专利名称：一种显微受精胚胎体外发育激活方法
技术领域：
本发明涉及一种显微受精处理方法，尤其涉及一种显微受精胚胎体外发育激活方法。
背景技术：
哺乳动物卵母细胞恢复第二次减数分裂称之为激活。在卵母细胞被激活的同时， 精子在卵胞质内某些物质的作用下也会被激活，发生精核解聚，雄原核形成和发育以及DNA 合成等变化，最终两性原核融合，发生第一次卵裂进入早期胚胎发育，因此，显微受精后卵子的激活是注射卵能够正常发育下去的最初标志。不同动物的卵子，对这些刺激产生的反应不同，故激活效果也不同。现有技术中， 多采用机械激活，但操作较复杂。有必要提供一种操作容易且激活率高的激活方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种显微受精胚胎体外发育激活方法，其主要包含步骤1)离心精液；2)在离心后的精液中加入D-PBS液，放在38. 5°C,5% CO2、100%湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟；3)将步骤2)处理后的精液注入卵母细胞中；4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活注射后的卵母细胞，得受精卵。所述的方法，步骤1)所述离心的转速为2000r/min。所述的方法，步骤4)具体可以为用5umol/L离子霉素激活处理注射后的卵母细胞5分钟后再用2mmol/L6- 二甲基氨基嘌呤激活处理3个小时，得受精卵。本发明提供的显微受精胚胎体外发育激活方法操作容易且激活率高。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 作详细说明如下。
具体实施例方式实施例1精子的准备取兔(6 8月龄新西兰兔，SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK <沪> 2004-000 精液用D-PBS液(商购)2000r/min离心洗涤三次然后缓慢的加入D-PBS液，放在38. 5°C,5% C02、100%湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。实施例2卵母细胞的准备供体母兔为6-8月龄、体重3kg左右的初产新西兰兔，按Kennelly和R)ote (1965) 的方法，即连续3天每天2次(间隔12h)每次皮下注射FSH50IU/只(宁波第二激素厂生产)，最后一次注射FSH后12h，耳缘静脉注射HCG (宁波第二激素厂生产)100IU/只并与结扎公兔交配，HCG注射后14、16、1 ι进行取卵，在无菌条件下剪下输卵管，吸取IOml的冲卵液，由喇叭口向宫管结合部方向冲卵，每侧用5mL冲卵液，将卵丘卵母细胞复合体放在装有含0. 2%透明质酸酶的D-PBS液的Eppendorf管中，在涡旋混合器上震荡消化5min去除颗粒细胞，在体视显微镜下捡出经酶消化的卵母细胞，用培养液洗涤三次，然后放入38. 5°C、 5% C02、100%湿度下平衡12h以上的培养液微滴中，直到显微注射。实施例3将精子沣射到卵母细胞中注射前，用捡卵针把5-10枚卵母细胞移入操作液滴中，然后用注射针抓取一个精子放入聚乙烯吡咯酮(PVP)液滴中，用针尖在精子尾部迅速划过进行制动，看到尾部打折即可，随后从尾部吸入注射针内。注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为2X2或3X2，激发1至2个脉冲击穿透明带，继续进针同时将精子小心的推至针尖处，直至针尖插入卵母细胞深处，几乎贴近对侧质膜时，调换参数到1X1的档，用Piezo弱脉冲击穿卵母细胞质膜，将精子吐出，回吸注入卵内多余的液体，轻轻退针， 完成一次注射。依次操作，每次注射从开始制动到注射完毕在aiiin内完成，所有显微操作在室温下完成。实施例4沣射后卵母细胞的激活将注射后存活的卵母细胞随机分为三组，第一组用常规的机械刺激；第二组为 5umol/L离子霉素(5min)+2mm0l/L6-DMAP(3h)；第三组为假性注射对照组。各处理组注射后卵母细胞的激活效果，以单精子注射后卵母细胞的激活率、受精率和孤雌发育率进行衡量(卵母细胞至少形成一个原核或发生卵裂计为激活，形成雌雄原核计为受精，在无精子注射的情况下至少形成两个原核或发生卵裂计为孤雌发育)，每组重复3次。受精卵和孤雌活化卵的判定标准注射后6- 检查原核和第二极体形成情况，只有当出现2原核2极体QPN、2PB)时判定为受精；当出现1原核1极体(IPNUPB)、1原核 2极体(1ΡΝ、2ΡΒ)、2原核1极体(2ΡΝ、1ΡΒ)时判定为活化。不同的激活方式对单精子注射兔胚胎体外发育的影响结果见表1，采用SSPS 13. 0中的卡方(χ2)检验对实验结果进行显著性分析，以P < 0. 05为差异显著性判定标准。 从表1中可以看出，机械刺激组与离子霉素+6-DMAP组卵裂率(82. 2%和81. 1% )，桑椹胚率(72. 9%和66.2% )差异不显著(P > 0.05)，但是囊胚率(51. 3%和62.3% )差异显著(P < 0. 05)。离子霉素+6-DMAP组胚胎形态较好，囊胚率较高，可见，激活方式离子霉素 +6-DMAP更适合于兔ICSI卵的激活。表1不同激活方式对ICSI胚体外发育的影响
权利要求
1.一种显微受精胚胎体外发育激活方法，其特征在于，包含步骤1)离心精液；2)在离心后的精液中加入D-PBS液，放在38.55% C02、100%湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟；3)将步骤幻处理后的精液注入卵母细胞中；4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤激活注射后的卵母细胞，得受精卵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述离心的转速为2000r/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为用5umol/L离子霉素激活处理注射后的卵母细胞5分钟后再用2mmol/L6- 二甲基氨基嘌呤激活处理3个小时，得受精卵。
全文摘要
本发明提供一种显微受精胚胎体外发育激活方法，其主要包含步骤1)离心精液；2)在离心后的精液中加入D-PBS液，放在38.5℃、5％CO2、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟；3)将步骤2)处理后的精液注入卵母细胞中；4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤激活注射后的卵母细胞，得受精卵。本发明提供的显微受精胚胎体外发育激活方法操作容易且激活率高。
文档编号C12N5/071GK102453695SQ20101051811
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者陈浩杰 申请人:陈浩杰