专利名称：一种通过bmp15基因高效快速检测绵羊高繁殖性状的方法
技术领域：
本发明涉及策勒黑羊BMP15基因编码序列上的一个单核苷酸多态性(简称SNP) 位点，可作为绵羊高繁殖性状的一个分子标记，建立了判定该SNP位点基因型的检测方法。
背景技术：
绵羊属单胎哺乳类动物，但某些绵羊品种却具有稳定的多胎性能。研究认为， BMPR-IB基因，⑶F9基因和BMP15基因对控制绵羊多胎性能有重要价值，尤其发现在以上 三个基因序列中的碱基改变，可以显著影响绵羊的繁殖性状。！^ecB基因是在绵羊上发现的 第一个多胎主效基因，该基因是BMPR-IB基因上的一个碱基发生突变产生，同样在⑶F9和 BMP15上也发现能够影响绵羊产羔性能的基因。在我国的多胎绵羊中，均发现了 !^ecB基因存在并显著影响产羔数，该基因已经作 为分子标记在生产实践中广泛应用；但其他多胎主效基因研究还没有明确的结论。本发明 研究绵羊多胎主效基因，有助于了解哺乳动物繁殖性状的作用机制，同时可以把多胎主效 基因作为分子标记，迅速提高绵羊的繁殖性能。
发明内容
本发明的目的在于提供的通过BMP15基因高效快速检测绵羊高繁殖性状的方 法，对甄别绵羊的繁殖率具有着重要的科学价值，并已得到实践的验证。本发明的目的是这样实现的一种通过BMP15基因高效快速检测绵羊高繁殖 性状的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因编码序列中新发现的一个SNP位点，其位 点位于Genebank序列(序列号为NM_001114767. 1)从BMP15基因序列的起始密码子 ATG开始+755位点，发生了 T —C突变(简称T755C) ；2)人工合成一对核苷酸序列作为 检测T755C位点的引物，其正向引物5' -gaagaccaaacctctccctaagg-3 ‘；反向引物 5' -tactttcaggcccatcatgctcc-3‘；上下游引物长度均为23bp，将其结合到绵羊BMP15基 因相应的模板链上，并扩增到含有E+755位点的核酸序列；3)提取DNA，利用引物扩增PCR， 将产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色，以凝胶成像确定已扩增的目的条带； 4)利用限制性内切酶Apa I对PCR产物进行消化，消化后用8%丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银 染色，以凝胶成像鉴别该绵羊个体在T755C位点的基因型，将其不同的基因型作为绵羊高 繁殖性状的分子标记，用于辅助选择育种；上步的T755C位点突变后，造成BMP15蛋白的结构和功能发生改变，显著改变了母 羊的产羔数；上步酶切消化产物大小为140bp时，表示该个体没有高繁殖性能；酶切消化产物 大小为120bp和140bp两条带时，表示该个体具有高繁殖性能。所述检测绵羊高繁殖性状的方法，利用限制性内切酶Apa I识别T755C位点，此序 列为C时能切开，序列为T时不能被切开。所述检测绵羊高繁殖性状的方法，获取的BMP15基因T755C位点，因不同基因型个体间具有不同的繁殖性状，其不同的基因型可以作为绵羊高繁殖性状的分子标记。所述检测绵羊高繁殖性状的方法，实验选用的试剂与药剂均为市售产品。本发明构思及作用机理利用DNA序列分析技术对策勒黑羊BMP15基因编码区序 列进行了分析，在E+755位点(Genebank序列Access number :NM_001114767. 1起始密码子 ATG开始+755个碱基)首次发现了碱基T — C的突变(简称T755C)；该核苷酸突变后，造 成三联密码子由CTG突变为CCG，从而导致编码亮氨酸的密码子转变为脯氨酸，引起BMP15 蛋白结构和功能的改变，并显著影响了母羊的产羔数。该方法由于E+755位点不同的基因型，可以作为判断绵羊个体是否具有高繁殖性 状的一个分子标记；建立的检测该位点的高效快速检测方法，对提高畜牧业种群的繁育及 优选有着重要的实用价值，彰显技术进步。
本发明对照说明书附图作进一步阐述。附图1为本方法扩增的PCR产物的电泳图；如图所示泳道1为150bp Marker, 2-8为PCR产物，大小为140bp附图2为本方法的内酶切消化后的电泳图；如图所示泳道13 为 IOObp Marker，1，2，3，4，5，7，9，10，11，12 泳道为 140bp，6 和 8泳道为120bp和140bp
具体实施例方式本发明对照实施例作进一步说明。一、体外扩增(1)采集羊外周血液1. 5ml，使用肝素纳抗凝，经过冻融和离心后，收集沉淀的白 细胞，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA ；(2)采用位于 Genebank 序列(Access number :NM_001114767. 1)从 ATG 开始第 +729bp到+751bp作为上游引物，并在引物1的第22个碱基由A改为G，增加了内切酶Apa I的一个识别位点，从ATG开始第+846bp到+848bp作为下游引物，以上引物进行PCR扩增 可以得到长度为140bp的特异性核酸序列；(3) PCR 扩增反应体系10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, 25mM MgCl 1. 5uL, lOmmol/L dNTP 混合物 2 μ L，10 μ mol/L 上游引物 1 μ L，10 μ mo 1/L 下游引物 1 μ L，Taq 酶 1. 25U, 50ng/ μ L 绵羊基因组 DNA 1 μ L, DMSOl μ L, ddH20 补足 20 μ L ；G) PCR 反应循环程序95°C 5min 1 个循环；95°C 30s，58°C退火 90s，72°C 90s 共 ；35个循环；72°C 5min 1个循环；(5)通过2%的琼脂糖凝胶电泳，确定PCR产物扩增出目的条带的质量(见附图 1)。二、扩增片段的限制性内切酶片段长度多态性技术分析(1)用内切酶Apa I对PCR产物进行消化反应。反应体系为PCR产物4 μ L， IOXbuffer 1 μ L，内切酶5U，用双蒸水补足至10yL，37°C水浴10h。(2)检测酶切产物。酶切产物用8%聚丙烯酰胺处置上凝胶电泳，硝酸银染色，利用凝胶成像系统观察结果(见附图2)。三、BMP15基因E+755位基因型的判断标准(1)BMP15基因E+755位的碱基为T，则酶切消化产物大小为140bp ；(2)碱基为C，则酶切消化产物大小为120bp ；(3)碱基是杂合子，则酶切产物有140bp和120bp两条带；通过观测聚丙烯酰胺凝胶电泳后的染色结果，判定酶切消化产物的带型，可以确 定该绵羊个体中BMP15基因+755位置的基因型。四、酶切消化产物大小为140bp时，该个体没有高繁殖性能，酶切消化产物大小为 120bp和140bp两条带时，该个体具有高繁殖性能。
权利要求
1.一种通过BMP15基因高效快速检测绵羊高繁殖性状的方法，其特征在于包括1)在 策勒黑羊BMP15基因编码序列中新发现的一个SNP位点，其位点位于Genebank序列(序列 号为NM_001114767. 1)从BMP15基因序列的起始密码子ATG开始+755位点，发生了 T — C 突变(简称T755C) ；2)人工合成一对核苷酸序列作为检测T755C位点的引物，其正向引物 5‘ -gaagaccaaacctctccctaagg-3‘；反向弓丨物5‘ _tactttcaggcccatcatgctcc_3‘；上下 游引物长度均为23bp，将其结合到绵羊BMP15基因相应的模板链上，并扩增到含有E+755位 点的核酸序列；3)提取DNA，利用引物扩增PCR，将产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化 乙锭染色，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4)利用限制性内切酶ApaI对PCR产物进行 消化，消化后用8%丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，以凝胶成像鉴别该绵羊个体在T755C 位点的基因型，将其不同的基因型作为绵羊高繁殖性状的分子标记，用于辅助选择育种；上步的T755C位点突变后，造成BMP15蛋白的结构和功能发生改变，显著改变了母羊的 产羔数；上步酶切消化产物大小为140bp时，表示该个体没有高繁殖性能；酶切消化产物大小 为120bp和140bp两条带时，表示该个体具有高繁殖性能。
2.按照权利要求1所述检测绵羊高繁殖性状的方法，其特征在于利用限制性内切酶 Apa I识别T755C位点，此序列为C时能切开，序列为T时不能被切开。
3.按照权利要求1所述检测绵羊高繁殖性状的方法，其特征在于获取的BMP15基因 T755C位点，因不同基因型个体间具有不同的繁殖性状，其不同的基因型可以作为绵羊高繁 殖性状的分子标记。
4.按照权利要求1所述检测绵羊高繁殖性状的方法，其特征在于实验选用的试剂与 药剂均为市售产品。
全文摘要
本发明提供的一种通过BMP15基因高效快速检测绵羊高繁殖性状的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因编码序列中新发现的一个SNP位点，位点位于Genebank序列，从BMP15基因序列的起始密码子ATG开始+755位点，发生T-C突变(简称T755C)；2)合成一对核苷酸序列作为检测T755C位点的引物，其正向引物5′-gaagaccaaacctctccctaagg-3′；反向引物5′-tactttcaggcccatcatgctcc-3′；上下游引物长度均为23bp，将其结合到绵羊BMP15基因相应的模板链上，并扩增到含有E+755位点的核酸序列；3)提取DNA，利用引物扩增PCR，将产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4)利用限制性内切酶ApaI对PCR产物进行消化，酶切消化产物为120bp和140bp两条带时，表示个体具有高繁殖性能。
文档编号C12Q1/68GK102051411SQ201010517378
公开日2011年5月11日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者冯利君, 史洪才, 杨丹, 梁庆玲, 牛志刚, 白杰 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国—澳大利亚绵羊育种研究中心