专利名称：一种制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种毒性检测检测试剂，具体为一种制备水源水水质急性生物毒性检测试剂及其检测方法。属于水源水水质检测技术领域。
背景技术：
水是生命之源。随着科学技术的进步、工农业生产的发展，作为工农业废物汇集点的水体环境，受到的污染越来越严重。由于管理不善、资源匮乏、环境变化及基础设施投入不足等原因，全球约有五分之一的人无法获得安全的饮用水。如何为人类提供安全、清洁的饮用水和生活用水，是世界各国面临的急迫问题，为了保护饮用水源和健康的水生生态系统，通常采用化学方法和生物方法对水源水水质进行监测和评价。化学方法评价水质是采用各种仪器直接分析测定水体中有害物质的种类及其浓度以及与之有关的参数(如色度、COD、BOD等)，以所测数据为依据制定出污染物浓度的控制标准。生物方法是基于生物、生态和毒理学原理进行水质评价。如生物评价基准 (Biocriteria)就是利用敏感生物来测试化学污染物的生物毒性。化学方法监测和评价水质时指标体系完善、依据充分、消减目标明确，能准确测定有害物质的种类，对大多数污染物能精确测定它们的浓度或含量，因此是普遍采用的方法。 但是，化学监测方法存在不足，其很难从不同污染物的浓度分析数据来预测废水的真正毒性，化学分析的数据不能从整体上反映水质的优劣，或反映污染物对生物和生态系统的影响。监测和综合评价水质的生物毒性实验有慢性毒性实验和急性毒性实验。生物慢性毒性实验在水生生物从出生到繁殖整个生活周期内观察毒物对其生理活动的影响。实验持续时间从几周至数年之久。生物急性毒性实验是在短时间内观察生物对毒物的刺激产生明显反应的实验。生物急性毒性的指示生物有鱼、藻类、底栖软体动物、浮游生物和微生物等。 发光细菌因其独特的生理特性、易与现代光电检测手段相匹配进行快速测试。由于发光细菌相比于其他生物种类更快速、经济、节省空间和可靠性好等优点而备受关注，因此发展了利用发光细菌进行水质毒性监测和综合评价的生物毒性测试方法。目前，发光细菌毒性检测法已被广泛用于水质的污染及生物毒性判断，以其简便易行、检测成本低廉等优点而受到关注，可参见水质急性毒性的测定——发光细菌法，GB/ T15441-1995 ；但若用海洋发光菌检测，则需在样品中添加氯化钠达到3%的终浓度，如此高浓度的氯化钠添加之后有可能改变样品的理化特性，影响测试的正确性。但尚未见有用于水源水的快速安全检测。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法。采用青海弧菌Q67培养基制成新鲜菌液或采用青海弧菌冻干粉制成测试用菌液，以克服现有技术的不足。本发明的另一个目的旨在提供基于这种检测试剂的检测方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。一种制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，具体步骤如下1)采用新鲜菌液将青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15-25°C 培养12h-18h，此时细菌发光明亮；幻用IOml 0.85%生理盐水将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇勻，用少量生理盐水调整菌液浓度；3)取0. Iml调整后的菌液，加入置有^iil 0. 85%生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，选用发光强度在200-500万光子/秒的菌液作为新鲜菌液的检测试剂。步骤2)中，生理盐水调整菌液浓度为OD66tl为0. 2 0. 5。步骤1)中，还可以通过冻干粉剂制备，在青海弧菌Q67冻干粉剂中加入5mL复苏液，充分混合，室温下下放置8-15分钟，使细菌恢复发光。所述的青海弧菌Q67冻干粉剂由市场购买，保存于-20°C冰箱之中，使用前打开， 用适量复苏液使之溶解。所述的复苏液是摩尔浓度为0. 05-0. 2M, pH值为6. 0-9. 0的磷酸缓冲液，或质量-体积百分比浓度为0. 5-8. 0%的葡萄糖液。上述检测试剂的检测方法，其具体步骤如下1)取待检水源水，加入NaCl至终浓度为0. 8 %作为饮用水样品液；采用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0. 8%作为对照样品液；2)对样品的发光检测取六个测试小杯，其中三个测试小杯分别加入2ml水源水样品液作为一组样品平行样，另三个测试小杯分别放入2ml对照样品液也作为一组对照平行样；在每组平行样中的三个测试小杯中每隔1 依次加入0. Iml新鲜菌液或0. 05ml冻干粉剂菌液，分别放置15min后，这样每组平行样之间隔1 就采用发光检测仪测定各测试小杯内样品的发光强度，然后计算相对发光强度。水源水的相对发光强度为80% 120%安全，> 120%可疑，< 80%不安全。本发明同现有技术相比，利用发光细菌对外界毒物有灵敏反应的特点，采用我国独有的一种淡水发光细菌——青海弧菌作为检测用菌种，采用我国独有的一种淡水发光细菌青海弧菌Q67菌株对各类毒物均有灵敏的反应，且所用的青海弧菌是淡水型发光菌，无需氯化钠就可生长和发光，因此测试样品中无需添加高浓度氯化钠，不会改变样品的理化特性，保证测试的正确性，用于水源水的安全检测，检测速度快可在0.5小时内可以得出结果，判断水质是否安全。
具体实施例方式本发明中采用我国特有的淡水发光细菌-青海弧菌Q67菌株Vibrio qinghaiensis Q67，是对存在于被测样品中所有毒物的综合毒性的反映，即使从未出现过的新的化学合成物，只要对生物体有毒，会对发光细菌发生影响，而灵敏地从发光细菌的发光强弱上反映出来，现代光子检测技术非常灵敏，极微弱的光强度发生了变化也可检测出来，所以用发光细菌的发光检测对毒物的反应极其灵敏，要比一般生物细胞反应灵敏几个数量级。发光检测用仪器采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型水质毒性分析仪为测试用仪器。本发明中采用的青海弧菌Q67菌株Vibrio qinghaiensis Q67，是由朱文杰，汪杰， 陈晓耘等发现的一种发光细菌的新种，发表于文献海洋与湖沼，25 C3) :273-278，这种青海弧菌Q67培养基成分如下MgSO4 2. 47g、MgCO3 0. 79g、MgBr2 0. 09g、MgCl2 0. 109g、CaCO3 0. 103g、KCl 0. 122g、NaCl 8. 29g、Mg (HCO3) 20. 50g、酵母膏 5g、胰胨 5g、甘油 3g、琼脂 20g，溶于 IOOOmL 蒸馏水中，将它制成斜面，于121°C灭菌20min，贮于4°C冰箱备用。发光菌冻干粉剂，采用由上述菌种制作成的冻干粉剂，这种冻干粉剂的专利号 97106203. X，可以由市场购买，保存于-20°C冰箱之中，使用前打开，用适量复苏液使之溶解，10分钟左右，恢复发光活力，就可以用于检测，这种复苏液参考华东师范大学学报(自然科学版，2008，4，58-65发表的《青海湖发光细菌的分离鉴定及电镜观察》文章。发光检测数据的计算采用如下公式
权利要求
1.一种制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，其特征在于具体步骤如下1)采用新鲜菌液将青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15-25°c培养 12h-18h，此时细菌发光明亮；2)用IOml0.85%生理盐水将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇勻，用少量生理盐水调整菌液浓度；3)取0.Iml调整后的菌液，加入置有aiil 0. 85%生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，选用发光强度在200-500万光子/秒的菌液作为检测试剂。
2.根据权利要求1所述的制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，其特征在于步骤2)中，用生理盐水调整菌液浓度为OD66tl为0. 2 0. 5。
3.根据权利要求1所述的制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，其特征在于步骤1)中，通过冻干粉剂制备时，在青海弧菌Q67冻干粉剂中加入5mL复苏液，充分混合，室温下下放置8-15分钟，使细菌恢复发光。
4.根据权利要求3所述的制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，其特征在于所述的青海弧菌Q67冻干粉剂由市场购买，保存于-20°C冰箱之中，使用前打开，用适量复苏液使之溶解。
5.根据权利要求4所述的制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，其特征在于所述的复苏液是摩尔浓度为0. 05-0. 2M, pH值为6. 0-9. 0的磷酸缓冲液，或质量-体积百分比浓度为0. 5-8. 0%的葡萄糖液。
6.权利要求1制备的检测试剂的检测方法，其特征在于具体步骤如下1)取待检水源水，加入NaCl至终浓度为0.8%作为饮用水样品液；采用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0. 8%作为对照样品液；2)对样品的发光检测取六个测试小杯，其中三个测试小杯分别加入2ml水源水样品液作为一组样品平行样，另三个测试小杯分别放入2ml对照样品液也作为一组对照平行样；在每组平行样中的三个测试小杯中每隔1 依次加入0. Iml新鲜菌液或0. 05ml冻干粉剂菌液，分别放置15min后，这样每组平行样之间隔1 就采用发光检测仪测定各测试小杯内样品的发光强度，然后计算相对发光强度。
全文摘要
本发明公开了一种制备水源水水质急性生物毒性检测试剂的方法，具体步骤如下1)将青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15-25℃培养12h-18h，此时细菌发光明亮；2)用10ml0.85％生理盐水将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇匀，用少量生理盐水调整菌液浓度；3)取0.1ml调整后的菌液，加入置有2ml 0.85％生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，选用发光强度在200-500万光子/秒的菌液作为新鲜菌液的检测试剂。同现有技术相比，无需氯化钠就可生长和发光，因此测试样品中无需添加高浓度氯化钠，不会改变样品的理化特性，保证测试的正确性，用于水源水的安全检测。
文档编号C12Q1/02GK102453743SQ20101052321
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者徐亚同, 朱文杰, 杨洁, 谢冰 申请人:华东师范大学