专利名称：血流感染的病原菌快速鉴定方法
技术领域：
本发明属于微生物检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及运用高分辨率熔解曲线法对血流感染的细菌快速鉴定。
背景技术：
血流感染是一种严重的感染性疾病，包括败血症和菌血症。发病率高、病死率高， 在美国每年有75万人发病，其中约21. 5万人死亡。是十大死亡原因之一，占所有死亡原因的6%。今年来由于糖尿病、肿瘤病人增多，侵入性操作的广泛使用，激素、化疗、药物的使用选择，及多重耐药菌的流行，血流感染发病率逐年升高，已成为一全球性的问题。传统的血流感染的诊断从标本的采集到病原菌鉴定至少需要三天的时间。甚至需要6-7天才能拿到鉴定及药敏的结果，而延迟诊断和干预往往导致严重的结果，如器官功能障碍和死亡。建立一种血流感染病原菌快速鉴定方法是当前临床迫切需要。近年已经有多种分子诊断技术被应用于细菌的鉴定，比如新近发展起来的DNA芯片检测技术，借助微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测和对外来分子的识别等)；也有种属特异性(16S、16S间隔区等)核酸片段测序。但是测序、芯片技术等均需要昂贵的特殊仪器，价格高昂，不利于推广普及。
发明内容
本发明目的是提供一种鉴定血流感染病原菌方法，以实现对引起血流感染常见致病细菌的快速鉴定。本发明提供了一种血流感染病原菌的鉴定方法扩增血流感染病原菌的16S rRNA 基因的种属保守区，运用高分辨率熔解曲线法鉴定引起血流感染病原菌。与标准菌株的熔解曲线图比较，鉴定细菌至种。所述的扩增可以是采用PCR，根据血流感染病原菌的16S rRNA基因的种属保守区设计引物。所述的血流感染病原菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、 产酸克雷伯杆菌，洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌或者洋葱伯克霍尔德菌。具体而言，该方法包括如下步骤对血培养阳性标本进行涂片、革兰染色；用PCR 的方法扩增16S基因片段；高分辨率熔解曲线分析。其中，革兰染色是对血培养阳性标本的细菌涂片上依次加上龙胆紫液染色、碘溶液、脱色液、沙黄溶液。本发明针对引起血流感染的最常见的16种细菌，阳性球菌四种、阴性杆菌12 种，设计扩增引物。检测阳性球菌时，所述引物为16SAF :ATGTTGGGTTAAGTCCCG和16SAR CCGCCTTCCTCCAGTTT。检测阴性杆菌时，所述引物为 16SBF :CAACGCGAAGAACCTTAC和 16SBR CTCACGACACGAGCTGAC。对第一次分析不能区分的菌株进行第二次分析正向引物为16SAF ATGTTGGGTTAAGTCCCG (SEQ ID NO 1)；反向引物为 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT (SEQ ID NO 2)。该方法可用于测定血液样本的病原菌污染状况。能覆盖到95%以上的阴性杆菌和 90%以上的阳性球菌。可以闭管、一步直接鉴定至种。本发明首先对血培养阳性的培养瓶进行涂片、革兰染色，区分阴性菌与阳性菌，然后针对阴性菌和阳性菌选择扩增16S不同片段，同时高分辨率熔解曲线方法分析。本发明针对血流感染常见的病原菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯杆菌，洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌。本法能够快速、高效的测定血流感染的常见病原菌，为后续的治疗提供有力的依据，争取宝贵的时间。
图1是表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌和金黄色葡萄球菌的熔解曲线图(引物 16SAF,16SAR)。图2是阴性杆菌鉴定的熔解曲线图(引物16SBF，16SBR)。图3是产酸克雷伯杆菌、洋葱伯克霍尔德菌的熔解曲线图(引物16SAF，16SAR)。图4是产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的熔解曲线图(引物16SAF， 16SAR)。图5是粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌的熔解曲线图(引物 16SAF,16SAR)。
具体实施例方式操作方法
1.对血培养阳性标本进行涂片革兰染色①涂片经火焰固定，加龙胆紫液染色10秒钟，水洗，甩干。②加碘溶液染色10秒钟，水洗，甩干。③加脱色液脱色，不时摇动约10 — 20秒，水洗，甩干。④加沙黄溶液复染10秒，水洗。⑤以滤纸吸干或在空气中干后，镜检。 革兰阳性的细菌染成深紫色，革兰阴性细菌染成浅红色。2.用PCR的方法扩增16S基因片段。(1)阳性球菌正向引物为 16SAF :ATGTTGGGTTAAGTCCCG (SEQ ID NO 1)；反向引物为 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT (SEQ ID NO 2) ;16S 基因扩增体系为，去离子水 15. 8 μ 1, IOXbuffer 2. 5 μ l,dNTP 4 μ ，引物各 1 μ LriTaq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1 (TaKaRa), SYT09染料1 μ 1，模板1 μ 1，扩增条件为95°C预变性5分钟，95°C 30秒，55°C 30秒分钟， 72 0C 30秒分钟，共40个循环，最后72°C延伸1分钟。(2)阴性杆菌正向引物为 16SBF :CAACGCGAAGAACCTTAC (SEQ ID NO 3)；反向引物为 16SBR: CTCACGACACGAGCTGAC (SEQ ID NO 4) ;16S 基因扩增体系为，去离子水 15. 8 μ 1, IOXbuffer 2. 5 μ l,dNTP 4 μ ，引物各 1 μ LriTaq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1 (TaKaRa), SYT09染料1 μ 1，模板1 μ 1，扩增条件为95°C预变性5分钟，95°C 30秒，55°C 30秒分钟， 72°C30秒分钟，共40个循环，最后72°C延伸1分钟。对第一次分析不能区分的菌株进行第二次分析正向引物为 16SAF :ATGTTGGGTTAAGTCCCG (SEQ ID NO 1)；反向引物为 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT (SEQ ID NO 2); 16S基因扩增体系为，去离子水 15. 8 μ 1, IOXbuffer 2.5 μ l,dNTP 4 μ ，引物各 1 μ LriTaq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1 (iTaKafci), SYT09 染料 1 μ 1， 模板ι μ 1，扩增条件为95°c预变性5分钟，95°C 30秒，55°C 30秒分钟，72°C 30秒分钟，共 40个循环，最后72°C延伸1分钟。3.高分辨率熔解曲线分析
采用Corbett荧光定量PCR仪检测熔解曲线，条件为预温94°C lmin, 60°C lmin，然后 70°C -85°C每0. 1°C 2秒HRM分析，然后并对结果进行分析。
实施例一阳性球菌的鉴定 涂片革兰染色为阳性球菌； 用16SBF和16SBR引物扩增16S基因片段； 高分辨率熔解曲线分析直接鉴定至种。对20例血培养阳性标本进行测定，其中，7、11、16、18为阳性球菌。高分辨率熔解曲线分析确定为2例金黄色葡萄球菌、1例表皮葡萄球菌和1例粪肠球菌感染。
实施例二阴性杆菌的鉴定 涂片革兰染色阴性杆菌； 用16SAF和16SBF引物扩增16S基因片段。12种细菌常见阴性杆菌可分为6组，第1组为大肠埃希菌，第2组为铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌，第3组为产气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌， 第4组为产酸克雷伯杆菌、洋葱伯克霍尔德菌，第5组为洛菲不动杆菌，第6组为鲍曼不动杆菌。对30例血培养阳性标本进行测定，与后续传统方法获得的结果完全一致。证实本发明血流感染的病原菌快速鉴定，从血培养报阳性，PCR扩增，高分辨率熔解曲线分析仅需 3小时的时间，可大大缩短疾病的诊断时间，为血流感染疾病患者的救治赢得宝贵时间。
权利要求
1.一种血流感染病原菌的鉴定方法，其特征在于，扩增血流感染病原菌的16S rRNA基因的种属保守区，运用高分辨率熔解曲线法鉴定引起血流感染病原菌。
2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述的扩增是采用PCR，根据血流感染病原菌的16S rRNA基因的种属保守区设计引物。
3.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述的血流感染病原菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、 铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯杆菌，洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌或者洋葱伯克霍尔德菌。
4.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 对血培养阳性标本进行涂片染色；用PCR的方法扩增16S基因片段； 高分辨率熔解曲线分析。
5.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中染色是对血培养阳性标本的细菌涂片上加上龙胆紫液染色、碘溶液、脱色液、沙黄溶液。
6.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为16SAF ATGTTGGGTTAAGTCCCG和16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT ；所述的血流感染病原菌是阳性球菌。
7.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为16SBF CAACGCGAAGAACCTTAC 和 16SBR CTCACGACACGAGCTGAC ； 16SAF ATGTTGGGTTAAGTCCCG 禾口 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT ；所述的血流感染病原菌是阴性杆菌。
全文摘要
本发明属于微生物检验领域，涉及运用高分辨率熔解曲线法对血流感染的细菌快速鉴定。本发明首先对血培养阳性的培养瓶进行涂片、革兰染色，区分阴性菌与阳性菌，然后针对阴性菌和阳性菌选择扩增16S不同片段，同时高分辨率熔解曲线方法分析。本发明针对血流感染常见的病原菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯杆菌，洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌。本法能够快速、高效、准确的测定血流感染的常见病原菌，为后续的治疗提供有力的依据，争取宝贵的时间。
文档编号C12Q1/04GK102453752SQ20101051994
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者李刚, 杜欣, 王艳艳, 蒋晓飞, 陈楠, 魏取好 申请人:复旦大学附属华山医院, 复旦大学附属金山医院