制备碳水化合物酯的方法

专利名称：制备碳水化合物酯的方法
技术领域：
本发明涉及通过利用脂质酰基转移酶对脂质进行生物转化以制备碳水化合物酯 和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯(hydroxy acid ester)的方法。
本发明还涉及脂质酰基转移酶在对脂质进行生物转化使其成为以下一或多种物 质中的用途碳水化合物酯和/或蛋白质和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯。
本发明还涉及本文固定化的脂质酰基转移酶的用途，该固定化的脂质酰基转移 酶可用于在高水分环境中对脂质进行生物转化以制备一或多种碳水化合物酯和/或蛋白 质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯。
本发明还涉及固定化的脂质酰基转移酶.背景技术
脂酶已经广泛用于脂质的生物转化以制备高价值产品，例如糖酯，以便用 于广泛的工业中，包括食品和/或饲料工业，化妆品和/或皮肤护理工业，油化学 (oleochemical)工业和制药工业。
当生物转化过程需要脂质底物水解时，脂解酶可用于高水分环境中。然而，当 生物转化过程需要酯交换反应或酯基转移反应诸如通过醇解，由于不需要的水解反应利 用酯酶高水分环境可以是有害的，所述不需要的水解反应可导致不需要的生物产物和/ 或使得生物转化产物的产量较低。
通常，需要酯交换作用和/或酯基转移作用的生物转化过程利用非-水环境中的 酯酶，所述非-水环境诸如油系统和/或有机溶剂系统诸如丁醇，甲醇或己烷。这样的 系统提供这样的环境，其中极性受体分子和脂质供体分子可以至少部分溶解，且所述酯 酶具有足够的酶活性。尽管少量水是任何酶活性所需的，水的量严格保持在较低水平以 避免该酶的水解活性。
通常，糖酯，蛋白质酯，羟基酸酯已经通过化学合成利用无机催化物产生。常 规生物转化法制备糖酯或羟基酸酯利用有机溶剂环境或仅存在少量水的超临界液体中的酯酶。
Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No.8 (August)，pp869-874 公开了 对多种脂酶的研究，以及它们在含水介质中的活性，所述研究根据分别来自甲醇和丁醇 的甲基酯或丁基酯。Lecointe et al教导来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的酯酶/酰基转移酶，其随甲醇或丁醇浓度增加显示降低的水解活性以及增强的产生甲基酯和丁 基酯的能力。来自近平滑念珠菌的酯酶/酰基转移酶在制备脂肪羟氨基(hydroxamic)酸 中的用途在 Vaysse et al.J.of Biotechnology 53 (1997) 41-46 中教导。
脂酶胆固醇酰基转移酶(cholesterol acyltransferase)已经是已知的(参见例如 Buckley-Biochemistry伯克利生物化学1983，22，M90-5493)。具体地，已经发现甘油磷 脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)，它很象植物和/或哺乳动物卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT)，可以催化脂肪酸在卵磷脂与胆固醇之间的转移。
厄普顿(Upton)和伯克利(Buckley)(TIBS 20，May 1995 ρ 178-179)及布鲁米尔 科(BrumKk)和伯克利(Buckley) (J.of Bacteriology Apr. 1996 p2060-2064)教导了源自嗜水 气单胞菌(Aeromonahydrophila)的脂酶/酰基转移酶能够在水介质中将酰基转移到乙醇 受体上。发明内容
本发明第一方面提供了制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚 基酯或羟基酸酯的方法，所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生包含 5-98%水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂 (Iysophospholipid),甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂(Iysoglycolipid)组成的组中 的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组 成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰 基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。
本发明另一方面提供脂质酰基转移酶在制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质 酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯中的用途，其可通过在酰基供体，酰基受体与水的混合物 中催化醇解和/或酯基转移作用进行，所述混合物包含5-98%水，其中所述酰基供体是 脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组 中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸 组成的组中的一或多种物质。
根据本发明另一方面，提供了通过本发明的方法制备的碳水化合物酯，蛋白质 酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯。
根据本发明另一方面，提供了通过本发明的方法制备的药物，化妆品，食品， 颜料(paint)，包含碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯。
根据本发明另一方面，提供了本发明所述的固定化的脂质酰基转移酶。
本发明所涉及内容的小结
1.制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的方法， 所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生含5-98%水的高水分环境，其中所 述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚 基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触， 使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。
2.如1的方法，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
3.如1或2的方法，其中所述方法包括纯化所述碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯，羟基酸酯。
4.如1-3中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征是，其为具有酰基转 移酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种L， A, V，I，F, Y, H, Q, Τ, N, M 或 S。
5.如前述任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组 氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨 基酸序列中的His-309相对应的位置。
6.如前述所述的方法，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生 物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫 酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏 菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
7.如前述任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下 氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ IDNo.3所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6所示 氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列； (viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所示氨基 酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或 者与 SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No.12，SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或 SEQ ID No.;34 所示的任意一种序列有 75%或者 75% 以 上同一性的氨基酸序列。
8.脂质酰基转移酶在制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或 羟基酸酯中的用途，所述制备通过对酰基供体，酰基受体与水的混合物的醇解和/或酯 基转移作用来实施，所述混合物包含5-98%水，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自 由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，所 述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多 种物质。
9.如8所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
10.如8所述的用途，其中所述碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基 酸酯是经纯化的。
11.如8-10中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样 一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDS5C，其中X是以下氨基酸残基 中的一种或多种残基L，A，V，I，F，Y，H, Q, T，N，M或S。
12.如8-10中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含 组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的 氨基酸序列中的His-309相对应的位置。
13.如8-12中任一项所述的用途，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种 下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳 杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
14.如8-13中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下 氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ IDNo.3所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6所示 氨基酸序列；(vi) SEQ ID Νο.12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列； (viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所示氨基 酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或 者与 SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No.12，SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或 SEQ ID No.;34 所示的任意一种序列有 75%或者 75% 以 上同一性的氨基酸序列。
15.碳水化合物酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。
16.蛋白质酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。
17.蛋白质亚基酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。
18.羟基酸酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。
19.固定化的脂质酰基转移酶。
20.如19所述的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于 其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨 基酸残基中的一种或多种残基L，A，V，I，F，Y，H, Q, T，N，M或S。
21.如19或20的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含 H-309,或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ IDNo.32所示嗜水气单 胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。
22.如19-21中任一项所述的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述的脂质酰基转 移酶可以从一或多种下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝 杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶 菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌 和念珠菌。
23.如19-22中任一项所述的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移 酶包含一种或多种以下氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ ID No.3 所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序 列；(ν) SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(χ) SEQID No.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ IDNo.30 所示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32 所示氨基酸序列；(xiv) SEQ IDNo.34 所示氨基酸序列，或者与 SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ IDNo.6，SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或 SEQ ID No.;34 所示的任意一种序列有 75 %或者75 %以上同一性的氨基酸序列。
发明详述
本文应用的术语“脂质酰基转移酶”是指一种也具有脂酶活性的酶(根据 国际生物化学分子生物学联合会命名委员会的酶命名法推荐(Enzyme Nomenclature Recommendations) (1992)通常分类为E.C.3.1.1.X)，该酶也具有酰基转移酶活性(通常分 类为E.C.2.3.1.X)，该酶能够将酰基从一种脂质转移到一种或多种受体底物，例如以下物 质的一种或多种碳水化合物、蛋白质或其亚单位或羟基酸。
优选，本发明的“酰基受体”不是水。
一方面，优选所述酶能够将酰基从脂质底物转移到碳水化合物。
碳水化合物酰基受体可以为以下物质中的一种或多种单糖、二糖、寡 糖或多糖。优选的碳水化合物是以下物质中的一种或多种葡萄糖、果糖、脱 水果糖(anhydrofractose)、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖(xylose)、木寡糖 (xylooligosacharide)、阿拉伯糖、麦芽寡糖(maltooligosaccharide)、塔格糖(tagatose)、 microthecin、ascopyrone P> ascopyrone T 或 cortalcerone。
碳水化合物酯可作为有价值的乳化剂在例如食品中起作用。
一方面，优选所述酶能够将酰基从脂质底物转移到蛋白质和/或蛋白质亚基。
优选所述蛋白质亚基是以下物质中的一种或多种氨基酸，蛋白质水解产物， 肽，二肽，寡肽，多肽。
适宜的蛋白质可以是食品中例如在乳制品和/或肉制品中的一种或多种蛋白 质。仅作为实例，适宜的蛋白质可能是乳凝块或乳清中的蛋白质，如乳球蛋白。其 它适宜的蛋白质包括卵清蛋白(来自蛋类)、麸蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin)、 puroindoline>来自谷物的脂质转移蛋白和肉中的肌球蛋白，或以下乳蛋白酪蛋白，乳 白蛋白(Iactalbulin)和乳铁传递蛋白(Iactoferrin)。
适宜地，在所述蛋白质或蛋白质亚基中，所述酰基受体可以是以下蛋白质或蛋 白质亚基组分中的一种或多种丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，或半胱氨酸。
当所述蛋白质亚基是氨基酸时，适宜地所述氨基酸可以是任何氨基酸，优选所 述氨基酸是例如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或半胱氨酸中的一或多种。
一方面，优选所述酶能将酰基从脂质底物转移到羟基酸。
适宜地，所述羟基酸是以下酸中的一种或多种柠檬酸，酒石酸，乳酸，抗 坏血酸，羟基乙酸，苹果酸，α -羟基醋酸(alpha-hydroxylethanoic acid)，α -羟基辛 酸(alpha-hydroxyoctanoic acid)， α -轻基辛酸(alpha-hydroxycaprylic acid)，轻基辛 酸(hydroxycaprylic acid),葡糖酸，乳糖酸(lactobionic acid)或麦芽糖酸(maltobionic acid) ο
适宜地，所述羟基酸可以是水果酸(frait acid)，例如苹果酸，乳酸，酒石酸，柠檬酸或羟基乙酸中的一种或多种。
一个实施方案中，优选所述羟基酸是柠檬酸，乳酸，酒石酸或苹果酸中的一种 或多种。
本文术语“羟基酸”指其中烷基的一或多个氢原子被羟基取代的羧酸。
一方面，所述脂质酰基转移酶可将酰基从脂质底物转移到碳水化合物，蛋白质 亚基或羟基酸中的一种或多种，所述脂质酰基转移酶还可将酰基从脂质转移到固醇和/ 或stanol,具体是phytosterol禾口 /或hytostanol中的一种或多种。
适宜地，当所述脂质底物是磷脂，其可为卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。本文术语 卵磷脂包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油.
适宜地，当脂质底物是溶血磷脂，其可为溶血卵磷脂，例如溶血磷脂酰胆碱。 本文术语溶血磷脂酰胆碱与术语溶血卵磷脂同义，这些术语可互换使用。
适宜地，当脂质底物是糖脂，其可为例如双半乳糖甘油二酯(DGDG)。
所述脂质底物可称为“脂质酰基供体”或“酰基供体”。这些术语可互换使 用。
一些方面，优选脂质酰基转移酶针对其起作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷 脂，例如磷脂酰胆碱.
一些方面，优选所述脂质底物是糖脂，诸如DGDG。
一些方面，所述脂质底物可以是食品脂质，即食品的脂质组分。
在一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用于甘油三 酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。
脂质底物或脂质酰基供体宜为一种或多种脂质，其存在于一种或多种下列底 物中脂肪，包括猪油(lard)、牛羊油(tallow)、乳脂(butter fat)；油，包括从棕榈油 (palm oil)、葵花子油(sunflower oil)、大豆油(soya bean oil)、红花油(safflower oil)、棉 籽油(cotton seed oil)、花生油(ground nut oil)、玉米油(corn oil)、橄榄油(olive oil)、花 生油(peanut oil)、椰子油(coconut oil)和油菜籽油(rape seed oil)中提取或由它们衍生的 油。来自大豆、油菜籽、或蛋黄的卵磷脂也是适宜的脂质底物。脂质底物也可以是燕麦 脂质或其它包含半乳糖脂的基于植物的物质。
在本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为8-22碳的脂质。
本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为16-22碳的脂质，更优选为16-20 碳的脂质。
本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长不多于14碳的脂质，适宜地选自脂 肪酸链长4-14碳的脂质，适宜地为4-10碳的脂质，适宜地为4-8碳的脂质。
优选所述酰基供体不是游离脂肪酸。
优选，所述酰基供体不是碳水化合物(糖)酯。
适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶可显示出一种或多种下列脂酶的活性糖 脂酶活性(E.C.3.1.1.26),甘油三酯酶活性(E.C.3.1丄3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.U.4)， 磷脂酶Al活性(E.C.3.1丄32)。这里应用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活 性，，。
适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶具有至少一种或多种下列活性糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和 / 或磷脂酶 Al 活性(E.C.3.1.1.32)和 / 或磷脂酶 A2 活性(E.C.3.1.1.4)。
对于本发明一些方面，脂质酰基转移酶至少具有糖脂酶活性(E.C.3.L1J6)。
适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂 上转移到以下一种或多种受体底物碳水化合物，蛋白质，甘油羟基酸。
—些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂转移到碳 水化合物，形成至少碳水化合物酯。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂或磷脂转移到蛋白质 或蛋白质亚基，形成至少蛋白质酯(或蛋白质脂肪酸缩合物)或蛋白质亚基酯。
本文术语“蛋白质亚基酯”酯从任何蛋白质亚基形成的酯，诸如二肽酯，，寡 肽酯，多肽酯或蛋白质水解产物酯。
一些方面，优选本发明脂质酰基转移酶不表现甘油三酯酶活性(E.C.3.1丄3)。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征
⑴该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原 始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受 体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；和
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基L，A，V，I， F，Y，H, Q, T，N，M或S中的一种或多种。
优选地，GDSX基序中的X是L，这样，本发明所述的酶优选包含氨基酸基序 GSDL。
GDSX基序是由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰 基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以在与嗜水气单胞菌脂 解酶中与 Ser-16 相应的位置，如 Bramlik 和 Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol.1, No.7，ρ 2060-2064)的教导。
为确定一种蛋白质是否含有本发明所述GDSX基序，优选将该序列与Pfam数据 库中的隐藏markov模型图谱(model profile) (HMM图谱)进行比较。
Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括用于每个家族的辅助(curated)多 重序列比对以及用于鉴定新序列中的这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。 对 Pfam 的介绍见于 Bateman A 等.Q002) Nucleic Acids Res.30 ； 276-280。隐藏 Markov 模 型被应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH (2002) Brief Bioinform3 ； 236-245。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ？ cmd = Retrieve&db = PubMed&list uids = 12230032&dopt = Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ？ cmd = Retrieve&db = PubMed&list uids = 11752314&dopt = Abstract
对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durb 中 R， Eddy S,禾口 Krogh A (1998) Biological sequence 分析；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 (Durb 中 R，Eddy S，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4。Hammer程序包可以从华盛顿大学，St Louis，USA获得。
可选择地，GDSX基序可以通过应用Hammer软件包识别，说明由Durb中 R, Eddy S，禾口 Krogh A (1998) Biological sequence 分析；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press, ISBN0—521-62041-4 (Durb 中 R, Eddy S, 和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4)及其中的参考文献提供，以及本说明书中关于HMMER2的资料。
PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问
http: / / www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index .shtml
http://pfam.wustl.edu/
http:/ / pfam.j ouv.inra.fi·/
http://pfam.cgb.ki.se/
数据库提供了检索工具，在此可以输入蛋白质序列。应用数据库的默认参数， 对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在数据库中已建立的区 域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有 序列与查询序列的比对。
多重比对，包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌可以通过下列方法获得
a)手工方法
通过上述程序，可获得目的蛋白与Pfam00657保守序列的比对并获得P10480序 列与Pfam00657保守序列的比对；或
b)通过数据库
在鉴定Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项显示查询序列与Pfam00657保 守序列的种子比对(seed alignment)，P10480是该种子比对的一部分，且表示为GCAT_ AERHY。查询序列和P10480都将在同一窗口显示。
嗜水气单胞菌参比序列
嗜水气单胞菌GDSX脂酶的残基在NCBI文件P10480中进行编号，所述文本中 的编号是指由该文件给出的编号，在本发明中它用来确定具体的氨基酸残基，所述具体 的氨基酸残基在优选具体实施方案中，存在于本发明的脂质酰基转移酶中。
实施Pfam比对(图33和34)
下列保守的残基可被识别，并且在优选的实施方案中存在于本发明的组合物和 方法所应用的酶中。
Ig-GDSXg
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28 29 30 31 32 33 34 35
2 区-GANDY 区
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
3 区-HPT 区
His
309
其中'hid'是指选自Met，lie, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp,Tyr或Phe的一个疏水残基。
优选地，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶可用Pfam00657共有 序列进行比对。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性匹配表明本发明中的GDSL或GDSX结构域的存在。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中 的脂质酰基转移酶含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，GDfe区、 GANDY区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶含有GDSx区和GANDY区。可选择 地，所述酶含有GDfe区和HPT区。优选地，所述酶含有至少一个GDfeg。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的 酶与参比嗜水气单胞菌多肽序列即SEQ ID No.32比较时含有至少一个，优选一个以上， 优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七 个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二以 上，优选十三以上，优选十四个以上下列氨基酸残基^hid，29hid, 30hid, 31hid， 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309Hiso
pfam00657 GDSX结构域是将具有该区域蛋白与其它酶区分的独特标识。
Pfam00657共有序列，表示为

图1的SEQIDNo.l。 这是从第6版数据库 Pfam00657家族的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657.6。
保守序列可通过新版Pfam数据库来更新。
例如，图33和34显示第11版数据库中00657家族的pfam比对，本文也称其为 pfam00657.ll。
发现两个版本的数据库中Pfam00657家族中都存在GDfeg、GANDY区和HPT 区。其它版本的(release)pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征
⑴该酶具有转移酰基的活性(可定义为酯基转移活性)，由此将脂质酰基供体 的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；
( )该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基 L，A，V，I，F，Y，H, Q，T，N，M或 S;
(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸 残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示6EQ ID No.2或SEQID No.32)。优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。
在SEQ ID Νο.2或SEQ ID No.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长 序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序 列的序列)中的His-2910
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体Ser-34，Asp-134 和His-309或者包含位置分别对应于图2 (SEQ ID No.2)或图28 (SEQ ID No.32)所示的嗜 水气单胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸 残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示序列中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和HiS_309，等同 于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和HiS491。在图 KSEQ IDNo. 1)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser_7，Asp_157和 His-348。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征
⑴该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原 始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受 体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；并且
( )该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基 L，A，V，I，F，Y，H, Q，T，N，M或 S;
(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸 残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示6EQ ID No.2或SEQID No.32)。
优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。
在SEQ ID Νο.2或SEQ ID No.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长 序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序 列的序列)中的His-2910
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体Ser-34，Asp-134 和His-309或者包含位置分别对应于图2 (SEQ ID No.2)或图28 (SEQ ID No.32)所示的嗜 水气单胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸 残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示序列中，前18个氨基酸残基形 成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和His-309，等同 于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和HiS491。在图 1 (SEQ ID No.l)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser_7，Asp-157和 His-348ο
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征
⑴该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原 始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受 体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；并且
(ii)该酶包含至少 Gly_32，Asp-33, Ser-34, Asp-IiM 和 His-3O9 或者包含位 置分别对应于图WSEQ ID No.2)或图^MEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中 Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-IiM和His-3O9的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸 和组氨酸。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列来自一个或多个 属的生物体中获得气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属Mtreptomyces)、酵母菌属 (Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属 属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、 芽胞杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylcybacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、 木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属Mulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces)、李司戎氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、Mesorhizobium、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属 (Candida)。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列一种或多种生物体 中获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(杀鲑气单胞菌)、天 蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分枝杆菌 (Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、 脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitcybacterium dehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲 杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、昔养木杆菌(Xylella fastidiosa)、 Ψι 磺矿 Ψι 叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害李司 戎氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes)、 脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、Mesorhizobium Ioti、 青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearam)、里予油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毪草黄单胞菌 (Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(近平滑念珠菌)。
在一方面，优选地，本发明中的脂质酰基转移酶可以并优选从一种或多种嗜水 气单胞菌或杀鲑气单胞菌中获得。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一种或多种下列氨基酸序列。
(i) SEQ ID No.2所示的的氨基酸序列(见图2)
(ii) SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(见图3)
(iii) SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(见图4)
(iv) SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(见图5)
(ν) SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(见图6)
(vi) SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列(见图14)
(vii) SEQ ID No.20所示的氨基酸序列(见图16)
(viii) SEQ ID No.22所示的氨基酸序列(见图18)
(ix) SEQ ID No.24所示的氨基酸序列(见图20)
(xi) SEQ ID No.26所示的氨基酸序列(见图22)
(xii) SEQ ID No.28所示的氨基酸序列(见图24)
(xiii) SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(见图26)
(ixi) SEQ ID No.32所示的氨基酸序列(见图28)
(xiv) SEQ ID No.34所示的氨基酸序列(见图30)
或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQID No.6， SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或 SEQ ID No.;34所示的任意一种序列有 75%或者更高同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶或者包含SEQ ID No.2或SEQID No.3或 SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列有75%或75%以上，优选80%15或80%以上，优选85%或85%以上，优选90%或90%以上，优选95%或95%以上同一性的氨基酸序列。
为了达到本发明的目的，同一性的程度取决于相同序列元素的数目。依照本发 明，同一性程度可通过本领域已知电脑程序适宜地测定，所述程序诸如GCG程序包提供 的 GAP (Program Manual for the Wiscons 中 Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970)，J.of Molecular Biology48, 443-45)，利用下列设置进行多肽序列比较 GAP生成罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一段氨基酸序列，该序列与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ IDNo.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任何一段序列具有80%或80%以上，优选85%或 85%以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上的同一性。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一或多种
(a)如SEQ ID Νο.2或SEQ ID No.32的1-100氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列； 或
(d)与上述(a)-(c)定义的任意氨基酸序列有75%或75%以上，优选85%或 85%以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一或多种
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基观_39所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基U6-136所示的氨基酸序列；
(d)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列； 或
(f)与上述(a)-(e)定义的任意氨基酸序列有75%或75%以上，优选85%或85% 以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以包含下列核苷酸序列中的一个或多 个序列表达而产生的氨基酸序列。
(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列(见图9)；
(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列(见图10)；
(c)如SEQ IDNo.9所示的核苷酸序列(见图11)；
(d)如SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列(见图12)；
(e)如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列(见图13)；
(f)如SEQ ID No. 13所示的核苷酸序列(见图15)；
(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列(见图17)；
(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列(见图19)；
(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列(见图21)；
(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列(见图23)；
(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列(见图25)；
(1)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列(见图27)；
(m)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列(见图四)；
(η)如SEQ ID Νο.35所示的核苷酸序列(见图31)；
(ο)或
与SEQIDNo.7，SEQ ID No.8, SEQ ID No.9, SEQ ID No. 10, SEQIDNo.ll， SEQ ID No. 13, SEQ ID No.21, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33或SEQ ID No.:35所示的任意一序列具有75%或75%以上同一性的核苷酸序列。
适宜地，核苷酸序列可以与SEQ ID No.7，SEQ ID No.8, SEQ ID No.9, SEQ ID No.10, SEQIDNo.ll，SEQ ID No. 13, SEQ ID No.21, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 或 SEQ ID No.:35 所示的任意一序列具有80%或80%以上，优选85%或85%以上，更优选90%或90%以上，还更 优选95%或95%以上的同一性。
一方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT)或其变体(例如分子进化产生的变体)。
本领域所知的适宜的LCAT可从下列一种或多种生物体中得到，例如哺乳 动物、大鼠、小鼠、小鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物，包括拟南芥 (Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫(nematodes)、真菌和酵母。
在一个具体实施方案中，本发明所述的脂质酰基转移酶可以是可以并优选从含 有 pPetl2aAhydro 和 pPetl2aASalmo 的大肠杆菌菌株 E.TOP 10 (E.coli strains TOP 10)中获 得的脂质酰基转移酶，该菌株由丹麦哥本哈根K，DK-1001, Langebrogade 1的丹尼斯科 公司(Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Denmark),根据布达佩 斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent 方法)在 2003 年 12 月22日保藏于英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号国立工业和海洋微生物保藏有限公 司(NCIMB) (the National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St.Machar Street, Aberdeen Scotland, GB)，保藏号分别为 NCIMB 41204 和 NCIMB 41205。
这里使用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”可以互换。
适宜地，本发明定义的脂质酰基转移酶催化下列一种或两种反应酯基转移作 用(transesterification)，酉享角军作用。
根据本发明，可获得一或多种以下的优越性质从脂质到形成一或多种碳水化 合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的生物转化可在高水分环境中发生，所述 环境不包含有机溶剂或包含于常规生物转化法相比而言较少量的有机溶剂。
术语“生物转化”指修饰一种有机化合物以产生另一种有机化合物和/或通过 酶催化从其它有机化合物合成有机化合物。
本文术语“酯基转移作用”指的是酰基从脂质供体(除外游离脂肪酸)上经酶 催化转移到酰基受体(除外水)。为避免怀疑，本文所用术语“酯基转移作用”指的是 酰基在脂质供体与酰基受体(不是水)之间的酶催化转移，其中所述酰基受体包含适宜地 化学基团，其可以为例如-OH或-SH基团。
本发明使用的术语“醇解作用”指的是通过与醇基团ROH的反应对酸衍生物的 共价键的酶裂解，使得一产物与醇基团的H结合而另一产物与醇基团的OR基团结合。
本发明使用的术语“水解作用”指的是酰基从脂质到水分子OH基团的酶催化 转移作用。由水解作用引起的酰基转移作用需要水分子的分离。
术语“酯交换作用”指的是酰基在脂质供体与酰基受体之间的酶催化转移，其 中的脂质供体不是游离的酰基。换言之“酯交换作用”指两个脂质分子之间的脂肪酸互 换。
—方面，本发明定义的脂质酰基转移酶催化酯交换作用。
适宜地，本发明的方法或用途可进一步包含一或多种以下步骤将酰基受体溶 于水；将脂质酰基供体加入溶解的酰基受体，形成双相系统或乳液；对反应混合物进行 搅拌或超声处理；加热反应混合物，例如，使得酶变性；通过标准分离技术将水相从脂 肪/乳液相分离，所述标准分离技术诸如溶剂提取或水蒸发；通过疏水反应层析使得脂 肪相分级，结晶或高真空蒸馏(high vacuum distillation)。适宜地，一或多种加热，分离 或分级步骤可在所述反应达到平衡以后实施。
一个实施方案中，本发明方法所用的酯酶酰基转移酶是固定化的。当所述酶被 固定的情况下，所述混合物包含酰基供体，酰基受体和流经柱子的水，所述水例如包含 固定化的酶。通过将所述酶固定化，可能容易地再利用它。
适宜地，所述固定的酶可用于流动反应器(flow reactor)中或批量反应器(batchreactor)中，所述反应器含有反应混合物，该混合物包含溶于水的酰基受体以及脂质酰基 供体作为双相系统或乳液。反应混合物可选被搅拌或经超声处理。一旦反应到达例如平 衡，所述反应混合物和固定化的酶可被分离。适宜地，所述反应产物可以例如通过疏水 反应层析，结晶或高真空蒸馏来分级。
固定化的脂质酰基转移酶可以使用本领域熟知的固定化技术制备。本领 域有大量的对本领域技术人员而言清楚明白的制备固定化的酶的方法(例如以下文 献中所述的技术EP O 746 608 ；或 Balcao VM, Paiva AL, Malcata FX., Enzyme MicrobTechnol. 1996 May 1 ； 18(6) 392-416 ； 或 Reetz MT, Jaeger KE.Chem Phys Lipids.1998 Jun ； 93(1-2) 3-14 ； 或 Bornscheuer UT，Bessler C, Srinivas R, Krishna SH.TrendsBiotechnol.2002 Oct ； 20(10) 433—7; Plou et al, J.Biotechnology 92(2002)55-66 ； Warmuth et al.，1992.Bio Forum 9，282-283; Ferrer et al., 2000. J.Chem.Technol.Biotechnol.75, 1-8 ； 或 Christensen et al.，1998.Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105 ； Petersen and Christenen, 2000, Applied Biocatalysis.Harwood Academic Publishers, Amsterdam。(将每篇都包含在本文中作为参照)。本文所用技术包括例如 与Eupergit C的共价偶联，吸附于聚丙烯和硅颗粒。
本文术语“高水分环境(high water environment)”优选指低或缺乏有机溶剂的环境，优选低或缺乏极性有机溶剂。本文术语有机溶剂作为脂质底物时优选不包括食品油，并有选不包括例如含高非极性脂质的食品油。适宜地，本发明高水分环境包含不超 过50%体积的有机溶剂，不超过30%体积的有机溶剂，更优选不超过15%体积的有机溶 剂，更优选不超5%，更优选不超过1%，更优选不超过0.5%体积的有机溶剂，更优选 0%体积的有机溶剂。
当根据本发明产生碳水化合物酯时，优选所述碳水化合物酯是寡糖酯、单糖酯或二糖酯。
适宜地，当根据本发明产生碳水化合物酯时，碳水化合物酯可以是以下的 一种或多种葡萄糖酯、果糖酯、脱水果糖酯、麦芽糖酯、乳糖酯、半乳糖酯、木 糖酯、木寡糖酯(xylooligosaccharide ester)、阿拉伯糖酯(araWnose ester)、麦寡糖 酉旨(maltooligosaccharide ester)、塔格糖酉旨(tagatose ester)、蔴糖酉旨、microthecin 酉旨、 ascopyrone P 酉旨、ascopyrone T 酉旨、或 cortalcerone 酉旨。
根据本发明优选产生的碳水化合物酯是以下一种或者多种碳水化合物单酯 (碳水化合物mono-ester)、糖单酯(sugar mono-ester)、寡糖单酯、三糖单酯、二糖单 酯、单糖单酯、葡萄糖单酯、果糖单酯、脱水果糖单酯、麦芽糖单酯、乳糖单酯、半乳 糖单酯、木糖单酯、木寡糖单酯、阿拉伯糖单酯、麦寡糖单酯、塔格糖单酯、蔗糖单 酉旨、microthecin 酉旨、ascopyrone P 酉旨、ascopyrone T 酉旨、或 cortalcerone 酉旨。
在一个具体实施方案中，microthecin酉旨、ascopyrone P酉旨、ascopyrone T酉旨、和 /或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、 ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂 的一个或两个来起作用。
优选地，本发明碳水化合物酯的的形成(如果有的话)不依赖于UDP-葡萄糖。
优选地，本发明的食品不包含UDP-葡萄糖或仅仅包含不显著量的UDP-葡萄糖。
已发现本发明组合物和方法中应用的脂质酰基转移酶与脂解酶相比具有独特的 性质，它们明显优先地将酰基从脂质转移到水以外的受体上，即使在有大量水存在的条 件下也是如此。与现有技术中的酶相比发现，本发明中应用的脂质酰基转移酶在存在 6%, 54%, 73%, 89%和大约95%的水的条件下具有高的相对转移酶活性。被试脂解酶 在这些水浓度条件下事实上不具有明显的相对转移酶活性。
%转移酶活性(即作为总酶活性百分比的转移酶活性)可通过以下方案测定
酶促反应后，可用CHCl3 CH3OH 2 1提取已添加本发明的脂质酰基转移 酶的食品，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文描述的详细步骤通过GLC和 HPLC分析。通过GLC和HPLC的分析，确定游离脂肪酸和一种或多种固醇/stand酯 类；碳水化合物酯；蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。不添加本发明的酶的对照 食品用同种方法分析。
计算
从GLC和HPLC分析的结果可以计算出游离脂肪酸和碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸的增加量
脂肪酸脂肪酸(酶脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸=脂肪酸平均分子量
A= Δ %蛋白质酯/Mv蛋白质酯(其中Δ %蛋白质酯蛋白质酯(酶蛋白质酯(对照)，Mv蛋白质酯=蛋白质酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白 质；
B= Δ%碳水化合物酯/My碳水化合物酯(其中Δ %碳水化合物酯=%碳水化 合物酯(酶碳水化合物酯(对照)，Mv碳水化合物酯=碳水化合物酯平均分子量)， 这适用于酰基受体是碳水化合物。
C= Δ %蛋白质亚基酯/Mv蛋白质亚基酯(其中Δ %蛋白质亚基酯蛋白质 亚基酯(酶)-%蛋白质亚基酯(对照)，Mv蛋白质亚基酯=蛋白质亚基酯平均分子量)， 这适用于酰基受体是蛋白质亚基；和
D =羟基酸酯/Mv羟基酸酯(其中Δ %羟基酸酯=%羟基酸酯(酶)-%羟基酸 酯(对照)，Mv羟基酸酯=羟基酸酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是羟基酸。
转移酶活性以占总酶活性的百分率计算
权利要求
1.制备碳水化合物酯的方法，所述方法包括将酰基供体、酰基受体与水混合以产生 含5-98%水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂、溶血磷脂、 甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是碳水 化合物；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下 反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。
2.权利要求1的方法，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括纯化所述碳水化合物酯。
4.权利要求1-3之一的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征是，其为具有酰基转移 酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种L、A、 V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。
5.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是在使用“经缓冲 的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2%酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶；所述 转移酶测定法包括以下步骤i)将450mg磷酸卵磷酯和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中使脂质分散到缓冲液中；iii)在使用磁力搅拌器混和的同时，将底物加热至35°C，并添加0.25ml酶溶液；iv)在反应0、5、10、15、25、40和60分钟后取出2ml样品，并立即添加25μ14Μ HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应；ν)添加3ml氯仿，并剧烈摇晃振摇30秒，将样品离心，分离2ml氯仿相，并用 0.45 μ m的滤纸过滤，进入IOml涂焦油的Dram玻璃杯中；vi)在60°C氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；vii)通过GLC分析提取的脂质。
6.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶被分类为 E. C .2.3.1 .χ ο
7.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶可以从一或多种 下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳 杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
8.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以 下氨基酸序列(i) SEQ ID Νο.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ ID No.3所示氨基酸序列； (iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6 所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序 列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所 示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序 列，或者与 SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQIDNo.6、 SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQIDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32 或 SEQ ID No.34 所示的任意一种序列具有 75%或75%以上同一性的氨基酸序列。
9.脂质酰基转移酶在制备碳水化合物酯中的用途，所述制备通过在酰基供体、酰基 受体与水的混合物中催化醇解和/或酯基转移作用来实施，所述混合物包含5-98%水、 其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂 或溶血糖脂组成的组中的一或多种，所述酰基受体是碳水化合物。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
11.如权利要求9所述的用途，其中所述碳水化合物酯是经纯化的。
12.如权利要求9-11中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为 这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸 残基中的一种或多种残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
13.如权利要求9-12中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是在使用“经缓 冲的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2%酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶；所 述转移酶测定法包括以下步骤i)将450mg磷酸卵磷酯和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中使脂质分散到缓冲液中；iii)在使用磁力搅拌器混和的同时，将底物加热至35°C，并添加0.25ml酶溶液；iv)在反应0、5、10、15、25、40和60分钟后取出2ml样品，并立即添加25μ14Μ HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应；ν)添加3.00ml氯仿，并剧烈摇晃振摇30秒，将样品离心，分离2ml氯仿相，并用 0.45 μ m的滤纸过滤，进入IOml涂焦油的Dram玻璃杯中；vi)在60°C氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；vii)通过GLC分析提取的脂质。
14.如权利要求9-13中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶被分类为 E.C. 2.3.1 .χ ο
15.如权利要求9-14中任一项所述的用途，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多 种下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳 杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
16.如权利要求9-15中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种 以下氨基酸序列(i) SEQ ID Νο.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ IDNo.3所示氨基酸序列； (iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6 所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序 列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所 示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序 列、或者与 SEQ ID No.2、SEQIDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQIDNo.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQID No.26, SEQIDNo.28、 SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任意一种序列具有75%或75%以上同一性的氨基酸序列。
全文摘要
制备碳水化合物酯的方法，所述方法包括将酰基供体、酰基受体与水混合以产生包含5-98％水的高水分环境，其中所述酰基供体是选自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种的脂质底物，且所述酰基受体是碳水化合物；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。本发明还涉及所述脂质酰基转移酶在制备碳水化合物酯中的应用。
文档编号C12P7/64GK102021206SQ20101053064
公开日2011年4月20日 申请日期2004年1月15日 优先权日2003年1月17日
发明者乔恩·B·索伊, 乔恩·D·米克尔森, 苏珊·M·马德里德, 阿尔诺·D·克赖杰 申请人:丹尼斯科公司