专利名称：一种海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株hgmn422及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及的是一种海洋好氧反硝化盐单胞菌 (Halomonas sp.)菌株及其在处理受无机氮污染海水中的应用。
背景技术：
近年来，在海水网箱养殖产业飞速发展的同时，网箱养殖“自身污染”问题日益凸现出来，不但对邻近海域生态环境造成了严重负面影响，反过来又制约了海水养殖生产本身。海水网箱养殖系统作为一种高密度、高投饵的人工养殖生态系统，其输出的废物，残饵、 代谢及排泄废物等是引发环境问题的主要污染源，最后导致养殖区海水富营养化，为赤潮的发生提供了物质基础，成为赤潮发生的诱因。近年来我国近岸海域赤潮发生的频率、波及范围和危害程度呈逐年上升趋势，其中有害赤潮的爆发对环境、经济和人体健康造成的影响尤为严重。调查发现，大部分富营养化海水中氮、磷含量十分丰富，尤其以无机氮污染最为严重，其中近岸海域中无机氮超II类海水水质标准的海域占52%。网箱养殖与水域生态环境的矛盾的日趋突出，养殖对水域环境的要求使得对海水网箱养殖环境修复的研究极其迫切。近年来国内外对氮污染的治理日益重视，当前已经有许多物理化学方法可以实现污染水体中硝酸盐的去除。譬如，离子交换，反渗透和电渗析等都是很有效的处理技术。但是利用这些工艺的主要缺点就是成本昂贵，而且如何处理由这些工艺本身产生的高浓度的硝酸盐废水也是一个问题。利用生物反硝化方法去除硝酸盐氮是脱除氮素污染的一种经济有效的方法。为达到对海水网箱养殖环境中无机氮污染的快速、高效去除，本发明从网箱养殖沉积环境中分离纯化获得一株微生物，并用于对无机氮污染的有效治理。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株，该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力，能快速有效的去除无机氮污染海水中的亚硝酸盐氮(NO2--N) 及硝酸盐氮(NO3--N),成本低且环保。本发明的第二个目的在于提供上述海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株在处理受无机氮污染海水中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株，该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas sp.)，保藏名称盐单胞菌HGMN422，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日期2009年8月沘日，保藏号CCTCC NO :M209186。优选的，所述海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株的筛选分离鉴定过程为取海水鱼类网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用富集基和选择培养基培养后，并分离纯化菌株，根据菌株对亚硝酸盐氮(NO2--N)及硝酸盐氮(NO3--N)还原能力的强弱，筛选出对无机氮好氧反硝化能力强的菌株，并最终筛选出一株对亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)及硝酸盐氮(N03_-N)还原能力强的菌株，编号为HGMN422，然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株HGMN422 经鉴定为盐单胞菌属，命名为盐单胞菌(Halomonas sp. )HGMN422。本发明的第二个目的是上述海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株在处理受无机氮污染海水中的应用。在处理受无机氮污染海水中的具体过程为取经上述分离纯化的盐单胞菌 (Halomonas sp.)HGMN422单菌落，于活化培养基中培养20_24h，按海水与菌液体积比为 40-60 1，将盐单胞菌(Halomonas sp.) HGMN422接种于含高浓度亚硝酸盐氮(Ν02__Ν)和硝酸盐氮(Ν03_-Ν)的海水中，pH范围7. 6-8. 2，20-28°C恒温振荡培养3_9d。上述活化扩大培养中培养基的组成优选为葡萄糖10g，柠檬酸钠5g，醋酸钠 1. 5g，氯化铵1. Og，硝酸钾1. Og，磷酸氢二钠0. 6g，磷酸二氢钾0. 4g，硫酸镁0. lg，氯化亚铁 0. lg，酵母膏 0. 5g，陈海水 IOOOmL, pH 7. 6-8. 2，121°C灭菌 20min。本发明与现有技术相比具有以下优点本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得到的新菌株，在好氧条件下具有高效反硝化能力，具有良好的去除受无机氮污染海水中亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)和硝酸盐氮(N03_-N)的能力，能在3-9d内几乎完全去除海水中的亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)和硝酸盐氮(Ν03_-Ν)。该新菌株对海水养殖生物斑节对虾(Penaeus monodon) 虾苗和黑鲷(Sparus macrocephalus)仔鱼没有毒害致病作用。
图1是菌株HGMN422菌株的电镜图片；图2是菌株HGMN422的PCR产物琼脂糖电泳图；图3是菌株HGMN422在以亚硝酸盐氮(Ν02__Ν)为唯一氮源培养基下的降解效率图；图4是菌株HGMN422在以硝酸盐氮(Ν03__Ν)为唯一氮源培养基下的降解效率图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。实施例1海洋好氧反硝化菌株的筛选方法一、材料准备1、菌源和实验废水(1)菌源有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物。(2)实验废水A (高浓度硝酸盐氮(Ν03_-Ν)海水)硝酸盐钠2.6g，葡萄糖36g，酵母膏 0. 5g,陈海水 1OOOmL, ρΗ7· 6 8. 2，121°C灭菌 20min。(3)实验废水B (高浓度亚硝酸盐氮(NO2--N)海水)亚硝酸盐钠2. lg，葡萄糖36g， 酵母膏 0. 5g,陈海水 1OOOmL, ρΗ7· 6 8. 2，121°C灭菌 20min。2、培养基(1)选择培养基葡萄糖Mg，柠檬酸钠14.78，硝酸钾6.78，氯化铵4.78，磷酸二氢钾 1. 8g,陈海水 1OOOmL, 121°C灭菌 20min。(2)分离及斜面培养基葡萄糖10g，柠檬酸钠5g，醋酸钠1. 5g，氯化铵1. 0g，硝酸钾1. Og,磷酸氢二钠0. 6g，磷酸二氢钾0. 4g，硫酸镁0. Ig,氯化亚铁0. Ig,酵母膏0. 5g，琼脂粉 20g,陈海水 IOOOmL, pH 7. 6 8. 2，121°C灭菌 20min。(3)活化扩大培养基葡萄糖10g，柠檬酸钠5g，醋酸钠1. 5g，氯化铵1. Og,硝酸钾 1. Og,磷酸氢二钠0. 6g，磷酸二氢钾0. 4g，硫酸镁0. Ig,氯化亚铁0. Ig,酵母膏0. 5g，陈海水 IOOOmL, pH 7. 6 8. 2，121°C灭菌 20min。(4)硝酸盐氮(NO3--N)还原培养基肉汁胨 IOOOmL, KNO3Ig, pH 7. 0 7. 6，121 °C 灭菌20min。(5)亚硝酸盐氮(NO2--N)还原培养基牛肉膏10g，蛋白胨5g，NaNO2Ig,蒸馏水 IOOOmL, pH 7. 3 7. 4，121°C灭菌 15min。3、实验仪器和设备广东海利电磁式空气压缩机AC0-009E ；苏州安泰超净工作台SW-CJ-IBU ；上海精宏生化培养箱SHP-150 ；苏州欧倍振荡培养箱0BS-2F ；德国HYDRO-BIOS-KIEL 采泥器；日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85 ；美国LaChat流动注射分析仪QC8000 ；日立H-7650透射电子显微镜；PC818 型 PCR 仪；电泳仪及电泳槽；凝胶紫外观测仪等。二、菌株的分离与筛选1、菌株的富集取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层以下5cm处的沉积物放入采样袋，再放入0°C冰盒中带回实验室。取250g沉积物加到2L的富集瓶中，加入750mL选择培养基，并加入适量的纤维棉，在室温条件下间歇曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水和选择培养基。2、菌株的分离纯化挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均勻涂布于分离培养基平板上培养3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰箱4°C保存。3、好氧反硝化细菌的筛选通过对亚硝酸盐氮(NO2--N)和硝酸盐氮(NO3--N)还原能力的反应，挑选对亚硝酸盐氮(NO2--N)和硝酸盐氮(NO3--N)都具有利用效果的菌株。亚硝酸盐氮(NO2--N)还原反应将分离纯化的菌株接种于液体亚硝酸盐氮 (NO2--N)还原培养基中，28°C培养3d，滴加格里斯氏试剂，若培养基中红色消失为亚硝酸盐氮(NO2--N)还原阳性，红色无变化则为阴性；硝酸盐氮(NO3--N)还原反应将分离纯化的菌株接种于液体硝酸盐氮(NO3--N)还原培养基中二8°C培养3d，滴加格里斯氏试剂、二苯胺试剂，当液体培养基中滴入格里斯氏试剂后，溶液如变为粉红色、橙色、棕色为硝酸盐氮(N03_-N)还原阳性；若无红色出现，滴加二苯胺试剂，此时若呈蓝色反应，则为硝酸盐氮(N03_-N)还原阴性，若不呈蓝色，按硝酸盐氮(Ν03_-Ν)还原阳性处理。 经过筛选获得一株编号为HGMN422的菌株，即海洋好氧反硝化菌株HGMN422。
实施例2海洋好氧反硝化菌株HGMN422的鉴定1、对海洋好氧反硝化菌株HGMN422的鉴定对海洋好氧反硝化菌株HGMN422进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤①细菌核DNA的提取1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1. 5ml菌液于 Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清。2)加STE缓冲液1. 5ml洗涤一次，离心弃上清，再加入0. 6mlTE溶液，重悬细菌。3)力卩 30ull0mg/ml 的溶菌酶，37°C水浴 45min。4)力卩65ull0%的SDS，20mg/ml的蛋白酶K3ul，50°C水浴2h，至溶液变清。5)加入等体积酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白质为止。6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc (pH5. 2)。7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用70%的乙醇洗涤一次，自然晾干，并将DNA溶于IOOuITE溶液中。8)加入终浓度为 50ug/ml 的 foiase，37°C，30min,去除 RNA，_20°C保存备用。②16S rDNA基因的PCR扩增Pl :27F(5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')P2 :1492R(5' -AAG TCG TAA CAA GGT AAC C_3')在50 μ L的反应体积中，加入1 μ L模板DNA(0. lug)，0. 5 μ LPl和Ρ2 (终浓度为 0. 5 μ Μ), 1 μ L dNTP (每种 NTPO. 2mM)，0· 5 μ LTaq 聚合酶(2U)禾口 5 μ LlO X PCR 缓冲液。PCR 扩增条件为94°C预变性5min，在94°C变性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30 次；最后72°C终延伸IOmin0③PCR产物的回收将PCR产物以琼脂糖凝胶(体积百分含量？)进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1. 5ml离心管中加2倍体积TE，65°C水浴IOmin后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍体积的 lOmol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70% (体积百分含量？)乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。①16S rDNA的部分序列测定和分析P-f :CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；P-r :GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。力口入1 μ L 模板 DNA ( < 0. lug)，PCR 扩增 30 个循环(94 "C lmin, 55 "C 30s, 72 °C 2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在AppliedBiosystem373 ADNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与 GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。2、16S rDNA 序列测定本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1500bp的扩增带用琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。
0076]AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATG500077]CAAGTCGAGCGGAAACGATCCTAGCTTGCTGGGAGGCGTCGAGCGGCGGA1000078]CGGGTGAGTAACGCATAGGAATCTGCCCGGTAGTGGGGGATAACCTGGGG1500079]AAACCCAGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTT2000080]CGGACCTTGCGCTATCGGATGAGCCTATGTCGGATTAGCTGGTTGGTGAG2500081]GTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCA3000082]GCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCGAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG3500083]GGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGT4000084]GAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAAGAAATCCTCG4500085]GGGCTAATACCCTCGAGGGAGGACATCACCCACAGAAGAAGCACCGGCTA5000086]ACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGA5500087]ATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCCTGATAAGCCGGTTGTGAAA6000088]GCCCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCCGGAACTGTCAGGCTAGAGTGC6500089]AGGAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG7000090]GGAGGAATACCAGTGGCGAAAGCGGCCTTCTGGACTGACACTGACGCTGA7500091]GGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG8000092]CCGTAAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGGTCCTTGAGACCTTTGTGGCG8500093]CAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA9000094]ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA9500095]ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACCCTTGACATCGAGAGAACTT10000096]GGCAGAGATGTCTTGGTGCCTTCGGGAACTCTCAGACAGGTGCTGCATGG10500097]CCGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCG11000098]CAACCCTTGTCCCTATTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCTAGGGAGAC11500099]TGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGGTCATCATGGC12000100]CCTTACGGGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTG12500101]CGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCGAAAAGCCGGTCTCAGTCCGGATC13000102]GGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAAT13500103]CAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA14000104]CACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCCTAACTTCGGAGGGC14500105]GATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC15000106]实施例3海洋好氧反硝化菌株HGMN422菌落形态、生理和生化特征0107]海洋好氧反硝化菌株HGMN422菌落形态、生理和生化特征见表1_1 ；细胞形态见图
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表1-1海洋好氧反硝化菌株HGMN422的菌落形态特征以及主要的生理生化特征
权利要求
1.一种海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株，其特征在于该菌株属于盐单胞菌属 (Halomonas sp.)，保藏名称盐单胞菌HGMN422，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009年8月28日，保藏号CCTCC NO :M209186。
2.权利要求1所述的海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株在处理受无机氮污染海水中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株处理受无机氮污染海水的具体过程为取经分离纯化的海洋好氧反硝化盐单胞菌(Halomonas sp. )HGMN422单菌落，于活化扩大培养基中培养20-24h，按海水与菌液体积比为40-60 1， 将海洋好氧反硝化盐单胞菌(Halomonassp. )HGMN422接种于含高浓度亚硝酸盐氮(Ν02__Ν) 及硝酸盐氮(NO3--N)海水中，pH值为7. 6-8. 2，20-28 °C恒温振荡培养3_9d。
全文摘要
本发明公开了一种海洋好氧反硝化盐单胞菌菌株，该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas sp.)，保藏名称盐单胞菌HGMN422，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009年8月28日，保藏号CCTCC NOM209186。该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力，能快速有效的去除受无机氮污染海水中的亚硝酸盐氮(NO2--N)及硝酸盐氮(NO3--N)，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用。本发明对去除海水养殖环境中高浓度无机氮污染具有安全、环保、高效的特点。
文档编号C12N1/20GK102154143SQ20101051533
公开日2011年8月17日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者古小莉, 孟霞, 廖秀丽, 黄洪辉, 黄珂 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所