 残总糖)的含量。二氧化碳失重发酵前后发酵液的重量差即二氧化碳失重(g)。酒精度检测方法同实施例5。残总糖的测定方法①取ImL发酵液加入3mL ddH20和ImL的浓盐酸； ②66°C -68°C反应IOmin后于冷水中冷却；③加入一滴酚酞，并用4M NaOH水溶液滴至微 红，最后将溶液定容至10mL，得到反应液；④取400 μ L反应液加入800 μ L的DNS溶液；⑤ 沸水浴煮5min后冷水冷却，取200 μ L于酶标板，OD54tl处测值；⑥所得的值代入葡萄糖标准 曲线即得还原糖的量(残总糖的量)。实验设置三次重复，结果取平均值。酿酒酵母ΖΜ1-5与安琪酵母AQ发酵甘蔗汁产 物结果分析见图15。灭菌后的甘蔗汁酒精发酵，酿酒酵母ΖΜ1-5与安琪酵母AQ的酒精产量 在32°C时相当(10. )，酿酒酵母ZM1-5在37°C (10·3%)和42°C (7. 1% )时的酒精产 量均高于AQ的(10%，6. 5%) ；40°C和42°C时酿酒酵母ZM1-5的残总糖含量比AQ的低。在 新鲜甘蔗汁的酒精发酵中，酿酒酵母ZM1-5在32°C时酒份为10. 1%、42°C时酒份为7. 6%， 安琪酵母AQ在32°C时酒份为9. 6%、42°C时酒份为7%，酿酒酵母ZM1-5的酒份均比安琪酵 母AQ的高；32°C和37°C时，酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的残总糖含量都相当低；40°C和 42°C时，酿酒酵母ZM1-5残总糖含量低于安琪酵母AQ的。新鲜蔗汁发酵中，酿酒酵母ZM1-5的CO2失重在42°C显著高于安琪酵母AQ的。结果表明，酿酒酵母ZM1-5在新鲜蔗汁中发酵 比在灭菌蔗汁中发酵效果好，且残糖含量低，如果应用于实际生产，将可以节省大量能源。实施例9、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ利用糖蜜发酵产酒精比较1、糖蜜与自来水1 2体积比稀释、混勻，pH调至4.0，即为糖蜜培养基。2、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液体培养基中28°C、180rpm 摇床培养约24h，使活菌浓度达到OD6tltl = 2. 0左右。3、取IOmL菌液接入含IOOmL糖蜜培养基的250mL三角瓶中，分别置于不同温度 (321、371、401或421)培养70小时，得到发酵液。4、测定步骤3的发酵液的二氧化碳失重以及发酵液的酒精度。二氧化碳失重发酵前后发酵液的重量差即二氧化碳失重(g)。酒精度检测方法同实施例5。实验设置三次重复，结果取平均值。ZM1-5与AQ在不同温度下发酵甘蔗糖蜜结果 分析见图16。酿酒酵母ZM1-5在不同温度下的酒精度和二氧化碳失重均明显比安琪酵母 AQ高，说明它可以糖蜜为底物进行发酵，且发酵结果较安琪酵母AQ好。
权利要求
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZM1 5，它的保藏编号为CGMCC No.3761。
2.权利要求1所述酿酒酵母ZM1-5在生产酒精中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于应用所述酿酒酵母ZM1-5时，pH值为3-9， 温度为28-42°C ；应用所述酿酒酵母ZM1-5时，pH值优选为4_5 ；应用所述酿酒酵母ZM1-5 时，温度优选为28-40°C，温度最优选为32°C。
4.一种生产酒精的方法，包括如下步骤发酵权利要求1所述酿酒酵母ZM1-5，得到酒Ib ο
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，用于发酵的底物为葡萄糖和/ 或蔴糖。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，用于发酵的底物为木薯、糖蜜 和甘蔗汁中的至少一种。
7.如权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为32°C至42°C。
8.如权利要求4至7中任一所述的方法，其特征在于所述发酵起始时，权利要求1所 述酿酒酵母ZM1-5在发酵体系中的浓度为1. 5 X IO7至2. 5 X IO7个细胞/mL。全文摘要
本发明公开了一株酿酒酵母菌株及其应用。本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZM1-5 CGMCC No.3761。酿酒酵母ZM1-5可用于生产酒精。酵母菌株ZM1-5具有生长快、酒精产量高、耐高温、耐高糖、耐高浓度乙醇和耐酸等多个优点，可应用于以木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等为原料的浓醪发酵产酒精工艺(同步糖化发酵)中，解决工业生产中酵母菌不能耐受高渗透压、高浓度乙醇和发酵后期效率低等问题，降低酒精工业生产的成本。酵母菌株ZM1-5用于同步糖化发酵产酒精工艺中，有望解决浓醪发酵中底物浓度高(渗透压高)、发酵罐内温度高、发酵后期酵母菌受高浓度酒精抑制等问题。
文档编号C12R1/865GK101962620SQ20101051266
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者冯家勋, 罗雪梅 申请人:广西大学