专利名称：一种提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程，具体涉及一种利用两相培养技术提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法。
背景技术：
竹黄菌(Shiraia bambusicola P. Hennigs)又名竹三七、竹茧、竹赤团子等，是一种特异寄生于某些竹子嫩枝上的真菌，其子座称竹黄，隶属于肉座菌科(Hyp0creaceae) 竹黄属(Shiraia)。竹黄中含有多种生理活性成分，最引人瞩目的是竹红菌素 (Hypocrellin)。竹红菌素属于茈醌类化合物，主要包含两种成分竹红菌甲素(HypocrellinA，简称HA)和竹红菌乙素(Hypocrellin B，简称HB)，其中95 %以上为甲素，HA可脱水转化为 HB。竹红菌素是在我国最早发现的一种新型光敏剂，是目前已知的在可见光区内优良的光敏剂。这类化合物可经过普通生物合成途径产生，它们的结构具有立体化学的特征，表现出光动力学活性，具有显著的光疗作用，临床上已用来治疗皮肤病，如外阴白色病变和软化疤痕疙瘩。近年来，研究发现它具有优良的光敏杀伤肿瘤细胞和抑制艾滋病病毒HIV-I的作用，并且可作为新型的光活化农药和潜在的光电转换材料，研究和应用前景十分广阔(参见中国实用医药，2008，3(11) 147-149，竹红菌素研究的进展)。目前，生产竹红菌素的方法主要有以下几种(1)从天然竹黄子座中直接提取竹红菌素(参见山东理工大学学报，2004， 18(2) :91-94，竹黄中竹红菌甲素的分离与纯化)，但由于竹黄菌的地理分布条件及时间上的限制，严重制约了资源上的来源，且野外采集竹黄也容易造成竹林的衰败。(参见安徽农业科学，2009，37 (28) 13589-13590，药用菌竹黄的药用价值及资源保护)。(2)利用从竹黄中分离得到的菌株进行固体培养(参见生物技术，2004，14(4) 46-47，竹黄菌固态发酵竹红菌素条件的研究)和液体培养(参见浙江食用菌，2008， 16(5)对-25，竹黄菌的液体发酵研究)从而获得竹红菌素及其前体类化合物。固体培养或液体培养是在固体或液体培养基中接种菌株，静置或振荡培养一段时间后，收集菌丝体，再从菌丝体中分离提取竹红菌素。但是该方法中发酵产物储存在胞内，对于在胞外收集产物和处理产物均不利，且从胞内提取分离纯化竹红菌素存在步骤复杂，成本高的问题，阻碍了竹黄菌发酵生产商业应用的发展。近年来，利用产物原位转移技术，尤其是在培养基中添加固体吸附剂吸附的方法来促进次生代谢产物合成的研究越来越多。产物原位转移技术是指将菌体产生的代谢产物从某一部位转移至其它部位或其它物质中，是增加产量的一种方式，属于两相培养技术的一种。发酵过程中产物的原位转移是一个综合生产和分离的生物过程，对于克服反馈抑制作用和提高整个过程的效率有很好的作用。Yan Q.等通过在丹参毛状根培养过程中添加树脂X-5，不仅提高了总丹参酮的单位含量以及体积产量，其显著作用在于从根中吸附出了大部分的丹参酮(参见Yan Q.et al. 2005. Efficient production and recovery ofditerpenoid tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures with in situ adsorption,elicitation and semi-continuous operation. Journal of Biotechnology, 119 :416 424)。Xu L-J等在芬芳镰胞菌(Fusarium redolens)培养过程中添加树脂X_5， 使得白僵菌素的产量从IMmg/L增加到^5mg/L，且65%的白僵菌素被固相吸附(参见 Xu Li-Jian et al. 2009. Enhanced beauvericin production with in situ adsorption in mycelial liquid culture of Fusarium redolens Dzf2. Process Biochemistry 44: 1063-1067)。但关于利用产物原位转移技术来增加竹红菌素产量，且利于产物分离的技术则无相关报道。
发明内容
本发明目的是提供一种提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，以提高竹黄菌中竹红菌素产量，同时简化发酵产物竹红菌素的收集和处理步骤。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，以竹黄菌株为出发菌株，活化后进行种子培养及发酵培养，发酵培养至少4天后收集菌丝体，经分离纯化后获得竹红菌素，其中，在发酵培养过程中，向发酵培养基中加入大孔吸附树脂共同培养。上述技术方案中，所述竹黄菌株指在自然状态下所有能产生竹红菌素的真菌，可以选自任何菌种库可公开购得的竹黄菌株或其突变株，优选为竹黄菌(Shiraia bambuSiC0la)S8，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为=CGMCC No. 3984， 保藏日期为2010年7月7日。上述技术方案中，所述大孔吸附树脂为聚苯乙烯型非极性吸附树脂，优选的技术方案中，所述大孔吸附树脂粒径为0. 3-1. 25mm，平均孔径为29-30nm，孔容为1. 20-1. M，例如大孔吸附树脂X-5。上述技术方案具体包括以下步骤(1)将竹黄菌菌株接入新配制的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，培养温度 25 ^°C，培养时间9 10天；所述马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的组成成分为每一升蒸馏水中含下列成分 (单位克)土豆200 (煮汁)，葡萄糖20，琼脂15，pH值为自然pH ；所述马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)培养基的制备方法为本领域技术人员公知的现有技术；(2)将步骤(1)中的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，接种量为4孔/200mL培养液，培养温度25 ，摇床转速150 160rpm，培养5天后即得种子液；所述种子培养基的组成成分为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆 200(煮汁)，葡萄糖20，KH2PO4 3，MgSO4 1.5，维生素B1 0. 01，酵母膏5，装液量为每500mL 三角瓶中装200mL种子培养基；(3)将步骤O)中所得的种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，接种量10% (ν/ν)，培养温度25 ^°C，摇床转速150 160rpm，在发酵培养的第1 7天向发酵培养基中加入大孔吸附树脂，于发酵培养的第5 8天收获菌丝体并取出大孔吸附树脂；所述发酵培养基的组成成分与步骤O)中种子培养基的组成成分相同，装液量为每150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，大孔吸附树脂的加入量为0. 5 3g/50mL发酵培养基；大孔吸附树脂用200目尼龙布包裹并灭菌后，再加入发酵培养基中；(4)将步骤(3)中收获的菌丝体烘干后称重，提取菌丝体及大孔吸附树脂中的竹红菌素。上述技术方案中，步骤(1)中，活化菌株所使用的培养基优选为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，培养温度优选为.上述技术方案中，步骤O)中，种子培养过程中，培养温度优选为；摇床转速优选为150rpm ；培养时间优选为5天。上述技术方案中，步骤(3)中，发酵培养过程中，培养温度优选为^°C，摇床转速优选为150rpm ；大孔吸附树脂的加入量优选为每IOOmL发酵培养基lg，加入时间优选为发酵培养的第4天；发酵培养的时间优选为8天，在发酵培养的第8天收获菌丝体并取出大孔吸附树脂。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点(1)由于本发明应用聚苯乙烯型非极性吸附树脂与竹黄菌共培养，促进竹黄菌生产竹红菌素，提高了竹红菌素的产量，和未加聚苯乙烯型非极性吸附树脂的对照组相比，提高了 3 4倍；(2)聚苯乙烯型非极性吸附树脂对竹黄菌的生长无明显抑制；在共培养发酵过程中吸附竹黄菌分泌的竹红菌素，能够有效克服产物的反馈抑制作用，并且有利于后期竹红菌素的分离提取，从而降低了该方法的成本。保藏信息竹黄菌(Shiraia bambusicola) S8，保藏地址中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 3984，保藏日期为2010年7月7日。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述竹红菌素的提取测定参照中国药典(2010版)中竹红菌素软膏中竹红菌素的提取测定方法。实施例一竹黄菌发酵产竹红菌素1、活化菌种取出保藏的竹黄菌菌株S8接入新配制的PDA培养基中，PDA培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，琼脂15， PH值为自然pH，培养温度25 ，培养时间9 10天；2、将活化后的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，KH2PO4 3， MgSO4 1.5，维生素B1 0.01，酵母膏5，装液量为每500mL三角瓶中装200mL种子培养基，接种量为4孔/200mL培养液，培养温度25 ，摇床转速150 160rpm，培养5天后即得种子液；
3、将种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，发酵培养基的组成成分与种子培养基的组成成分相同，装液量为每150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，接种量10% (ν/ν)，培养温度25 ^°C，摇床转速150 160rpm ；4、发酵培养8天后收获菌丝体，用真空抽滤分离培养基和菌丝体，菌丝体用蒸馏水冲洗干净后，于40°C烘干。5、将烘干的竹黄菌菌丝体研碎，取0. Ig粉末，加5ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，4000r离心IOmin除去菌丝体，提取液定容至10ml，于465nm 波长下测定OD值，按竹红菌甲素(C3tlH2tlOici)的吸收度系数为459和公式A = C * E * bA为吸光度，C为浓度(g/L)，E为吸收度系数(L/g cm)，b为比色皿厚度(cm)计
笪弁。在未加大孔吸附树脂X-5条件下竹黄菌发酵后，竹红菌素的产量为0. 423mg/L0实施例二 1、活化菌种取出保藏的竹黄菌菌株S8接入新配制的PDA培养基中，PDA培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，琼脂15， PH值为自然pH，培养温度25 ，培养时间9 10天；2、将活化后的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，KH2PO4 3， MgSO4 1.5，维生素B1 0.01，酵母膏5，装液量为每500mL三角瓶中装200mL种子培养基，接种量为4孔/200mL培养液，培养温度25 ，摇床转速150 160rpm，培养5天后即得种子液；3、将种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，发酵培养基的组成成分与种子培养基的组成成分相同，装液量为每150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，接种量10% (ν/ν)，培养温度25 ^°C，摇床转速150 160rpm，在发酵培养的第4天向发酵培养基中加入0. 5 3g用200目尼龙布包裹并灭菌的大孔吸附树脂X-5 ；4、发酵培养7天后收获菌丝体及树脂袋，用真空抽滤分离培养基和菌丝体，菌丝体用蒸馏水冲洗干净后，于40°C烘干。5、将烘干的竹黄菌菌丝体研碎，取0. Ig粉末，加5ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，4000r离心IOmin除去菌丝体，提取液定容至10ml，于465nm 波长下测定OD值，按竹红菌甲素(C3tlH2tlOici)的吸收度系数为459和公式A = C * E * bA为吸光度，C为浓度(g/L)，E为吸收度系数(L/g cm)，b为比色皿厚度(cm)计
笪弁。6、树脂袋用25ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，浓缩至10ml，浓缩液于4000r离心lOmin，在465nm波长下测定OD值，再根据上述步骤5中的方法计算竹红菌素的含量。在该实施例中，当大孔吸附树脂X-5加入量为0. 5g时，竹红菌素的产量最高，为 0. 795mg/L，是未加树脂的产量的1. 88倍。实施例三
1、活化菌种取出保藏的竹黄菌菌株S8接入新配制的PDA培养基中，PDA培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，琼脂15， PH值为自然pH，培养温度25 ，培养时间9 10天；2、将活化后的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，KH2PO4 3， MgSO4 1.5，维生素B1 0.01，酵母膏5，装液量为每500mL三角瓶中装200mL种子培养基，接种量为4孔/200mL培养液，培养温度25 ，摇床转速150 160rpm，培养5天后即得种子液；3、将种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，发酵培养基的组成成分与种子培养基的组成成分相同，装液量为每150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，接种量10% (ν/ν)，培养温度25 ^°C，摇床转速150 160rpm，在发酵培养的第1 7天向发酵培养基中加入0. 5g用200目尼龙布包裹并灭菌的大孔吸附树脂X-5 ；4、发酵培养7天后收获菌丝体及树脂袋，用真空抽滤分离培养基和菌丝体，菌丝体用蒸馏水冲洗干净后，于40°C烘干。5、将烘干的竹黄菌菌丝体研碎，取0. Ig粉末，加5ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，4000r离心IOmin除去菌丝体，提取液定容至10ml，于465nm 波长下测定OD值，按竹红菌甲素(C3tlH2tlOici)的吸收度系数为459和公式A = C * E * bA为吸光度，C为浓度(g/L)，E为吸收度系数(L/g cm)，b为比色皿厚度(cm)计
笪弁。6、树脂袋用25ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，浓缩至10ml，浓缩液于4000r离心lOmin，在465nm波长下测定OD值，再根据上述步骤5中的方法计算竹红菌素的含量。在该实施例中，当大孔吸附树脂X-5的加入时间为第4天时，竹红菌素的产量最高，为1. 108mg/L,是未加树脂的产量的2. 62倍。实施例四1、活化菌种取出保藏的竹黄菌菌株S8接入新配制的PDA培养基中，PDA培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，琼脂15， PH值为自然pH，培养温度25 ，培养时间9 10天；2、将活化后的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，KH2P043， MgSO4L 5，维生素B1O. 01，酵母膏5，装液量为每500mL三角瓶中装200mL种子培养基，接种量为4孔/200mL培养液，培养温度25 ，摇床转速150 160rpm，培养5天后即得种子液；3、将种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，发酵培养基的组成成分与种子培养基的组成成分相同，装液量为每150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，接种量10% (ν/ν)，培养温度25 ^°C，摇床转速150 160rpm，在发酵培养的第4天向发酵培养基中加入0. 5g用200目尼龙布包裹并灭菌的大孔吸附树脂X-5 ；4、发酵培养5 8天后收获菌丝体及树脂袋，用真空抽滤分离培养基和菌丝体，菌丝体用蒸馏水冲洗干净后，于40°C烘干。5、将烘干的竹黄菌菌丝体研碎，取0. Ig粉末，加5ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，4000r离心IOmin除去菌丝体，提取液定容至10ml，于465nm 波长下测定OD值，按竹红菌甲素(C3tlH2tlOici)的吸收度系数为459和公式A = C * E * bA为吸光度，C为浓度(g/L)，E为吸收度系数(L/g cm)，b为比色皿厚度(cm)计
笪弁。6、树脂袋用25ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，浓缩至10ml，浓缩液于4000r离心lOmin，在465nm波长下测定OD值，再根据上述步骤5中的方法计算竹红菌素的含量。在该实施例中，当大孔吸附树脂X-5与竹黄菌发酵共培养的时间为8天时，竹红菌素的产量最高，为1. 48;3mg/L，是未加树脂的产量的3. 51倍。实施例五1、活化菌种取出保藏的竹黄菌菌株S8接入新配制的PDA培养基中，PDA培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，琼脂15， PH值为自然pH，培养温度，培养时间9天；2、将活化后的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为，每一升蒸馏水中含下列成分(单位克)土豆200(煮汁)，葡萄糖20，KH2P043， MgSO4L 5，维生素B1O. 01，酵母膏5，装液量为每500mL三角瓶中装200mL种子培养基，接种量为4孔/200mL培养液，培养温度，摇床转速150rpm，培养5天后即得种子液；3、将种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，发酵培养基的组成成分与种子培养基的组成成分相同，装液量为每150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，接种量10% (ν/ν)，培养温度，摇床转速150rpm，在发酵培养的第4天向发酵培养基中加入
0.5g用200目尼龙布包裹并灭菌的大孔吸附树脂X-5 ；4、发酵培养8天后收获菌丝体及树脂袋，用真空抽滤分离培养基和菌丝体，菌丝体用蒸馏水冲洗干净后，于40°C烘干。5、将烘干的竹黄菌菌丝体研碎，取0. Ig粉末，加5ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，4000r离心IOmin除去菌丝体，提取液定容至10ml，于465nm 波长下测定OD值，按竹红菌甲素(C3tlH2tlOici)的吸收度系数为459和公式A = C * E * bA为吸光度，C为浓度(g/L)，E为吸收度系数(L/g cm)，b为比色皿厚度(cm)计
笪弁。6、树脂袋用25ml无水乙醇浸提M小时，此步骤重复一次，合并两次提取液，浓缩至10ml，浓缩液于4000r离心lOmin，在465nm波长下测定OD值，再根据上述步骤5中的方法计算竹红菌素的含量。在竹黄菌与大孔吸附树脂X-5共培养发酵优化条件下，竹红菌素的产量为
1.622mg/L,是未加树脂的产量的3. 83倍。
权利要求
1.一种提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，以竹黄菌株为出发菌株进行种子培养及发酵培养，发酵培养至少4天后收集菌丝体，经分离纯化后获得竹红菌素，其特征在于，在发酵培养过程中，向发酵培养基中加入大孔吸附树脂共同培养。
2.根据权利要求1所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，所述竹黄菌株为竹黄菌(Shiraia bambusicola) S8，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心出具的保藏号为=CGMCC No. 3984，保藏日期为2010年7月7日。
3.根据权利要求1所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为聚苯乙烯型非极性吸附树脂。
4.根据权利要求1所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤(1)将竹黄菌菌株接入新配制的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度25 ^°C，培养时间9 10天；(2)将步骤(1)中的菌种用打孔器打孔后接入装有种子培养基的三角瓶中，接种量为4 孔/200mL培养液，培养温度25 ，摇床转速150 160rpm，培养5天后即得种子液；所述种子培养基的组成成分为，每一升蒸馏水中含下列成分土豆200g(煮汁)，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.5g，维生素B1 0. Olg，酵母膏5g，装液量为每500mL三角瓶中装 200mL种子培养基；(3)将步骤O)中所得的种子液转接入装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养，接种量10% (ν/ν)，培养温度25 ^°C，摇床转速150 160rpm，在发酵培养的第1 7天向发酵培养基中加入大孔吸附树脂，于发酵培养的第5 8天收获菌丝体并取出大孔吸附树脂；所述发酵培养基的组成成分与步骤O)中种子培养基的组成成分相同，装液量为每 150mL三角瓶中装50mL发酵培养基，吸附树脂的加入量为0. 5 3g/50mL发酵培养基；聚苯乙烯型非极性吸附树脂用200目尼龙布包裹并灭菌后，再加入发酵培养基中；(4)将步骤(3)中收获的菌丝体烘干后称重，提取菌丝体及大孔吸附树脂中的竹红菌ο
5.根据权利要求4所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，步骤(1)中， 培养温度优选为^°C。
6.根据权利要求4所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，步骤O)中， 种子培养过程中，培养温度为摇床转速为150rpm ；培养时间为5天。
7.根据权利要求4所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，步骤(3)中， 发酵培养过程中，培养温度为^°C，摇床转速为150rpm。
8.根据权利要求4所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，步骤(3)中， 发酵培养过程中，大孔吸附树脂的加入量为每IOOmL发酵培养基lg，加入时间为发酵培养的第4天。
9.根据权利要求4所述提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法，其特征在于，步骤(3)中， 发酵培养过程中，发酵培养的时间为8天，在发酵培养的第8天收获菌丝体并取出大孔吸附树脂。
全文摘要
本发明公开了一种利用聚苯乙烯型非极性吸附树脂提高竹黄菌中竹红菌素产量的技术，首先是菌种活化培养，其次是液体种子培养，最后是菌种与吸附树脂共培养发酵。其特征在于，通过共培养发酵，树脂不但能够吸附竹黄菌分泌的竹红菌素，而且能够提高竹黄菌中竹红菌素的含量，从而提高竹红菌素的产量。因此本发明可有效地刺激竹黄菌株中竹红菌素的合成，提高培养体系中竹红菌素的生产，产率高，成本低，步骤简便，可用于工业化生产，具有良好的工业应用前景。
文档编号C12P7/26GK102465154SQ201010530828
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者潘魏松, 王剑文, 赵一璐, 陈可嘉, 雷晓珩 申请人:苏州大学