专利名称：共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和小鼠视 黄酸早期转录因子ι ε (retinoic acid early transcript 1 ε，Rae-I ε )基因的转基因 细胞及其制备方法。
背景技术：
最近发现的一类能够分泌IFN-Y并具有杀伤功能的新型树突状细胞亚群 (IFN- y producing killer dendritic cells, IKDC)兼具 NK 细胞和树突状细胞 (dendritic cells，DC)的表面标记和功能。已有的研究表明，IKDC直接杀伤肿瘤细胞 后，可进一步将肿瘤细胞衍生的肿瘤抗原提呈给T细胞，从而启动抗肿瘤的适应性免疫应 答。因此，IKDC在肿瘤的免疫治疗中具有良好的应用前景。目前获取IKDC主要有两种方 法，一是直接分选法取小鼠相应的淋巴组织，制备成单细胞悬液，通过流式细胞仪(FACS) 的方法直接分选获得⑶llcdimB220+NKl. l+CD49b+的IKDC。但是，IKDC在小鼠体内的含量 极少，只占脾脏⑶Ilc+细胞的1-2% (约5000个)和骨髓⑶Ilc+细胞的2%，用直接分选法获 得的IKDC数量远远不能满足过继免疫治疗所需的细胞数。另一种是体外用白细胞介素15 (IL-15)扩增IKDC 首先常规培养骨髓来源的DC，然后利用磁珠分选法富集CD49b+细胞，再 从⑶49b+细胞中FACS分选出⑶llcdimB220+NKl. I+的IKDC，最后将IKDC与饲养细胞和重组 的IL-15共培养，通过饲养细胞反式提呈IL-15，扩增IKDC，这种体外扩增IKDC的方式不仅 操作繁琐，而且饲养细胞反式递呈IL-15只作用于邻近细胞，缺少递呈的靶向性，实验数据 也显示对IKDC扩增效率比较低(仅能出现10-30倍的数量增长)。因此，如何体外高效扩增 IKDC，成为基于IKDC过继免疫治疗的关键因素
发明内容
本发明通过Rae-I ε /NKG2D的“搭桥”作用(给肿瘤细胞BaF3转染Rae-I基因)， 将肿瘤细胞和IKDC紧密连接在一起，同时给肿瘤细胞转染小鼠膜型IL-15(mbIL-15)基因， 使肿瘤细胞膜上表达IL-15，从而靶向性反式递呈IL-15，达到高效刺激IKDC增殖的目的。本发明所采用的技术方案是首先通过PCR技术克隆小鼠Rae-I ε基因，然后利 用重叠PCR技术将小鼠CDSa分子的信号肽序列、小鼠IL-15成熟肽编码序列和CDSa的 跨膜区和胞内区的编码序列拼接起来，获得膜表达型IL-15的编码基因(命名为mbl5)。将 Rae-I ε基因和mbl5基因分别插入真核表达载体pVITR02-mcS的两个多克隆位点中，构建 成重组真核表达载体pV/mbl5/RAE_l ε。将pV/mbl5/RAE_l ε用脂质体转染法转染BaF3细 胞，通过潮霉素筛选以及FACS分选的方法，获得稳定共表达膜型IL-15和Rae-I ε蛋白的 BaF3 细胞，命名为 BaF3/mbl5/RAE。本发明方法制备的转基因细胞具备以下的优点1.提高了扩增IKDC的靶向性 该转基因细胞可通过其表面的Rae-I ε靶向性作用于表达活化型受体NKG2D的IKDC。2.简化体外IKDC扩增的操作步骤可用该转基因细胞直接扩增常规骨髓来源的DC，然后再通 过FACS分选经扩增后的IKDC，不仅操作步骤减少而且富集率高。3.经济该转基因细胞表 达膜型IL-15，用于扩增IKDC时，不需要购买商品化的重组IL-15。4.实用性强该转基因 细胞除了可以诱导IKDC的活化和增殖外，也可应用于其他既表达NKG2D，又依赖于IL-15生 长的细胞的活化和增殖，如NK细胞。5.延伸性强可在已经获得的转基因细胞的基础上， 再转入其他的关键分子，如共刺激分子，赋予该转基因细胞新的功能。
图1是重组质粒pV/mbl5/RAE_l ε的构建策略。图2是BaF3/mbl5/RAE细胞促进NK细胞高分泌IFN- γ
免疫磁珠法分选脾脏NK细胞与BaF3细胞或BaF3/mbl5/RAE细胞共培养，24小时后收 集培养上清。(A)利用CBA技术检测上清中IFN-Y的分泌水平。(B)IFN-Y的分泌量以 mean士 SD的方式表示，05。图3是BaF3/mbl5/RAE细胞促进NK细胞增殖
图示的刺激细胞与NK细胞共培养，1、3、5天后收集细胞，用APC标记的抗NKl. 1抗体、 FITC标记的抗CD3抗体和7-AAD染色，FACS法计算⑶3_NK1. 1+7_AAD_的活细胞数。
具体实施例方式有关原材料说明
1. CD8 α cDNA为已经发表的序列(NCBI序列号BC030679)。2. IL-15 cDNA 为已经发表的序列(NCBI 序列号NM_008357)。3. RAE-I ε cDNA 为已经发表的序列(NCBI 序列号FJ594067)。4. pVITR02-mcs、pcDNA3. 1(+)和p0RF9-mIL-15真核表达载体为 Invitrogene 公 司的产品。5.含RAE-I ε cDNA的载体pMX-pie由美国加利福尼亚大学Lewiss L Lanier教 授馈赠。6. pcDNA3/RAE-l ε由本室构建。可向公众提供20年。具体构建过程如下用 PCR技术扩增RAE-I ε基因，上下游引物序列如下5，-CAGGGTACCATGGCCAAGGCAGCAGTGACC AA-3’ (SEQ ID NO :8)禾口 5’ -TAAGCGGCCGCTCACATCGCAAATGCAAATGCAAATAAT-3' (SEQ ID NO :9)，上游引物5'端引入Kpn I酶切位点，下游引物5'端引入Not I酶切位点。以质粒 pMX-pie为模板扩增RAE-I ε基因。用Kpn I和Not I对回收纯化的RAE-I ε基因进行双 酶切，经Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化后，亚克隆入pcDNA3. 1 (+)的多克 隆位点中Kpn I和Not I酶切位点之间，得到含RAE-I ε基因的重组载体，命名为pcDNA3/ RAE-I ε 07. Primer STAR PCR扩增试剂盒为大连宝生物公司的产品。8.小鼠原B细胞(BaF3)购自上海麦莎公司。(一)重组真核表达载体pV/mbl5/RAE_lε的构建 (1)用PCR技术扩增RAE-I ε的编码基因。上下游引物序列如下5'-CACAGATCTATGGCCAAGGCAGCAGTGACCAA -3' (SEQ ID Ν0:1)和 5，- GCCCTCGAGTCACATCGCAAATGCAAATGCAA -3，(SEQ ID NO :2)，上游引物 5，端引入 Bgl II酶切位点，下游引物5’端引入Xho I酶切位点。以质粒pcDNA3/RAE-l ε为模板作 为模板扩增RAE-I ε基因。(2)用重叠PCR技术扩增膜型IL-15的编码基因。第一步PCR 上游引物 Pl 为 5’ -ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTG TCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTAACTGGATAGATGTAAGATATGACC-3' (SEQ ID N0:3)，其5，端
引入编码CD8 α信号肽的cDNA片段；下游引物P2为5’ -AGACCCGCCTCC ACCGGACGTGTTGAT GAACATTT-3’ (SEQ ID N0:4)，其5’端引入5个氨基酸长度的Linker编码序列。以含小 鼠IL-15基因的质粒p0RF9-mIL-15为模板扩增。第二步PCR 上游引物 P3 为5，-GGTGGAGGCGGGTCTATTTACATCTGG
GCACCCT -3’ (SEQ ID N0:5)，其5’端引入5个氨基酸长度的Linker编码序列；下游 引物 P4 为5，_ ACTGTCGACTTACACAATTTTCTCTGAAGGTCT -3，(SEQ ID N0:6)，其 5，端引入 Sal I酶切位点。提取⑶8 α + T细胞的总RNA，通过RT-PCR方法获得⑶8 α的全长CDNA， 以⑶8 α的cDNA为模板扩增。第三步PCR 上游引物 P5 为5’ -TCAGGATCCATGGCCTCACCGTTGACCC -3，(SEQ ID NO :7)，其5’端引入BamH I酶切位点。下游引物同前述的P4。以第一步和第二步PCR纯 化回收的产物为模板进行扩增。扩增产物即膜型IL-15的编码基因。上述所有PCR的扩增体系均为50 μ 1 5XPrimer STAR 缓冲液10 μ 1，200 μ mol/L dNTPs，200 nmol/L 正、反向引物，50ng 模板 DNA，2.5 U Primer STAR HS DNA 聚合酶。PCR程序为98°C预变性2 min，98°C变性10 s，68°C退火和延伸lmin，共30个 循环，最后一次延伸68°C 7min。所有扩增产物均用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯 化。(3) pV/mbl5/RAE-l ε 的构建
用BamHI和Sal I对回收纯化的膜型IL-15的编码基因进行双酶切，经Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化后，亚克隆入pVITR02_mcs多克隆位点1中BamHI和Sal I酶切位点之间，得到表达膜型IL-15的重组载体，命名为pV/mbl5。用Bgl II和Xho I对回收纯化的RAE-I ε基因进行双酶切，经Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化后，亚克隆入pV/mbl5多克隆位点2中Bgl II和Xho I酶切 位点之间，得到双表达膜型IL-15和RAE-I ε的重组载体，命名为pV/mbl5/RAE_l ε。(二)稳定共表达膜型IL-15和RAE-I ε的转基因细胞的构建
利用脂质体转染法将pV/mbl5/RAE-l ε转染入BaF3细胞。具体步骤如下取对数期的 BaF3细胞用无血清培养基洗2次，于12孔板中每孔加入2X105个细胞，每孔Iml体系。 取2yg的质粒用无血清的培养液稀释至总量50 μ L，取4yL的脂质体用无血清培养基 稀释至总量50 μ L，两者混合，微混勻，室温孵育20min，每孔加入100 μ L的复合物。 37 ° C 48 h后弃上清，更换含200 μ g/mL潮霉素的完全培养基继续培养。经2_3周后的 潮霉素筛选后，收集细胞，FACS检测BaF3细胞膜表面IL-15和RAE-I ε的表达情况。通 过FACS的分选功能收集共表达IL-15和RAE-I ε的BaF3细胞，继续培养。3_4周后再次 FACS验证转基因细胞表面IL-15和RAE-I ε的共表达，最终获得稳定共表达膜型IL-15和 RAE-I ε 的转基因细胞 BaF3/mbl5/RAE。
(三)转基因细胞的应用
将BaF3/mbl5/RAE-l ε细胞与NK细胞共培养，检测其对NK细胞增殖和IFN-γ分泌的 影响。具体步骤如下用丝裂霉素(终浓度30 μ g/mL)作用于BaF3/mbl5/RAE细胞，37° C Ih后，用无菌的PBS洗涤细胞三次，作为刺激细胞备用；利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏来源 的NK细胞；将IX IO5个BaF3/mbl5/RAE细胞与NK细胞以1 :1的比例共培养，24h后收集 培养上清，用BD公司的CBA法检测上清中IFN-Y的分泌情况。此外，在共培养后的ld、3d 和5d分别收集细胞，用APC标记的抗NKl. 1抗体、FITC标记的抗⑶3抗体和7-AAD对细胞 进行染色，FACS法检测⑶3—NK1. l+7-AAD-的活细胞数量。以丝裂霉素处理后的BaF3细胞作 为对照细胞。结果如图2所示，与BaF3细胞相比，BaF3/mbl5/RAE细胞能促进NK细胞分泌 更高水平的IFN- γ ；此外，与BaF3细胞相比，BaF3/mbl5/RAE细胞能明显促进NK细胞的增 殖，并且随着培养时间的延长，单独培养的NK细胞和与BaF3共培养的NK细胞逐渐凋亡，而 与BaF3/mbl5/RAE共培养的NK细胞仍能明显增殖(图3)。以上结果表明，共表达膜型IL-15和RAE-I ε的BaF3/mbl5/RAE转基因细胞，可用 于体外高效扩增表达NKG2D的NK细胞，同时增强了 NK细胞的生物学活性。该结果为我们 进一步利用BaF3/mbl5/RAE细胞高效扩增和活化既表达NKG2D，又依赖于IL-15生长的免疫 细胞(如IKDC)提供了实验依据，从而为肿瘤的细胞过继免疫治疗提供研究工具。
权利要求
一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae 1ε的转基因细胞，其特征在于，是能稳定共表达膜型IL 15和Rae 1ε蛋白的转基因细胞BaF3细胞。
2.制备权利要求1所述共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-Iε的转基因细胞的方 法，其特征在于，是先利用PCR克隆小鼠Rae-I ε基因，然后利用重叠PCR将小鼠⑶8 α分 子的信号肽序列、小鼠IL-15成熟肽编码序列和CD8 α的跨膜区和胞内区的编码序列拼接 起来，获得膜表达型IL-15的编码基因mbl5 ；将Rae-I ε基因和mbl5基因分别插入真核表 达载体pVITR02-mcs的两个多克隆位点中，构建成重组真核表达载体pV/mbl5/RAE-l ε ；再 将pV/mbl5/RAE-l ε用脂质体转染法转染BaF3细胞，通过潮霉素筛选以及FACS分选的方 法，获得稳定共表达膜型IL-15和Rae-I ε蛋白的转基因细胞。
全文摘要
本发明涉及涉及一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞及其制备方法。所说的转基因细胞能稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的转基因细胞BaF3细胞。它可通过下述方法制备利用PCR技术扩增了小鼠Rae-1ε基因和小鼠膜表达型的IL-15基因，将它们分别插入到真核表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点，获得重组载体，将重组载体转染小鼠肿瘤细胞株BaF3，经抗生素筛选和流式细胞仪分选后，获得转基因细胞。该转基因细胞可为IKDC提供三重的刺激信号，作为体外高效扩增和活化IKDC的工具。此外，该转基因细胞还可以用于抗肿瘤的免疫治疗研究。
文档编号C12N5/10GK101988049SQ20101053437
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者季明春, 段秋芳, 潘兴元, 田芳, 钱莉, 龚卫娟 申请人:扬州大学