专利名称：猪瘟活疫苗的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用活疫苗的生产方法，尤其涉及一种猪瘟活疫苗的制备方法以及由该制备方法得到的产品，属于猪瘟活疫苗的生产领域。
背景技术：
猪瘟(Hog ch0lera，HC)是由猪瘟病毒引起的一种高度接触传染性疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疾病名录，为法定必需报告的传染病。在我国，猪瘟是重大疫病之一，在《一、二、三类动物疫病病种名录》中将猪瘟列入一类17种动物疫病之一，猪瘟的爆发流行给世界和我国的养猪业造成严重经济损失。疫苗是控制猪瘟的重要手段，包括灭活疫苗和弱毒疫苗。各国都在努力研究安全有效的疫苗。经过多年应用，公认安全有效，没有残余致病力的弱毒疫苗株有三种①中国兔化弱毒疫苗；②日本GPE细胞弱毒疫苗；③法国“Thiveosal”冷变异弱毒株。其中中国学者研制成功的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在我国广泛应用外，并已推广到欧亚很多国家，使这些国家控制或消灭了猪瘟。该疫苗被公认为目前世界上比较理想的猪瘟疫苗。将猪瘟兔化弱毒接种于犊牛睾丸细胞制备而成的猪瘟细胞苗，具有生产成本低， 便于工厂化生产，不良反应少等优点，缺点是用牛睾丸细胞培养猪瘟兔化弱毒(HCLV)，毒价不稳定，批间差异很大，兔检合格的产品，最高和最低毒价相差甚远，且生产过程中使用牛睾丸、牛血清，有污染牛病毒性腹泻病毒的可能性，引起免疫失败。疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标，HCLV在细胞中的增殖力较弱，不产生致细胞病变，对其效价的测定一直沿用兔体定型热反应法(兔热法)。但该法存在的突出不足是兔热法测毒属于一种非特异性反应，用其测毒不能准确定量，测毒结果易受兔体个体差异和天气条件影响，试验周期长、费时费力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服猪瘟细胞苗的生产所存在的不足，提供一种新的猪瘟活疫苗的制备方法，该方法能够快速、准确的测定疫苗效价，所制备的疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种猪瘟活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、将猪瘟活疫苗生产种毒接种猪源传代细胞系，筛选得到猪瘟弱毒疫苗株；(2)、将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖；(3)、采用免疫荧光方法测定增殖病毒悬液的(TCID5tl)毒价J4)、向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，即得。本发明针对猪瘟细胞苗在生产中所存在的一系列问题，从经过如下几个阶段进行改进(1)、猪源传代细胞系的筛选与鉴定将猪瘟兔化弱毒接种不同猪源传代细胞系，至 37°C培养4 5日，收获病毒，将收获病毒传代，应用免疫荧光方法对接种不同猪源传代细胞系的各代次病毒进行检测，检测结果显示猪瘟兔化弱毒可在PT细胞系、MPK细胞系、SK6 细胞系、PK 2a细胞系、CPK细胞系、RKC细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、CRFK细胞系、 Vero/slam细胞系、Vero_E6细胞系、Marc_145细胞系、BHK细胞系、BGM细胞系或DK细胞系上增殖。O)、毒种的制备将猪瘟兔化弱毒在PT细胞系上进行传代，适应PT细胞系。应用有限稀释法进行两轮克隆纯化，筛选到一株合适的猪源传代细胞系的猪瘟弱毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No. 3891 ；分类命名是猪瘟病毒；保藏时间是2010年5月27日； 保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(3)免疫荧光方法的建立应用抗CSFV 单克隆抗体建立免疫荧光方法，应用此方法进行病毒TCID5tl的测定。优选的，步骤(1)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量(MOI)O. 1-0.5接种到PT 单层细胞系上进行培养，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过 5次。步骤(3)中采用免疫荧光方法测定增殖病毒的(TCID5tl)毒价时，所采用的单克隆抗体优选为抗CSFV单克隆抗体(北京健翔和牧生物科技有限公司对外有售)，所采用的标记物优选为FITC或IPMA ；所用到的固定液优选为预冷的80%丙酮、10%甲醛或75%乙醇。 更优选的，所述的免疫荧光方法包括以下步骤(1)细胞传代，准备细胞培养板选取生长良好的PT细胞，经胰酶-EDTA消化后， 加入细胞生长液制备细胞悬液，应用台盼兰稀释计数，调整细胞密度为2. 5 3. 5 X IO5个/ ml,以IOOul/孔接入96孔细胞培养板；(2)疫苗毒样品的稀释将要滴定的猪瘟活疫苗病毒悬液作10倍倍比稀释，注意在从上一个稀释度移至下一个稀释度时要更换吸头，每次稀释均要漩涡混勻；(3)病毒接种接入100 μ 1样本，每个稀释度6 8个重复。加入100 μ 1培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照。盖上盖子在37°C 士 1°C，4 6% CO2培养箱中培养3 5天；(4)免疫荧光检测①倾去板子中的液体于强碱性溶液中，用PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加 50 100 μ L预冷的固定液(80%丙酮或10%甲醛或75%乙醇)固定20min ；②直接免疫荧光PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的FITC标记抗CSFV单克隆抗体50 μ L，置湿盒中37°C孵育30 45min，去除抗体，用PBST洗涤3次；③间接免疫荧光PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的抗CSFV单克隆抗体50 μ L，置湿盒中37°C孵育45 60min，去除一抗，用PBST洗涤3次，每孔加入工作浓度的FITC标记抗鼠二抗(SIGMA) 50 μ L，闭光37°C孵育30 45min，去除二抗，用PBST 洗涤3次；④在荧光显微镜下观察有无特异性荧光斑出现，记录于试验记录纸上并应用 Spearman Karber方法计算病毒滴度；(5)结果有效的判定所有试验中阴性孔荧光阴性；参考对照必须在正常的范围内；如果样本在最小稀释度阳性孔低于50%或在最高稀释度阳性孔高于50%，可报告结果低于或高于该滴度50%。本发明用细胞系替代牛睾丸原代细胞制造猪瘟活疫苗，可解决牛源外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。用细胞系生产猪瘟活疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、 成本低等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性。此外，本发明采用单克隆抗体的免疫方法检测猪瘟细胞毒液病毒含量，检测敏感，快速，特异，准确，重复性高，结果可靠。利用本发明生产并应用新型冻干保护剂配制的猪瘟活疫苗冻干后疫苗可在4°C保存。经生产，检验，保存的一系列改善，可以大大提高猪瘟活疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示， 本发明所制备的猪瘟活疫苗对猪瘟强毒攻击可100%保护。
图1猪瘟活疫苗免疫荧光检测结果；A 阴性对照，B 疫苗检测样品。图2免疫荧光检测猪瘟活疫苗毒价的敏感性试验结果。图3免疫荧光检测猪瘟活疫苗毒价的特异性试验结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1猪源传代细胞系的筛选与鉴定将猪瘟兔化弱毒接种不同猪源传代细胞系，至37°C培养4 5日，收获病毒，将收获病毒传代，应用免疫荧光方法对接种不同猪源传代细胞系的各代次病毒进行检测，检测结果显示猪瘟兔化弱毒可在PT细胞系、MPK细胞系、SK6细胞系、PK 2a细胞系、CPK细胞系、RKC细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、CRFK细胞系、Vero/slam细胞系、Vero-E6细胞系、Marc-145细胞系、BHK细胞系、BGM细胞系或DK细胞系上增殖。本发明是用细胞系(PT、 MPK、SK6、PK 2a、CPK、RKC、MDBK, MDCK, CRFK, Vero/slam、Ver。_E6、Marc-145, BHK, BGM 或 DK)培养猪瘟兔化弱毒，收获细胞病毒液，采用免疫荧光法测定增殖病毒悬液的毒价，向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，制成猪瘟传代细胞苗。实施例2用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法(1)制苗用细胞的传代与培养PT细胞系经胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，一比五进行传代。以细胞生长液于37°C继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；(2)细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3%的病毒悬液，接种生长良好的PT细胞系单层，置37°C继续培养。隔5日收获细胞培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种鉴定细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每Iml含病毒> 100，000个家兔感染量；(3)制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的PT细胞系培养瓶，弃去营养液，接种含3%生产用细胞毒种(在转瓶中培养，细胞密度达到5-10X107ml ；在生物反应器中添加附着载体的悬浮培养或无载体的悬浮培养，细胞密度达到5-10X107_8/ml ；固定化培养将上述细胞系与水不溶性载体(纸片、无纺聚酯纤维载片)结合进行培养，细胞密度达 5-10X107_8/ml)，置37°C继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005 年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用， 各收次病毒培养液分别用家兔测定，每Iml含病毒> 100，000个家兔感染量；上述所用营养液的配方是92% DMEM液、5-8%犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7. 0。上述所用维持液的配方是95% DMEM液、3. 5_5%犊牛血清、加适量的抗菌素， PH值调整为7.2。试验例1应用单克隆抗体的免疫荧光方法检验猪瘟活疫苗的病毒滴度1、细胞传代，准备细胞培养板选取生长良好的PT细胞，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，应用台盼兰稀释计数，调整细胞密度为2. 5 3. 5X IO5个/ ml,以IOOul/孔接入96孔细胞培养板；2、疫苗毒样品的稀释将要滴定的猪瘟活疫苗病毒悬液作10倍倍比稀释，注意在从上一个稀释度移至下一个稀释度时要更换吸头，每次稀释均要漩涡混勻；3、病毒接种接入IOOul病毒样本，每个稀释度6 8个重复。加入IOOu 1培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照。盖上盖子在37°C 士 1°C，4 6%0)2培养箱中培养3 5天；4、免疫荧光检测①倾去板子中的液体于强碱性溶液中，用PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加 50 100 μ L预冷的固定液(80%丙酮或10%甲醛或75%乙醇)固定20min ；②直接免疫荧光PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的FITC标记抗CSFV单克隆抗体50 μ L，置湿盒中37°C孵育30 45min，去除抗体，用PBST洗涤3次；③间接免疫荧光PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的抗CSFV单克隆抗体50 μ L，置湿盒中37°C孵育45 60min，去除一抗，用PBST洗涤3次，每孔加入工作浓度的FITC标记抗鼠二抗(SIGMA) 50 μ L，闭光37°C孵育30 45min，去除二抗，用PBST 洗涤3次；④在荧光显微镜下观察有无特异性荧光斑出现，记录于试验记录纸上并应用 Spearman Karber方法计算病毒滴度；(5)结果有效的判定所有试验中阴性孔荧光阴性；参考对照必须在正常的范围内；如果样本在最小稀释度阳性孔低于50%或在最高稀释度阳性孔高于50%，可报告结果低于或高于该滴度50%。试验例2猪瘟病毒培养条件的优化试验1 方法1. 1接毒方式研究1. 1. 1同步接种选用生长良好的PT细胞2转瓶消化，按1 3进行传代，其中1瓶作为阴性对照，2瓶传代后以MOI值0. 1接种病毒，置37°C转瓶机内进行培养，接种5日后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID5tl)。1. 1. 2单层接种1. 1. 1消化传代的细胞中，2瓶待细胞长满单层后以Μ0Ι0. 1接种猪瘟病毒，加入维持液，置37°C转瓶机内进行培养，接种5日后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID5tl)。1. 2M0I 研究
选用生长良好的PT细胞，按MOI值0. 01，0. 05，0. 1,0. 3和0. 5接入病毒液，每个
MOI值接种2个转瓶，同时设一个转瓶为阴性对照。接种5日后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID5tl)。1. 3病毒收获时间，收获次数的研究 选生长良好的PT细胞，按MOI值0. 1加入猪瘟病毒液，分别在接毒后第1日，2日， 3日，4日，5日取上清样品，测定病毒含量(TCID5tl),在接毒后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液一次，于每个收次每天取上清样品，测定病毒含量(TCID5tl),收获不超过5 个收次。2试验结果2. 1接毒方式研究结果表明，单层接毒方式猪瘟病毒滴度高于同步接毒方式，详见表1。表1同步与单层接种比较结果
权利要求
1.一种猪瘟活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、培养猪源传代细胞系；( 、将猪瘟活疫苗生产种毒接种培养好的猪源传代细胞系，筛选得到猪瘟弱毒疫苗株；(3)、将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖；⑷、采用免疫荧光方法测定增殖病毒悬液的毒价；(5)、向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的猪源传代细胞系的培养方式为单层贴壁培养、悬浮培养或固定化培养。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的猪源传代细胞系包括但不限于PT细胞系、MPK细胞系、SK6细胞系、PK 2a细胞系、CPK细胞系、RKC细胞系、 MDBK细胞系、MDCK细胞系、CRFK细胞系、Vero/slam细胞系、Vero-E6细胞系、Marc_145细胞系、BHK细胞系、BGM细胞系或DK细胞系。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤O)中所述猪瘟弱毒疫苗株的微生物保藏号是CGMCC No. 3891。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤O)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量0. 1-0. 5接种到培养好的猪源传代细胞系上进行培养。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤O)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量0. 1-0. 5接种到培养好的猪源传代细胞系上进行培养，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过5次。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤中采用免疫荧光方法测定增殖病毒的毒价时，所采用的单克隆抗体为抗猪瘟病毒单克隆抗体；所采用的荧光标记物为FITC或IPMA ；所用到的固定液为预冷的80%丙酮、10%甲醛或75%乙醇。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤中采用免疫荧光方法测定增殖病毒的毒价时，其步骤包括(1)细胞传代，准备细胞培养板选取生长良好的猪源传代细胞系，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，应用台盼兰稀释计数，调整细胞密度为2. 5 3. 5 X IO5个/ml，以IOOul/孔接入96孔细胞培养板；(2)疫苗毒样品的稀释将要滴定的猪瘟活疫苗病毒悬液作10倍倍比稀释；( 病毒接种接入100 μ 1样本， 每个稀释度6 8个重复；加入100 μ 1培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照； 盖上盖子在37°C 士 1°C，4 6% (X)2培养箱中培养3 5天；(4)免疫荧光检测①倾去板子中的液体于强碱性溶液中，用PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加50 100 μ L预冷的固定液固定20min ；②直接免疫荧光PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的 FITC标记CSFV单克隆抗体50 μ L，置湿盒中37°C孵育30 45min，去除抗体，用PBST洗涤 3次；③间接免疫荧光PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的CSFV单克隆抗体50 μ L，置湿盒中37°C孵育45 60min，去除一抗，用PBST洗涤3次，每孔加入工作浓度的FITC标记抗鼠二抗50 μ L，闭光37°C孵育30 45min，去除二抗，用PBST洗涤3次；④在荧光显微镜下观察有无特异性荧光斑出现，记录于试验记录纸上并应用Spearman Karber 方法计算病毒滴度；(5)结果有效的判定所有试验中阴性孔荧光阴性；参考对照必须在正常的范围内；如果样本在最小稀释度阳性孔低于50%或在最高稀释度阳性孔高于50%，报告结果低于或高于该滴度50%。
9.由权利要求1-8任何一项制备方法得到的猪瘟活疫苗。
10.权利要求9所述的猪瘟活疫苗在制备预防或治疗猪瘟生物制品中的用途。
全文摘要
本发明公开了猪瘟活疫苗的制备方法及其产品，其制备方法包括(1)培养猪源传代细胞系；(2)将猪瘟活疫苗生产种毒接种猪源传代细胞系，得到猪瘟弱毒疫苗株；(3)将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖；(4)采用免疫荧光方法测定增殖病毒悬液的毒价；(5)向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥。本发明用细胞系生产猪瘟活疫苗，各批间质量差异小，具有工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性。此外，本发明采用免疫荧光方法测定增殖病毒悬液的毒价，检测敏感，快速，特异，准确，重复性高，结果可靠。本发明所制备猪瘟活疫苗对猪瘟强毒攻击可100％保护。
文档编号C12N7/08GK102294029SQ201010536418
公开日2011年12月28日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年6月28日
发明者夏铭崎, 张淑琴, 武华 申请人:北京华威特生物科技有限公司