专利名称：利用亚硝酸盐进行反硝化的脱氮菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种能够利用亚硝酸盐进行反硝化脱氮的微生物菌剂及其制备方法，该方法可以实现用于短程反硝化处理微生物的产业化、商品化。
背景技术：
短程硝化-反硝化又称亚硝酸型生物脱氮技术，就是将硝化过程控制在NO2-N阶段而终止，随后进行亚硝酸盐反硝化脱氮，与传统生物脱氮技术相比，短程硝化-反硝化生物脱氮技术能缩短水力停留时间，可节省25%的能耗和40%的碳源，同时可以减少剩余污泥处理量。作为一种新型的生物脱氮技术成为污水处理领域的研究热点之一。目前，短程硝化反硝化主要采用悬浮活性污泥法，由于系统内污泥浓度低，存在反应器效率低、运行条件较苛刻等问题，出现亚硝酸盐积累后如何维持其长期稳定存在是短程生物脱氮技术的关键。通常情况下氨氧化过程形成的亚硝酸盐可以完全被氧化成硝酸盐。虽然通过控制温度、溶解氧、PH和污泥龄等外界条件能够导致硝化过程中HNO2积累，但大多数都处在实验室研究阶段，目前的研究结果表明，只有高温的控制手段可以达到较好的稳定性。有些条件如高温等在实际工程中也难以实现，所以到目前为止，经NO2--N途径在实际工程中实现生物脱氮的成功应用并不多见。只有荷兰Delft技术大学开发的SHARON 工艺仅用来处理污水处理厂中污泥消化液。CN200610023388. 2公开了一种利用颗粒污泥进行亚硝酸盐脱氮的方法，本发明虽然具有系统内污泥浓度高、反应器效率高、工艺简单等优点，但反硝化颗粒污泥需要在 15-30°C条件下培养30-90天后才能获得，所处理废水中的亚硝酸氮浓度为10-200mg/L。如果脱氮系统启动时直接投加以NO2-N为最终电子受体的微生物菌剂，则可以大大缩短系统的启动时间，能大幅度提高系统的脱氮速率，还能够有效控制硝化反应进程，在外界条件如溶解氧波动的情况下也能实现稳定的短程硝化反硝化。因此依靠微生物本身来控制反应进程是稳定实现短程硝化反硝化脱氮技术的适宜手段。菌剂是一种混合菌培养体系，可利用其中的多种微生物单独或多种之间的协同作用来高效降解目标污染物。CN1010M814A公开了一种异养氨氧化菌剂的制备方法及其应用，该菌剂涉及三株异养氨氧化菌 H9 (CGMCC NO. 1010)、HlO (CGMCC NO. 1011)、H13 (CGMCC NO. 1006)。该菌剂用于含氨氮废水的处理，具有提高硝化效率、解除高C0D/N对硝化的抑制作用、快速启动硝化池等优点。CN101302485A公开了一种异样硝化微生物菌剂、其培养方法和用途。以上菌剂不涉及利用亚硝酸盐进行反硝化。CN200510130900. 9公开了一种处理稠油污水的微生物菌剂及制备方法中涉及球型节杆菌，该菌剂主要用于降解稠油污水中的难降解有机污染物；CN1368483A公开了一种生物强化技术处理油制气废水的方法中涉及黄杆菌属，该方法使难降解的芳香族化合物得到有效降解，同时去除氨氮。CN200910021020. 7 公开了一种降氨氮和亚硝酸氮的水质改良微生态制剂的制备方法，该菌剂中涉及一株节杆菌CGMCCN0. 1观2，但该发明的微生态制剂属于水产养殖技术及生态环境保护技术领域。到目前为止尚未见节杆菌和黄杆菌组合制备的脱氮菌剂用于处理工业废水中亚硝酸盐氮的报道。
发明内容
针对现有短程硝化反硝化工艺中硝化反应进程难以稳定控制、脱氮效率低等问题，本发明从负责脱氮的微生物入手，提供一种利用亚硝酸盐进行反硝化的脱氮菌剂。该微生物菌剂在提高脱氮效率的同时能够有效控制硝化反应进程，还可以有效去除废水中的有机污染物。本发明利用亚硝酸盐进行反硝化脱氮的微生物菌剂，微生物菌剂包括节杆菌 (Arthrobacter creatinolyticus)FDN-I 禾口水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii) FDN-2，节杆菌FDN-I于2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO. 3657 ；水氏黄杆菌FDN-2于2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO. 3659。本发明菌剂中的节杆菌FDN-I菌落颜色为黄色、菌株个体呈棒状，无芽孢，能运动；革兰氏染色为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用多种碳源。水氏黄杆菌FDN-2菌落颜色为白色、菌株个体呈杆状，无芽孢；革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。本发明菌剂中的节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2在有氧和缺氧环境下均能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，在脱氮的同时能去除COD。本发明两个菌株的液体培养基为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaNO2 :lg/L，固体培养基加入2%的琼脂。菌株的培养条件为在温度为30 35°C、150 MOrpm震荡培养至对数期即可收获菌体用于制备微生物菌剂。本发明菌剂中两种菌的含量可以按照任意比例混合，优选节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2的菌体体积比为0. 2 1 1 5。节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2可以单独培养为菌体，然后按菌体体积为0.2 1 1 5的比例混合为菌剂；也可以单独培养种子液，然后两种菌的种子液按体积比0.2 1 1 5的比例混合进行放大培养得到菌剂。 微生物菌剂中还可以含有适宜的添加剂，如营养物质、保藏助剂等。本发明微生物菌剂应用于废水亚硝盐反硝化脱氮过程，可以直接投加到污水处理厂活性污泥中使用，也可以在适宜的生化反应器内处理含高浓度氨氮和COD的废水。本发明微生物菌剂可高效利用亚硝酸盐脱氮，及时降低硝化细菌的利用底物，限制了硝化细菌将亚硝酸盐进一步转化为硝酸盐的过程。本发明处理含氨废水微生物菌剂的一种具体制备方法包括以下内容1、将本发明节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2分别接种于固体培养基上进行活化；2、用接菌环刮一环菌液接种于牛肉膏蛋白胨液体培养液中，在温度25 35°C、 150 MOrpm好氧条件下震荡培养1 3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液；3、将上述种子液放大培养后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。本发明微生物菌剂所涉及微生物的菌体活化和种子液培养所用的培养基配方牛肉膏3 7g/L，蛋白胨7 13g/L，NaNO2 :0. 8 1. 5g/L，固体培养基加入1. 5 2. 5%的琼脂。
本发明微生物菌剂放大培养所用的培养液可以是自配或者实际的含亚硝酸盐氮废水，培养液中的亚硝氮浓度为100mg/L 1000mg/L，碳氮质量比2 1 10 1 ；培养条件为温度15°C 35°C ；pH6. 5 10. 0 ；溶解氧低于1. 0mg/L。本发明所用的放大培养反应器可以是各种适宜结构，具有良好的曝气和搅拌系统。培养过程中PH值不需要调节。上述放大培养的菌体浓缩后得到浓度较高的菌悬液，将这些菌悬液加入营养液或者营养液和保护剂的混合液后可以制备成液态菌剂，也可以利用本领域现有的方法制备成干粉状的菌剂。可以采用塑料袋、塑料瓶或者塑料桶等耐储存、防冻、便于运输等材质的容器或者设备进行包装。包装方法采用本领域现有常规技术，包装量为50 5000g/包(袋或者瓶)包装后的菌剂可以根据具体情况在室温或者低温条件下保存。室温保存保质期为 1 6个月，低温保存保质期为1 5年，保存后活性降低率小于10%。本发明所用的浓缩方法可以通过离心或者过滤等不影响菌体活性的方法。本发明菌剂制备过程首先进行菌体活化；然后进行种子液培养，最后将种子液放大培养后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。所获得的微生物菌剂耐受性和适应性强，抗冲击性好，总氮的去除负荷高、处理效果好；可以直接投加到污水处理系统中或者与活性污泥混合或者在各种填料上挂膜后处理废水，使用性能好；经过一定时间保藏的微生物菌剂恢复速度快，生物活性高，可实现脱氮微生物的产业化、商品化。本发明微生物菌剂由节杆菌(Arthrobacter creatinolyticus)FDN_l和水氏黄杆菌(FlavcAacterium mizutaii)FDN-2菌株组成。在含氮废水处理过程中，特别是以短程硝化为主的微生物处理过程中，这两种微生物互相配合、互相竞争底物，总氮去除速率高于任何一种微生物单独使用时的去除速率，由于群体效应所以对废水的耐受冲击能力比纯化的菌体强、对废水水质的适用范围宽，能有效促进反硝化的进程，使得废水脱氮效果明显提尚ο
具体实施例方式本发明提出了一种微生物菌剂及其应用。本发明液态菌剂生长速度快，收集量大， 菌剂具有较强的耐受性和适应性，具有较好的抗冲击性；可以实现短程硝化反硝化脱氮微生物的产业化、商品化。实施例1微生物菌剂的制备1、将本发明节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上在温度为30°C恒温培养箱中进行活化，培养基配方为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L， NaNO2 :lg/L，加入 2. 0% 的琼脂。2、用接菌环刮一环固体菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养液中，在温度25 35°C、 150 MOrpm好氧条件下震荡培养1 3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液；培养基配方为牛肉膏5g/L，蛋白胨:10g/L, NaNO2 :lg/L。3、将上述节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2种子液按照1 1和0. 5 1两种比例组合分别在具有良好搅拌系统的反应器中进行放大培养，培养液中的亚硝氮浓度为200mg/ L 800mg/L，碳氮质量比2 1 10 1 ；培养条件为温度25°C ;pH6. 5 10. 0 ； 溶解氧低于1. 0mg/L。
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对经过放大培养获得的液态菌悬液A(种子液混合比例1 1)和B(种子液混合比例0.5 1)进行收集、浓缩，然后加入菌悬液两倍体积的营养液。每升营养液中N02-je2+、 Mg2+、K+、Ca2+这五种阳离子的摩尔配置比例为2000 5 20 20 15，再加入菌悬液体积2. 5%的保藏剂后分装到500ml的塑料瓶中，置_70°C条件下保存备用。实施例2本发明菌剂在氮肥废水脱氮过程中的应用取一定量实施例1获得的菌悬液A和菌悬液B按照15%的接种量分别接种到两个反应器内，在温度30°C、pH 7. 7、DO (溶解氧)为0. 2 0. 9mg ·厂1条件下，处理氮肥生产过程中产生的含氨废水的短程硝化反应出水，该水中Ν02_-Ν平均为700mg/L、CODtt平均为2150mg/L。共处理10批次，每一批次的反应时间均低于Mh，经过处理后出水Ν02__Ν和 COD浓度分别为0. 2mg/L 5. 7mg/L、38mg/L 49mg/L，N(V-N和COD去除率分别大于99% 和93%。总氮去除速率分别可达35. 21mg/(L-h)和33. 19mg/(L-h)。而在接种量相同的情况下，单独使用FDN-I处理亚硝氮浓度为628mg/L的废水时，总氮去除速率为26. 17mg/ (L · h)，单独使用FDN-2处理亚硝氮浓度达39ang/L的废水时总氮去除速率为16. 33mg/ (L · h)。由此可见两种菌株混合制备的菌悬液对总氮的去除效果好。实施例3本发明菌剂在催化剂废水脱氮过程中的应用实验在3个100L的SBR反应器中进行，以甲醇作为碳源进行补加，使得碳氮质量比为3 1。首先在三个反应器中加入相同浓度的硝化活性污泥，其中一个补加实施例1的菌悬液B，一个补加相同体积的FDN-2菌液，另一个只加活性污泥。处理时间均低于Mh。从表1的效果比较来看，只加活性污泥时，氨氮和总氮的去除率分别为77.8%和 43. 7%，补加FDN-2菌液后总氮的去除率提高到62. 8%补加菌悬液B后总氮去除率进一步提高到71.5%，可见补加菌悬液B后脱氮效果最好，总氮的去除率比只有活性污泥时提高了 27. 8%，同时氨氮的去除率也有小幅度提高。表1加菌剂和不加菌剂对废水的脱氮效果比较
权利要求
1.一种利用亚硝酸盐进行反硝化脱氮的微生物菌剂，其特征在于微生物菌剂包括节杆菌(Arthrobacter creatinolyticus)FDN_l 禾口水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii) FDN-2 ；节杆菌FDN-I于2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCN0. 3657 ；水氏黄杆菌FDN-2于2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO. 3659。
2.按照权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于所述的节杆菌FDN-I菌落颜色为黄色、菌株个体呈棒状，无芽孢，能运动。
3.按照权利要求1或2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的节杆菌FDN-I革兰氏染色为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用多种碳源。
4.按照权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于所述的水氏黄杆菌FDN-2菌落颜色为白色、菌株个体呈杆状，无芽孢。
5.按照权利要求1或4所述的微生物菌剂，其特征在于所述的水氏黄杆菌革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。
6.按照权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2 在有氧和缺氧环境下均能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，在脱氮的同时能去除COD。
7.按照权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2 培养至对数期收获菌体制备微生物菌剂。
8.按照权利要求1或7所述的微生物菌剂，其特征在于节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌 FDN-2的菌体体积比为0. 2 1 1 5。
9.按照权利要求1或7所述的微生物菌剂，其特征在于节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌 FDN-2单独培养为菌体然后按菌体体积为0.2 1 1 5的比例混合为菌剂；或者分别单独培养节杆菌FDN-I和水氏黄杆菌FDN-2种子液，然后两种菌的种子液按体积比0.2 1 15的比例混合进行放大培养得到菌剂。
10.权利要求1至9任一权利要求所述微生物菌剂应用于废水亚硝盐反硝化脱氮过程， 直接投加到污水处理厂活性污泥中使用，或者在适宜的生化反应器内处理含高浓度氨氮和 COD的废水。
全文摘要
本发明公开了一种利用亚硝酸盐进行反硝化脱氮的微生物菌剂，其特征在于微生物菌剂包括节杆菌(Arthrobacter creatinolyticus)FDN-1和水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2；节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2保藏登记号分别为CGMCC NO.3657和CGMCC NO.3659。该微生物菌剂能以亚硝酸盐作为电子受体进行反硝化脱氮，在脱氮的同时还能有效脱除废水中的COD，废水处理效果好，脱氮速率快，能够稳定控制短程反硝化的进程，真正实现短程硝化反硝化脱氮。
文档编号C12N1/20GK102465101SQ20101053600
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者刘忠生, 李志瑞, 许谦, 高会杰, 黎元生 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院