专利名称：一种快速共价闭合环状dna纯化试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒。
背景技术：
质粒DNA是分子生物学研究几乎每天都要用到质粒DNA，也需要经常纯化质粒 DNA，此外在基因治疗和基因疫苗领域，随着越来越多的基因治疗药物和基因疫苗进入临床 试验和产业化阶段，对质粒DNA的需求量也越来越大。由于临床用质粒DNA的质量标准跟 分子生物学研究用质粒DNA的要求不同，小规模实验室纯化与工业级大规模纯化工艺也有 所差异，因此一个好的质粒DNA纯化技术必须满足各个领域的不同需求。目前能达到此要 求的只有基于碱裂解质粒DNA纯化方法，另一个方法煮沸法的使用主要集中在于分子生物 学研究领域。一、碱裂解法质粒DNA (共价闭合环状DNA)纯化技术碱裂解法是1979年由Birnboim & Doly发明，它的质粒粗提部分由四步操作组 成第一步，细菌重悬。重悬液成份是25mM Tris-Cl(pH 8. 0)、50mM葡萄糖和10mM EDTA。 其中Tris-Cl用于缓冲pH以稳定DNA结构；葡萄糖用于保持渗透压和缓冲pH，防止基因组 DNA过度断裂；EDTA用于鰲合二价金属离子，使细胞更易破碎，也使DNase失活，有利于保 持质粒DNA的完整性。第二步，碱裂解。碱裂解液的成分是SDS和0. 2M NaOH。SDS和 NaOH的第一个作用是使细胞裂解释放菌体内容物。NaOH的第二个作用是使体系的pH保持 在12. 0-12. 5之间，在此pH范围内，基因组DNA不可逆变性而质粒DNA由于有特有的拓扑 超螺旋结构，只发生可逆变性，可以在下一步中和过程中自然复性；SDS的第二个作用是溶 解蛋白质(平均两个氨基酸上结合一个SDS分子)和脂肪。第三步，中和。中和液的成份 是3M醋酸钾/2M醋酸。它一方面中和NaOH，使质粒DNA复性而基因组DNA仍然保持单链状 态；另一方面提高体系中的盐浓度，使蛋白质、基因组DNA和RNA发生盐析沉淀；此外加入 的钾与SDS反应生成不溶的十二烷基硫酸钾(PDS)，PDS还与蛋白质和基因组DNA共沉淀。 所以中和反应后，大部分蛋白质、基因组DNA和RNA都以不溶物状态存在，而大部分的质粒 DNA由于分子量较小，不形成任何沉淀，而是以溶液状态存在。第四步，离心。离心过程使第 三步形成的所有不溶物沉淀到管底，上清为质粒DNA粗提液，可以直接用于各种质粒精提 方法进行进一步的纯化处理。碱裂解法的最大优点是技术成熟，可以处理从lmL到500mL或更多的样品，既适合 于小规模的科研使用，又能用于工业级大规模生产临床用的质粒DNA，并且适用于大肠杆菌 的所有菌株。其主要缺点是操作难以控制，主要原因是使基因组DNA发生不可逆变性而环状质 粒DNA发生可逆变性的pH范围十分狭小，在12-12.5之间。如果pH低于12. 0则基因组 DNA将不能充分变性，就会污染质粒DNA ；如果pH高于12. 5，则质粒DNA发生不可逆变性， 降低质粒DNA产量。为了将pH维持在此范围，加入碱裂解液后必须迅速充分混勻，但是在 碱裂解释放出细菌的基因组DNA后，裂解液变得十分粘稠，只有剧烈搅拌才能充分混勻，而
4剧烈搅拌又会使质粒DNA断裂成为线性DNA，跟基因组DNA —样发生不可逆变性而丢失，降 低产量；剧烈搅拌还会使大的基因组DNA断裂成小片段，难以形成沉淀，最后污染质粒DNA。 所以碱裂解法纯化质粒DNA的操作十分难以优化，对工业级大规模(10升以上)处理更是 如此。碱裂解法的另一缺点是大规模处理时不容易去除RNA污染。研究用小规模质粒 DNA纯化时可以使用动物源性的RNase，但是在工业级大规模(10升以上规模)纯化临床用 质粒DNA时，大规模使用动物源性的RNase不现实，因为不但价格十分昂贵，而且还容易引 入动物的病毒和其他病原(如疯牛病病毒)，增加很多的质量检测方面的麻烦，使成本急剧 上升。目前一般采取非酶的办法去除RNA，但还是需要增加了很多操作步骤，增加了成本。碱裂解法的第三个缺点是步骤多，质粒DNA损失多，最终回收率只有50-70%左 右o二、煮沸法质粒DNA纯化技术本方法最早由Holmes和Quigley在1981年报道，其过程是先将细菌悬浮于含有 TritonX-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100°C使其裂解。加热除了 破坏细胞外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。由于环状 质粒DNA有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋 分子。离心除去变性的染色体DNA和蛋白质沉淀，就可得到含有质粒DNA的上清液。煮沸 裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于从lmL-250mL菌液中纯化质粒DNA，并且对大 多数的大肠杆菌菌株都适用。其缺点是(1)不适用于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化 合物的大肠杆菌菌株。大肠杆菌菌株HB101及其衍生菌株(其中包括TG1)能产生大量的 碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。(2)对于表达DNase的大肠杆菌菌株，也不推荐使用煮 沸法纯化质粒DNA。因为在煮沸过程中，DNase不会完全失活，而在后面的操作步骤中难免 有Mg2+存在(如限制性内切核酸酶的酶切过程)，质粒DNA会降解。(3)大规模提取时，细 菌裂解液太黏稠，难以处理，培养细菌时必须在培养基中加入氯霉素。目前本方法主要是分 子生物学研究领域使用，很少用于工业级大规模质粒DNA纯化。三、Eppendorf 一步法质粒DNA纯化技术最近德国Eppendorf公司发明了一种基于溶菌酶裂解细菌的一步法质粒DNA纯 化技术，它是一种快速、非有机的从细菌中提取高质量质粒DNA专利技术，其详细的技术资 料(包括专利申请)现在还没公开发表。但根据其公开发表的宣传资料，该方法使用含有 溶菌酶和去污剂的单一的裂解液裂解细胞，裂解产物澄清无粘性，使操作非常容易。裂解之 后DNA直接结合到过滤膜上。通过快速离心的清洗和洗脱得到超螺旋的质粒DNA。其优点 是操作步骤简单、需要的溶液数量很少，所用的时间不到碱裂解的一半，但质粒DNA的质量 高，能用于下游试验如测序、酶切和克隆。该方法的缺点是不适用于所有菌株。该方法与本发明一步式质粒DNA纯化技术相比，操作过程十分相似，最大的不同 是Eppendorf方法需要使用动物源性的溶菌酶裂解细菌，需要使用动物源性的RNase去 除RNA，由于上述的价格和可能引入病原等因素，这种方法显然难以用到工业级大规模质粒 DNA纯化上去。其次，Eppendorf方法使用的是基于溶菌酶的温和裂解方法，裂解细菌效果 肯定不如本发明使用的含异硫氰酸胍和SDS的化学裂解液，质粒DNA回收率也不会很高。此外温和裂解液对DNase的抑制很弱，不能有效防止其对质粒DNA的破坏，不适于EndA野生 型菌株。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述技术不足，提供了一种使用的非碱性裂解液就是在 上述配方的基础上增加了六氨合高钴和精胺两种成份，采用改良的非碱裂解液裂解细菌、 通过多胺选择性地使线状的基因组DNA和RNA发生高度浓缩而丧失与硅胶膜结合的能力， 而环状质粒DNA不发生浓缩，仍然能够与硅胶膜结合，经过洗涤和洗脱就可以达到一步纯 化质粒DNA的目的一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒。本发明的目的是由以下技术方案实现的一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，其特征在于它是由下述步骤和方法完 成的，具体步骤方法如下，共价闭合环状DNA纯化技术步骤如下第一步细菌沉淀，由于细菌体积在10-50L，主要用过滤法收集细菌沉淀，去掉液 体培养基，得到菌体；第二步非碱裂解，用非碱裂解液裂解细菌，其间需要使用大型搅拌器进行充分搅 拌，使细菌裂解，同时多胺使基因组DNA和RNA发生高度浓缩而失去与硅胶膜结合的能力， 我们对非碱裂解液配方进行了优化，增加了精胺和六氨合高钴两种成份；第三步硅胶膜结合环状DNA，使用上步所得裂解液直接上柱，裂解液直接用硅胶 吸附法进行质粒DNA纯化，除质粒DNA外，蛋白质和呈紧密团状的基因组DNA和RNA都将不 能与硅胶膜结合而进入穿透液；第四步洗柱，洗去硅胶膜上残留的蛋白质、部分RNA和小分子杂质，用常规的洗 柱液洗柱，为尽量去除杂质，可能需要多次重复此步骤；第五步洗脱，用低盐溶液将质粒DNA从硅胶膜上洗脱下来待用；用低盐的溶液 “如TE或超纯水”将硅胶膜结合的质粒DNA洗脱，共价闭合环状DNA纯化技术方法如下1)细菌沉淀，菌体收集用塑料离心管收集不超过3mL过夜培养饱和菌液，室温 12000-15000g离心半分钟，弃上清；2)非碱裂解，裂解菌体加入0. 6-lmL裂解液“用前需摇勻”，充分吹打或振荡裂解 细菌直到裂解变澄清，通常需要半分钟；菌液离心后加入六氨合高钴和精胺，六氨合高钴的 终浓度为25mM，精胺的终浓度为75mM ；3)硅胶膜结合环状DNA，结合DNA 将裂解液全部转移到离心吸附柱中，室温静置 2分钟使质粒DNA与膜结合，室温12000-15000g离心半分钟，弃穿透液，如果一次不能将上 清全部转移到离心吸附柱中，分两次进行；4)洗柱，预洗在离心吸附柱中加入0. 7mL的预洗液，室温12000_15000g离心半
分钟，弃穿透液，如果预洗液放置在低温产生了沉淀，用前需要加热到60°C使之融化，混勻 后再用；5)洗脱，再预洗再在离心吸附柱中加入0. 3mL的预洗液，室温12000_15000g离 心半分钟，弃穿透液，此步预洗最好别省略，否则DNA纯度不高；
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清洗在离心吸附柱中加入0. 7mL的洗柱液，室温12000_15000g离心半分钟，弃穿 透液；再清洗再在离心吸附柱中加入0. 3mL的洗柱液，室温12000-15000g离心半分钟， 弃穿透液，室温12000-15000g离心半分钟，甩干残留液体；洗脱将离心柱置于一个新的1. 5mL自备塑料离心管中，加入30_100uL DNA洗脱 液，室温放置2分钟，如果将DNA洗脱液预热到65-80°C，既得本发明一种快速共价闭合环状 DNA纯化试剂盒；所述的裂解液为10% SDS+2M NaCl+lOmM 精胺；预洗液为2M NaCl ；洗柱液为50%乙醇；洗脱液为水；多胺为精胺六氨合高钴=3 1本发明技术使用的非碱性裂解液就是在上述配方的基础上增加多胺和Triton X-114两种成份而得，但是经过多胺浓缩后，线状DNA和RNA形成非常紧密的结构，完全丧失 与硅胶膜结合的能力，而环状的质粒DNA仍然保持比较松散的构型，仍然能够与硅胶膜结 合，所以通过硅胶膜对质粒DNA的差异吸附就可以从含有基因组DNA、RNA和质粒DNA的混 合液中清除其中的基因组DNA和RNA，达到质粒DNA纯化的目的。本发明的有益效果本发明用一步式质粒DNA纯化工艺代替两步式质粒DNA纯化工艺，可以直接使用 单菌落进行质粒DNA纯化，不需要过夜培养细菌，完全省略了质粒粗提步骤，本发明发现到 一定比例的六氨合高钴/精胺在异硫氰酸胍存在的条件下，完全可以选择性地诱导线状 DNA和RNA的浓缩，而环状DNA仍然呈松弛构型，说明该过程不受异硫氰酸胍的影响，在此发 现的基础上，我们对非碱裂解液配方进行了优化，增加了精胺和六氨合高钴两种成份，跟经 典的碱裂解液相比，改良的、含多胺的非碱裂解液有下列优点(1)多胺使基因组DNA发生了高度浓缩，极大地降低了裂解液的粘稠度，使裂解液 不再粘稠，便于后续进行各种处操作。(2)多胺使基因组DNA和RNA发生了高度浓缩，不再与硅胶膜结合，去除基因组合 DNA和RNA十分容易。(3)不再需要碱变性和跟碱变性密切相关的重悬、中和和离心三个步骤，节约了 2/3的操作时间。(4) RNA浓缩后去除，不再需要RNase处理，极大地降低了大规模纯化质粒DNA的成 本。(5)省略了碱变性处理，使DNA避免了碱损伤，质粒DNA质量更高。本发明一步式质粒DNA纯化工艺跟传统的两步法工艺相比，具有下列优点(1)更加快捷，使整个质粒DNA纯化操作时间缩短了 2/3，节约人力和物力，尤其适 合于高通量质粒DNA纯化和工业级大规模质粒DNA纯化。(2)步骤少，所以质粒DNA损失也减少，回收率提高，因此可以用单个菌落直接进 行微量质粒DNA的纯化，免去了过夜细菌培养步骤。(3)非碱裂解，避免了质粒DNA的碱损伤，超螺旋构型的比例更大，质量提高。
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(4)不需要使用动物源性的RNase，减少了由此污染其他病源的可能，同时还极大 地降低了成本(尤其在工业级大规模纯化质粒DNA时，大量使用RNase将十分昂贵)。(5)对操作剧烈程度不敏感，适合于从微量(单菌落)到工业级(10升以上)的各 种规模的质粒DNA存在，操作过程不需要做重大的改动。(6)普适性广，不依赖于大肠杆菌的种类。(7)裂解液不粘稠，不容易堵塞后续纯化时使用的层析柱。
图1是本发明的多胺浓缩DNA原理结构示意图；图2是本发明的DNA-硅胶膜结合原理结构示意图；图3是本发明的从一个含PUC19质粒的菌落提取质粒DNA，得到的DNA —半用于电 泳(样品A)，另一半用EcoRI限制性内切酶线性化后再琼脂糖电泳(样品B)示意图；图4是本发明的用本方法从1. 5mL含pUC19质粒的过夜培养的细菌样品中提取质 粒DNA，DNA最后用200uL洗脱液洗脱，取20uL用于琼脂糖电泳，前面的DNA为超螺旋构型， 后面的为开环构型示意图；图5是本发明用本产品从100mL饱和菌液中提取pUC19质粒DNA，最后用2mL洗脱 液洗脱DNA，取20uL上样进行琼脂糖电泳，前面的DNA为超螺旋构型，后面的为开环构型示 意具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述实施例1 一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，其特征在于它是由下述步骤 和方法完成的，具体步骤方法如下，共价闭合环状DNA纯化技术步骤如下第一步细菌沉淀，由于细菌体积在10-50L，主要用过滤法收集细菌沉淀，去掉液 体培养基，得到菌体；第二步非碱裂解，用非碱裂解液裂解细菌，其间需要使用大型搅拌器进行充分搅 拌，使细菌裂解，同时多胺使基因组DNA和RNA发生高度浓缩而失去与硅胶膜结合的能力， 我们对非碱裂解液配方进行了优化，增加了精胺和六氨合高钴两种成份；第三步硅胶膜结合环状DNA，使用上步所得裂解液直接上柱，裂解液直接用硅胶 吸附法进行质粒DNA纯化，除质粒DNA外，蛋白质和呈紧密团状的基因组DNA和RNA都将不 能与硅胶膜结合而进入穿透液；第四步洗柱，洗去硅胶膜上残留的蛋白质、部分RNA和小分子杂质，用常规的洗 柱液洗柱，为尽量去除杂质，可能需要多次重复此步骤；第五步洗脱，用低盐溶液将质粒DNA从硅胶膜上洗脱下来待用；用低盐的溶液 “如TE或超纯水”将硅胶膜结合的质粒DNA洗脱，共价闭合环状DNA纯化技术方法如下1)细菌沉淀，菌体收集用塑料离心管收集不超过3mL过夜培养饱和菌液，室温 12000-15000g离心半分钟，弃上清；2)非碱裂解，裂解菌体加入0. 6-lmL裂解液“用前需摇勻”，充分吹打或振荡裂解 细菌直到裂解变澄清，通常需要半分钟；菌液离心后加入六氨合高钴和精胺，六氨合高钴的终浓度为25mM，精胺的终浓度为75mM ；3)硅胶膜结合环状DNA，结合DNA 将裂解液全部转移到离心吸附柱中，室温静置 2分钟使质粒DNA与膜结合，室温12000-15000g离心半分钟，弃穿透液，如果一次不能将上 清全部转移到离心吸附柱中，分两次进行；4)洗柱，预洗在离心吸附柱中加入0. 7mL的预洗液，室温12000_15000g离心半
分钟，弃穿透液，如果预洗液放置在低温产生了沉淀，用前需要加热到60°C使之融化，混勻 后再用；5)洗脱，再预洗再在离心吸附柱中加入0. 3mL的预洗液，室温12000_15000g离 心半分钟，弃穿透液，此步预洗最好别省略，否则DNA纯度不高；清洗在离心吸附柱中加入0. 7mL的洗柱液，室温12000_15000g离心半分钟，弃穿 透液；再清洗再在离心吸附柱中加入0. 3mL的洗柱液，室温12000_15000g离心半分钟， 弃穿透液，室温12000-15000g离心半分钟，甩干残留液体；洗脱将离心柱置于一个新的1. 5mL自备塑料离心管中，加入30_100uL DNA洗脱 液，室温放置2分钟，如果将DNA洗脱液预热到65-80°C，既得本发明一种快速共价闭合环状 DNA纯化试剂盒；所述的裂解液为10% SDS+2M NaCl+lOmM 精胺；预洗液为2M NaCl ；洗柱液为50%乙醇；洗脱液为水；多胺为精胺六氨合高钴=3 11)质粒DNA提取质粒DNA纯化是进行分子生物学研究、生产基因治疗药物和生产基因疫苗等必不 可少的技术。质粒DNA只占宿主细菌总重量的以下，所以质粒纯化的本质就是去除占总 重量99%的杂质，包括基因组DNA、RNA、蛋白质、内毒素等。由于基因组DNA与质粒DNA同 质性太强(都是双链DNA，只是构型不同)，最难去除，如何有效去除基因组DNA的污染一直 是质粒DNA纯化的难点和关键，目前通用的碱裂解法和其他方法都就是利用两者构型差异 而将其分离，达到纯化质粒DNA的目的。本发明一步式质粒DNA纯化技术也是利用基因组DNA与质粒DNA的构型差异，但 使用的方法未见报道，属于原创性技术。其过程是用改良的非碱裂解液裂解细菌、通过多胺 选择性地使线状的基因组DNA和RNA发生高度浓缩而丧失与硅胶膜结合的能力，而环状质 粒DNA不发生浓缩，仍然能够与硅胶膜结合，经过洗涤和洗脱就可以达到一步纯化质粒DNA 的目的。上述纯化整个过程在分子水平上实际上是由三个独立的反应组成，分别是非碱性 细菌裂解、多胺浓缩线状DNA和RNA和硅胶膜-DNA结合，它们所起的作用可以用细胞内各 种分子的变化概括如下
权利要求
一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，其特征在于它是由下述步骤和方法完成的，具体步骤方法如下，共价闭合环状DNA纯化技术步骤如下第一步细菌沉淀，由于细菌体积在10 50L，主要用过滤法收集细菌沉淀，去掉液体培养基，得到菌体；第二步非碱裂解，用非碱裂解液裂解细菌，其间需要使用大型搅拌器进行充分搅拌，使细菌裂解，同时多胺使基因组DNA和RNA发生高度浓缩而失去与硅胶膜结合的能力，我们对非碱裂解液配方进行了优化，增加了精胺和六氨合高钴两种成份；第三步硅胶膜结合环状DNA，使用上步所得裂解液直接上柱，裂解液直接用硅胶吸附法进行质粒DNA纯化，除质粒DNA外，蛋白质和呈紧密团状的基因组DNA和RNA都将不能与硅胶膜结合而进入穿透液；第四步洗柱，洗去硅胶膜上残留的蛋白质、部分RNA和小分子杂质，用常规的洗柱液洗柱，为尽量去除杂质，可能需要多次重复此步骤；第五步洗脱，用低盐溶液将质粒DNA从硅胶膜上洗脱下来待用；用低盐的溶液“如TE或超纯水”将硅胶膜结合的质粒DNA洗脱，共价闭合环状DNA纯化技术方法如下1)细菌沉淀，菌体收集用塑料离心管收集不超过3mL过夜培养饱和菌液，室温12000 15000g离心半分钟，弃上清；2)非碱裂解，裂解菌体加入0.6 1mL裂解液“用前需摇匀”，充分吹打或振荡裂解细菌直到裂解变澄清，通常需要半分钟；菌液离心后加入六氨合高钴和精胺，六氨合高钴的终浓度为25mM，精胺的终浓度为75mM；3)硅胶膜结合环状DNA，结合DNA将裂解液全部转移到离心吸附柱中，室温静置2分钟使质粒DNA与膜结合，室温12000 15000g离心半分钟，弃穿透液，如果一次不能将上清全部转移到离心吸附柱中，分两次进行；4)洗柱，预洗在离心吸附柱中加入0.7mL的预洗液，室温12000 15000g离心半分钟，弃穿透液，如果预洗液放置在低温产生了沉淀，用前需要加热到60℃使之融化，混匀后再用；5)洗脱，再预洗再在离心吸附柱中加入0.3mL的预洗液，室温12000 15000g离心半分钟，弃穿透液，此步预洗最好别省略，否则DNA纯度不高；清洗在离心吸附柱中加入0.7mL的洗柱液，室温12000 15000g离心半分钟，弃穿透液；再清洗再在离心吸附柱中加入0.3mL的洗柱液，室温12000 15000g离心半分钟，弃穿透液，室温12000 15000g离心半分钟，甩干残留液体；洗脱将离心柱置于一个新的1.5mL自备塑料离心管中，加入30 100uL DNA洗脱液，室温放置2分钟，如果将DNA洗脱液预热到65 80℃，既得本发明一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒。
2.根据权利要求书1所述的一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，其特征在于所述的裂解液为 10% SDS+2M NaCl+lOmM 精胺；预洗液为2M NaCl ； 洗柱液为50%乙醇； 洗脱液为水 ，多胺为精胺六氨合高钴=3 1。
全文摘要
本发明涉及一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，是由以下方法完成，包括细菌沉淀、非碱裂解、硅胶膜结合环状DNA、洗柱、洗脱，是在上述方法的基础上增加了六氨合高钴和精胺成份，采用改良的非碱裂解液裂解细菌、通过多胺选择性地使线状的基因组DNA和RNA发生高度浓缩而丧失与硅胶膜结合的能力，仍然能够与硅胶膜结合，经过洗涤和洗脱就可以达到快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，本发明DNA纯化技术代替了两步式DNA纯化技术，完全省略了质粒粗提步骤，不依赖于大肠杆菌的种类对操作剧烈程度不敏感，步骤少，缩短质粒DNA纯化操作时间，节约人力、物力，适合于高通量质粒DNA纯化和工业级大规模质粒DNA纯化技术使用。
文档编号C12N15/10GK101979541SQ20101052188
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者徐堤 申请人:徐堤