专利名称：表达轮状病毒类表达颗粒的毕赤酵母、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传工程领域，特别是，利用酵母系统表达轮状病毒结构蛋白，组装轮状病毒类病毒颗粒，用于预防轮状病毒感染。
背景技术：
轮状病毒是全球婴幼儿严重腹泻病最常见的病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪一口途径， 临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2 3天， 腹泻5天，严重出现脱水症状。轮状病毒总共有七种，分别以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G等。人类主要是受到轮状病毒A种、B种与C种的感染，而其中最常见的是轮状病毒A种的感染。而这七种轮状病毒都会在其他动物身上造成疾病。在轮状病毒A种之中有不同的病毒株，称之为血清变异株(serovar)。与流行性感冒病毒类似，轮状病毒使用了双重的分类系统，依据病毒体表面的两个结构性蛋白质来作分类的。糖蛋白VP7定义了 G型。而对于蛋白酶敏感的蛋白质VP4则定义了 P型。P型会以一个数字来标示出P血清型，并用方括弧内部的一个数字来标示所对应的P基因型。G 血清型的表示方法也很类似，但是G基因型的数字会与G血清型的数字相同。举个例来说， “轮状病毒Wa病毒株”(rotavirus strain Wa)就会被标示成“P1A[8]G1”。因为这两个决定G型跟P型的基因可以被分开传送而产生后代，所以两基因不同的组合就会产生各种不同的病毒株。轮状病毒的基因组包括了 11条独特的核糖核酸双螺旋分子，这11条中总共有 18，555个核苷碱基对。每一条螺旋或是分段即是一个基因，并且依照分子尺寸由大到小依次编号为1到11。每一个基因都可以编码成一种蛋白质，而其中第9基因与第11基因比较特别，它们都可以编码成两种蛋白质。核糖核酸外围则是包围了三层二十面体的蛋白质衣壳。病毒颗粒大约直径76. 5nm，并且没有病毒包膜。有六个病毒蛋白架构了整个病毒颗粒 (病毒体)。这些结构蛋白分别被称为￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4、￥ 6与￥ 7。除了这些结构蛋白之外，还有六个非结构性蛋白(nonstructural protein，NSP)，这六个蛋白仅仅在轮状病毒感染的细胞中制造，而没有构成病毒体的结构。这六个非结构性蛋白分别称为NSP1、NSP2、 NSP3、 NSP4、NSP5 与 NSP6。由轮状病毒基因组所编码的12个蛋白质中，至少6个会与核糖核酸结合。这些蛋白在轮状病毒复制时所扮演的角色目前还没有完全被了解；它们的功用被认为有可能是与病毒体内核糖核酸的合成与包装相关，或是与将信使核糖核酸输送至基因体复制现场相关，或是与信使核糖核酸转译与基因调节相关。结构性蛋白VPl蛋白位于病毒体核心，是一种核糖核酸聚合酶。在被感染的细胞中，这种酶会产生病毒蛋白质合成所需的信使核糖核酸转录复本，以及产生轮状病毒基因体核糖核酸片段拷贝来提供新产生的病毒体使用。
VP2蛋白形成病毒体的核心层，并且结合核糖核酸基因体。VP3蛋白是病毒体内核的一部分，而且是一种称为鸟苷酸转移酶(gimnylyl transferase)的酶。这种酶是一种加帽酶(Capping enzyme)，也就是制作信使核糖核酸转录后修饰时候所用的5'端帽的酶。这个5'端帽保护病毒的信使核糖核酸免受核酸酶(以核酸为底物的水解酶)水解，使之能够保持稳定。VP4蛋白位于病毒体的表面，突出来而成为一个刺突(spike)。它与细胞表面受体结合，与病毒粘附细胞有关。在病毒有传染性之前，VP4蛋白会被一种可以在内脏发现的蛋白酶改变成VP5*蛋白与VP8*蛋白。VP4蛋白决定了该病毒的毒性(Virulence)，而它也决定了该病毒的P血清型。VP6蛋白形成壳体。它是抗原性强的蛋白质，并且可以被用来分辨轮状病毒的种类。这个蛋白质被实验室用来进行轮状病毒A种感染的检测试验中。VP7蛋白是一种构成病毒体外层衣壳的糖蛋白。除了在病毒结构上的功用之外，它也决定该病毒株的G血清型。VP7蛋白质跟VP4蛋白质一样，都是免疫的主要靶标，是防止感染的主要途径。轮状病毒毒株在各地有很大差异，但人类的轮状病毒疾病主要是由5种血清型引起的，其中中国以G1P8和G3P8血清型为主。现在上市的轮状病毒疫苗主要以人-动物重配株和动物减毒株活疫苗为主，这类疫苗应用可以导致肠套叠等严重副反应的发生。由轮状病毒不同血清型产生的感染，疫苗的交叉保护性可能较弱，以及目前疫苗可能产生的严重副反应，强烈需要新的轮状病毒疫苗来满足治疗和预防的需要。发明简述因此，本发明的一个目的是提供一种新血清型的人轮状病毒类病毒颗粒作为轮状病毒感染的候选疫苗分子。在本发明的一个方面，公开了一种人轮状病毒结构蛋白表达盒，包括以下元件(a)起始信号元件AOX ；(b)轮状病毒结构蛋白基因；(C)终止信号元件TT。优选所述轮状病毒VP2由SEQ ID NO 1编码；所述轮状病毒VP4由SEQ ID NO 5 编码；所述轮状病毒VP6由SEQ ID NO 2编码；或所述轮状病毒VP7由SEQID NO :3或SEQ ID NO :4 编码。在本发明的第二个方面，提供了一种用上述表达盒转染的酵母细胞，其特征在于， 所述酵母细胞的染色体内整合有上述表达盒，所述表达盒表达轮状病毒VP2、VP4、VP6和 VP7结构蛋白，所述酵母细胞在甲醇诱导下表达轮状病毒结构蛋白，且所述的轮状病毒结构蛋白在所述酵母中自行装配成类病毒颗粒。在该方面的一个优选例中，酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母。更优选的，酵母细胞选自毕赤酵母GS115菌株和KM71菌株。在该方面的另一个优选例中，表达盒插入PPIC3.涨质粒。本发明的第三个方面提供了一种制备轮状病毒类病毒颗粒的方法，包括步骤(i)在适合表达的条件下，培养上述酵母细胞，从而表达轮状病毒结构蛋白VP2、 VP4.VP6 和 VP7 ；和
(ii)从培养物中分离出类病毒颗粒。本发明的第四个方面提供了用上述方法制备的类病毒颗粒，其由轮状病毒VP2、 VP4、VP6和VP7蛋白组成。在该方面的一个优选例中，VP7蛋白选自Gl或G3血清型。在该方面的另一个优选例中，VP4蛋白是P8血清型。在该方面的另一个优选例中，轮状病毒VP2为SEQ ID NO 8 ；所述轮状病毒VP4为 SEQ ID NO 12 ；所述轮状病毒VP6为SEQ ID NO 9 ；或所述轮状病毒VP7选自SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列。本发明的第五个方面提供了类病毒颗粒的用途，用于制备预防或治疗轮状病毒感染的疫苗组合物。本发明的第六个方面，提供了上述酵母细胞的制备方法，包括步骤a)用上述表达盒插入到pPIC3.涨质粒中，使质粒同时含有轮状病毒VP2、VP4、VP6 和VP7结构基因的表达盒；b)用所述表达轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7的质粒一起转化酵母细胞，整合入酵母染色体中，从而获得上述生产轮状病毒类病毒颗粒的酵母细胞。附图简述
图1显示了重组G1P8酵母菌破菌液的蛋白质印迹分析。其中各泳道为1 阴性酵母菌对照；2 蛋白Marker ；3-6 :1号-4号4个重组G1P8酵母菌的破菌液。图2显示了重组酵母菌的蔗糖密度梯度离心分析。其中各泳道如下1 阴性对照； 2 蛋白标记(Marker) ；3-7 阴性酵母菌梯度离心收样；8 蛋白标记；9 1号酵母菌离心上样原样；10-14 :1号酵母菌梯度离心收样；15 :2号酵母菌离心上样原样；16-20 :2号酵母菌密度梯度离心收样；21 3号酵母菌离心上样原样；22- ，25 蛋白标记；26-27 3号酵母菌密度梯度离心收样；28 4号酵母菌离心上样原样；29-33 4号酵母菌密度梯度离心收样。 其中丨号和4号酵母克隆形成VLP颗粒的可能性较大。图3显示了重组G1P8酵母菌(GS115菌株，1号克隆)的分子筛分析。图4显示了重组G1P8酵母菌(1号克隆)分子筛收样的蛋白质印迹鉴定。各泳道样品如下1 =GlPS酵母菌破菌上清；2 破菌上清超滤浓缩；3 超滤弃液；4 蛋白标记； 5-8 分子筛第一个蛋白峰；9-19 分子筛第二个峰；13 蛋白标记。分子筛的第1个和第2 个蛋白峰收集的样品经蛋白质印迹鉴定，第1个蛋白峰的收样可见轮状病毒VP6蛋白特异性条带G1000)，可能包含形成的VLP ；第2个蛋白峰的收样未见特异性轮状病毒VP6蛋白条带。图5显示了重组G1P8酵母菌(KM71菌株)表达蛋白的分子筛分析。图6显示了重组G1P8酵母菌(KM71菌株)分子筛收样的蛋白质印迹鉴定。其中各泳道样品如下1 :G1P8酵母菌破菌液超滤浓缩(1 5稀释后上样)；2-:GlP8酵母菌破菌液超滤前；3 蛋白标记；4 蛋白标记；5-13 分子筛第一个蛋白峰收样；14 阴性对照；15 蛋白标记；16-23:分子筛第二个蛋白峰收样。破菌液经蛋白质印迹分析，可见分子筛第1和第2个峰均含有轮状病毒VP6蛋白。图7a显示了图3中第一个蛋白峰和图7b显示了图5中第一个蛋白峰的透射电镜观察(X30000)结果。在第一个蛋白峰样品中，均可见直径在50-100nm之间，如箭头所指，
5大小不均一的病毒样颗粒结构。图3和图5的第2个蛋白峰中均未见明显的颗粒结构。
具体实施例方式1.类病毒颗粒通过体外基因重组技术获得的类病毒颗粒(Virus-like particle, VLP)具有天然病毒的外部结构及中和抗原成分，但不包含病毒DNA/RNA，因此VLP在体内不会复制，提高了疫苗应用的安全性，同时，VLP具有极好的免疫原性。由类病毒颗粒组成的亚单位疫苗逐渐成为预防病毒感染的重要候选疫苗分子。现在乙肝病毒和人巨细胞病毒VLP已经通过美国药监局的许可。发明人经过核苷酸及氨基酸同源性比较，选取与国际标准毒株及亚洲毒株同源性较大的中国地方人轮状病毒毒株作为VP2、VP6、VP4(P8血清型)、VP7(G1和G3血清型)的 DNA模板链(见下文表1)，DNA序列根据毕赤酵母密码子使用频率表(见下文表幻进行了调整，构建了含有人轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7蛋白的重组毕赤酵母菌，组成G1P8和G3P8 不同的血清型，并在酵母系统内自我组装成类病毒颗粒(VLP)，对这些VLP进行了研究，作为进一步制备疫苗的工具。1.开发流程下面提供了开发特定血清型的轮状病毒VLP的流程轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7蛋白DNA模板序列的确定一基因优化，全基因合成 —上游构建质粒，电转化入毕赤酵母菌株，形成双层或三层轮状病毒颗粒一诱导表达，及鉴定一VLP的下游纯化2.抗体的制备在获得了完整的特定血清型的类病毒颗粒后，通过纯化回收，这些类病毒颗粒用其接种个体获得保护性免疫。这种免疫方法和验证免疫力的研究可参见下述文献。[1] Offit PA, Dudzik KI.非感染性轮状病毒(RRV株)在小鼠体内诱导的针对轮状病毒感染 ^Ι^Ψ^^&Μ^· (Noninfectious rotavirus (strain RRV) induces an immune response in mice which protects against rotavirus challgenge.)临床微生物学杂志，1989, 27(5) :885-888 ； [2]McNeal MM, Sheridan JF, Ward RL.腹膜内免疫针对小鼠轮状病毒感染的保护作用(Active protection against rotavirus infection of mice following intraperitoneal immunization.)病毒学杂志，1992,191 (1) :150-157 ; [3]Ciarlet Μ, Crawford SE, Barone C，等.轮状病毒亚单位疫苗经胃肠外免疫家兔所诱导的保护性免疫 (Subunit rotavirus vaccine administered parenteralIy to rabbits induces active protective immunity.)病毒学杂志，1998，72 (11) :9233-9246 ； [4] 0，Neal CM, Crawford SE, Estes MK，等，轮状病毒样颗粒经粘膜免疫诱导的保护性应答(Rotavirus virus-like particles administered mucosally induce protective immunity.)病毒学杂志，1997, 71(11) :8707-8717o3.组合物本发明的类病毒颗粒可以与其他组分联合配制成组合物。例如，本发明的类病毒颗粒与佐剂一起混合，或者在施用前混合，或者可以在佐剂之前或之后施用，以提高免疫力。类病毒颗粒还可以与其他的添加成分混合，例如溶剂、抗菌剂、药物学上可接受的载体、脂质体、稳定成分、色素、调味剂等一起混合，以方便施用。4.药盒本发明的类病毒颗粒，以及组合物还可以制成药盒用于施给需要免疫的个体。药盒可含有说明书，以指示施用方案。药盒中的各组分可以放置在不同容器中，也可以是混合的。这些成分可以同时、先后或间隔施用。利用类病毒颗粒免疫个体，以及各种免疫方案都是本领域技术人员水平范围内可以确定的。5.等价物本领域技术人员应，或能确保不超过使用常规实验，来理解本文所述的发明实施方式的许多等价方式。本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都在说明书中以相同的程度引入，如同各独立出版物、专利或专利申请是特别和分开在本文中引入的一样。实施例材料和方法1质粒及菌株pPIC3. 5K质粒(购自Invitrogen)、大肠杆菌toplO、毕赤酵母GS115菌株及毕赤酵母KM71菌株购自hvitrogen公司。2.试齐[JT4 DNA 连接酶、限制性内切酶 EcoR I、Not I、Mlu I、Bgl IKBspE I 禾口 BamH I 购自i^ermentas公司，DNA标记和蛋白标记均为!^ermentas公司产品，DNA凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒为Axygen公司产品，抗VP6单克隆抗体-轮状病毒衣壳(2B4)为Santa Cruz产品，DEAE Sepharose FF层析填料和AKTA纯化系统购自GE公司。实施例1轮状病毒VP蛋白结构基因的优化及合成通过Blast软件分析，经过核苷酸及氨基酸同源性比较，选取与国际标准毒株及亚洲毒株同源性较大的中国地方人轮状病毒毒株作为VP2、VP6、VP4 (P8血清型)、VP7 (Gl和 G3血清型)的DNA模板链(表1)。DNA序列根据毕赤酵母密码子使用频率表(表幻，将目的基因全部同义替换，并去除一些AT富含区，调整GC含量为45-50%。同时将序列中与重组质粒构建有关的酶切位点(EcoR I ,Not I、Mlu I、Bgl II、BspE I和BamH I )进行同义突变。5’端添加Kozak(ACCATG或ACCGCCATG)序列，3’端添加终止密码子。将优化好的各个VP蛋白的结构基因送南京金斯特生物科技有限公司合成。表1人轮状病毒VP结构蛋白模板链的选取_结构蛋白模板_VP2/VP6 蛋白人 Wa 株VP7 蛋白(Gl 血清型)Chi-87 株VP7蛋白(G3血清型)北京97，S48株VP4 蛋白(P8 血清型)97，B53 株_表2毕赤酵母偏好密码子使用表
权利要求
1.一种人轮状病毒结构蛋白表达盒，其特征在于，包括以下元件(a)起始信号元件Α0Χ;(b)轮状病毒结构蛋白基因；(c)终止信号元件TT。
2.如权利要求1所述的人轮状病毒结构蛋白表达盒，其特征在于，所述轮状病毒VP2 由SEQ ID NO :1编码；所述轮状病毒VP4由SEQID NO 5编码；所述轮状病毒VP6由SEQ ID NO 2编码；或所述轮状病毒VP7由SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4编码。
3.一种用权利要求1所述的表达盒转染的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞的染色体内整合有权利要求1的表达盒，所述表达盒表达轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7结构蛋白，所述酵母细胞在甲醇诱导下表达轮状病毒结构蛋白，且所述的轮状病毒结构蛋白在所述酵母中自行装配成类病毒颗粒。
4.如权利要求3所述的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母。
5.如权利要求4所述的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞选自毕赤酵母GS115菌株和KM71菌株。
6.如权利要求3-5任一所述的酵母细胞，其特征在于，所述表达盒插入pPIC3.涨质粒。
7.一种制备轮状病毒类病毒颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(i)在适合表达的条件下，培养权利要求3所述的酵母细胞，从而表达轮状病毒结构蛋白 VP2.VP4.VP6 禾口 VP7 ；禾口( )从培养物中分离出类病毒颗粒。
8.一种用权利要求7所述的方法制备的类病毒颗粒，其特征在于，所述类病毒颗粒由轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7蛋白组成。
9.如权利要求8所述的类病毒颗粒的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗轮状病毒感染的疫苗组合物。
10.权利要求3所述的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤a)用权利要求1所述的表达盒插入到PPIC3.涨质粒中，使质粒同时含有轮状病毒 VP2、VP4、VP6和VP7结构基因的表达盒；b)用所述表达轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7的质粒一起转化酵母细胞，整合入酵母染色体中，从而获得权利要求3所述的生产轮状病毒类病毒颗粒的酵母细胞。
全文摘要
本发明是一种表达轮状病毒类表达颗粒的毕赤酵母、其制备方法及用途，公开了一种人轮状病毒结构蛋白表达盒，包括以下元件(a)起始信号元件AOX；(b)轮状病毒结构蛋白基因；(c)终止信号元件TT。还公开了用其转染的酵母细胞，用该酵母细胞制备轮状病毒类病毒颗粒的方法，以及用该方法制备的类病毒颗粒，其用于制备预防或治疗轮状病毒感染的疫苗组合物的用途。还公开了上述酵母细胞的制备方法。
文档编号C12N15/63GK102465137SQ20101053385
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者张群, 楼觉人, 竺满溢 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司