专利名称：一种荧光定量pcr反应液及荧光定量pcr方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法，特别是用于长核苷酸片段的定量PCR反应液和方法。
背景技术：
荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR，也称为定量 PCR，简称为 QPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR根据化学原理的不同可分为探针法和染料法。其中Taqman荧光定量技术以Taqman荧光探针为基础。Taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ _3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，Taq聚合酶的5’_3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强(Heid，C.A.，J. Stevens, K. J. Livak, et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Res, 1996,6 :986-994.)。Taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量PCR实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90% 110% )，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。而扩增效率低会影响实验的精确性、重复性和灵敏度。正是由于实验对扩增产物大小这种特殊的要求，导致荧光定量PCR实验用于长片段扩增产物的定量受到很大的限制。举个例子来说，按照illumina公司solexa测序平台提供的《ft·印aring 2_5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing)) (Part#1005363Rev. B)构建 Pair End 文库，在制备DNA簇(Clusters)前需要对I^ir End文库进行浓度测定，然后选择合适的文库上机浓度，期望得到预期的DNA簇密度(Meyer，Μ.，A. W. Briggs, Τ. Maricic, et al. From micrograms to picograms -quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing[J]. Nucleic Acids Res,2008,36 :e5 ；Quail, MA., I.Kozarewa,F. Smith,et al. A large genome center' s improvements to the Illumina sequencing system [J]. Nat Methods, 2008, 5 (12) : 1005-1010· )。Pair End 文库的片段长度为300 600bp,部分文库达800bp。有文献与参考资料报道(Smith S.，L. Vigilant, P. A. Morin. The effects of sequence length and oligonucleotide mismatches on 5 ' exonuclease assay efficiency[J]. Nucleic Acids Res,2002,30 :elll ；Applied Biosystems, Primer Express Software Version3.OGetting Started Guide [EB/ OL]. 2005)在文库定量的荧光定量PCR实验中扩增效率会随着扩增产物长度的增加而降低，为保证较好的扩增效率(90% 110% )，荧光定量PCR实验Taqman水解探针法的扩增产物大小最好保持在50bp 150bp。因此文库的片段长度是影响扩增效率的主要因素。例如，使用某iTaqman PCR反应液对一定数量片段长度为300 600bp的I^air End文库进行定量，其扩增效率在85%左右。根据扩增产物遵循理论方程Y = X(1+E)n(其中Y=扩增产物，X =起始浓度，E =扩增效率，n =循环数)，对于同一个样品，假设扩增效率分别为85% 与90%，经过20个循环后，Y1 = X1 (1+0. 85) 2°，Y2 = X2 (1+0. 90) 2°，由于其扩增效率的不同， 结果相差1.7倍。因此，为了使荧光定量PCR能更好地应用于长核苷酸片段的定量，需要解决扩增效率偏低的问题。
发明内容
为了提高荧光定量PCR Taqman水解探针法扩增长核苷酸片段的效率，发明人进行了大量的实验，针对可能的影响因素采取相应的措施对反应液进行了优化，由此完成了本发明。本发明的一个方面涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于所述反应液中包含 PCR反应增强剂。所述PCR反应增强剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、 甲酰胺、非离子去污剂、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱(Betaine)中的一种或多种，例如二甲亚砜、牛血清白蛋白或甜菜碱中的一种或多种，在本发明的一个实施方案中， 所述PCR反应增强剂为二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、非离子去污剂、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵或甜菜碱等在荧光定量PCR中，作为反应增强剂能够促进各种耐热DNA聚合酶对许多复杂结构DNA模板(如高GC含量)的有效扩增，增加PCR反应的灵敏度和特异性。其原理包括通过提高DNA聚合酶的热稳定性，降低模板DNA的二级结构等机制提高目的片段的产量。其中，-10%二甲亚砜能改变引物模板配对反应的熔解温度，从而改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸。5%-20%甘油可提高产量，增加酶的稳定性。0. lyg/μ l-lyg/μ 1牛血清白蛋白能提高PCR反应的效率，同时减少体系中PCR抑制物对反应的影响。1.25% -10%甲酰胺可促进某些“引物-模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。硫酸铵能增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。0. 5-2Μ甜菜碱有助于高GC含量和长DNA片段的PCR反应。可以根据实际需要，选择其中的一种或多种。在本发明的一个实施方案中，二甲亚砜的浓度为5%，BSA的浓度为0. 1 μ g/μ 1， 甜菜碱的浓度为1Μ。所述荧光定量PCR反应液，其特征在于还包含耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5' -3'聚合酶活性和5' -3'外切酶活性。优选为所述DNA聚合酶还同时具有3' -5' 外切酶活性，以增加反应的灵敏度和特异性等等，如Ex Taq DNA聚合酶，LA Taq DNA聚合酶。更优选为所述DNA聚合酶为热启动(hot start) DNA聚合酶。热启动DNA聚合酶是指在高热状况下才会活化的聚合酶，以避免在未达到设定温度前就开始反应。利用热启动DNA聚合酶可防止在PCR反应第一步因引物错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增，从而提高目的DNA片段的扩增效率。所述热启动DNA聚合酶可以为经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动；或者带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动；或者改良自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离而启动。在本发明的一个实施方案中， 所述热启动DNA聚合酶为Ex Taq 热启动DNA聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase Hot Start Version)。本发明的另一方面涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于反应液的成份包含 10-67mM ρΗ 8. 2-9. 0Tris-HCl、25-50mM KClU. 5-5. OmM Mg2+、0. 2-0. 4mM dNTP、 0. 05% -0· 1 % Tween 20、1% -10%二甲亚砜、0· 1 μ g/μ 1-1 μ g/μ 1 牛血清白蛋白、0· 5-2Μ 甜菜碱和0. 04-0. 2U/ μ 1热启动DNA聚合酶。在本发明的实施方案中，其中所述的Mg2+为2. 5_3mM，二甲亚砜为1.2% _5%，牛血清白蛋白为0. 1-0. 8 μ g/ μ 1，甜菜碱为1-1. 2Μ，热启动DNA聚合酶为0. 05-0. 07U/ μ 1。本发明的还一方面涉及一种荧光定量PCR试剂盒，其包含本发明所述的荧光定量 PCR反应液。本发明的还一方面涉及一种荧光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用本发明所述的荧光定量PCR反应液的步骤。发明的有益效果本发明优化了荧光定量PCR实验的反应液，特别是在反应液中加入PCR反应增强齐U，选择热启动DNA聚合酶，解决了长片段定量PCR扩增效率偏低的问题，把扩增效率从 85%提高到95%以上。本方法既可以应用于一般的长核苷酸片段的定量，也可以应用于长片段文库的定量。
图1荧光定量PCR实验的扩增曲线图A 用商品化反应体系进行荧光定量PCR实验的扩增曲线B 优化的反应体系1的荧光定量PCR实验的扩增曲线C 优化的反应体系2的荧光定量PCR实验的扩增曲线D 优化的反应体系3的荧光定量PCR实验的扩增曲线其中横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度。图2荧光定量PCR实验的标准曲线图A 用商品化反应体系进行荧光定量PCR实验的标准曲线B 优化的反应体系1的荧光定量PCR实验的标准曲线C 优化的反应体系2的荧光定量PCR实验的标准曲线D 优化的反应体系3的荧光定量PCR实验的标准曲线其中横坐标为样品起始浓度(单位是ρΜ)，纵坐标为CT值。图3标准差与CT的关系其中σ为标准差，X为样品的某浓度，Y为X的1/10。标准差越小，反映出测量的准确度越高。具体来说，如果定量PCR的扩增效率是100%，那么10倍稀释点(X与Y浓度)之间的平均CT间隔应该恰为3. 32个CT值(见图 3)。要以99. 7%的几率分辨10倍稀释的浓度，标准差就必须小于等于3. 32/6 = 0. 553。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中涉及的各实验材料1)模板、探针和引物模板的制备从一名男性黄种人的血液中提取基因组DNA，按照《ft·印aring 2_5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing Part#1005363Rev. B》(Part#1005363Rev. B)构建文库，其中含有不同片段大小的DNA经Agilent 2100Bioanalyzer测定浓度，浓度为18. 7nM，脱氧核糖核酸片段大小平均为557bp，其脱氧核糖核酸片段大小范围为391bp-637bp。以此构建好的DNA文库作为标准品，用去离子水将 InM标准品稀释为5个浓度0. 1ρΜ、1ρΜ、10ρΜ、100ρΜ和ΙΟΟΟρΜ，作为反应模板。其中InM = l(T9mol/L，IpM = l(T12mol/L。7jC解探针序列5，CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3，(SEQID NO :1)，在其 5，端带有荧光基团5-FAM(5-羧基荧光素)，3’端带有淬灭基团6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)。引物 1. 1 :5，AATGATACGGCGACCACCGAGATC 3，(SEQ IDNO 2)引物 2. 1 :5，CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT 3，(SEQ IDNO 3)2)试剂其中10XPCR Buffer (Takara公司)含 IOOmM Tris_HCl、500mMKCl 和 15mM MgCl2, Ex Taq hot start version DNA 聚合酶为 5U/μ L，购自 Takara，dNTP 购自 Takara，MgS04 禾口 BSA 购自 New EnglandBiolabs，DMSO 购自上海生工，Betaine 购自 Sigma，50 X ROX 参比染料 (6-carboxyl-X-rhodamine)购自Invitrogen，引物和探针由上海生工合成。商品化试剂的反应预混液,购自Applied Biosystems，货号为4304473，成分为AmpliTaq Gold DNA聚合酶、AmpErase UNG、dNTPs, Rox参比荧光及优化的缓冲液组分(具体可参见产品说明书)。实施例1反应体系优化和商品化反应体系的荧光定量PCR比较1.优化的反应体系为1)优化的反应体系1 10XPCR Buffer2. 5 μ L2. 5mM dNTP2 μ LIOOmM MgSO40. 25 μ L10mg/mL BSA0. 25 μ L10% Tween-200. 25 μ L100% DMSO1· 25 μ L5Μ Betaine (甜菜碱)5 μ L10 μ M 引物 1.10· 75 μ L
10 μ M 引物 2.10.75 μ L10 μ M 水解探针0. 625 μ L50 X ROX 参比染料0. 5 μ LDNA 聚合酶0. 25 μ L模板1 μ L去离子水9. 625 μ L合计25 μ L5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。2)优化的反应体系2 10XPCR Buffer2. 5 μ L2. 5mM dNTP2 μ LIOOmM MgSO40. 25 μ L10mg/mL BSA2 μ L10% Tween-200. 25 μ L100% DMSO0. 3 μ L5Μ Betaine (甜菜碱)6 μ L10 μ M 引物 1.1O. 75 μ L10 μ M 引物 2.1O. 75 μ L10 μ M 水解探针O. 625 μ L50 X ROX 参比染料O. 5 μ LDNA 聚合酶O. 25 μ L模板1 μ L去离子水7. 825 μ L合计25 μ L5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。3)优化的反应体系3 IOXPCR Buffer2. 5 μ L2. 5mM dNTP2 μ LIOOmM MgSO40. 375 μ L10mg/mL BSA0. 25 μ L10% Tween-200. 25 μ L100% DMSO1· 25 μ L5Μ Betaine (甜菜碱)5 μ L10 μ M 引物 1.1O. 75 μ L10 μ M 引物 2.1O. 75 μ L10 μ M 水解探针O. 625 μ L50 X ROX 参比染料O. 5 μ LDNA 聚合酶O. 35 μ L模板1 μ L
去离子水9. 4 μ L合计25 μ L5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。2.商品化的反应体系为反应预混液12. 5yL10 μ M 引物 1.10.75 μ L10 μ M 引物 2.10· 75 μ L10 μ M 水解探针0.625 μ L模板1 μ L去离子水9. 375 μ L合计25 μ L5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。3.反应条件将以上四种反应体系在荧光定量PCR仪M^3One Plus (ABI公司)中进行反应。本发明优化的反应体系的反应条件为95°C预变性 IOS ；95°C变性 30S、60°C退火 30S、72°C延伸 45S，共 40 个循环。商品化试剂体系的反应条件为95°C预变性 IOmin ；95°C变性 30S、60°C退火 30S、72°C延伸 45S，共 40 个循环。4.实验结果反应结束后，经乂印01^ v2.0软件分析，本发明优化反应体系1的扩增效率为 99. 31%，优化反应体系2的扩增效率为97. 96%，优化反应体系3的扩增效率为99. 49%, 而商品化体系的扩增效率为86. 73%。具体实验结果见表1-表4，以及图1、图2和图3。表1使用商品化反应体系的荧光定量PCR结果
权利要求
1.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于所述反应液中包含二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱中的一种或多种。
2.权利要求1的反应液，其特征在于所述反应液中包含二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。
3.权利要求1的反应液，其还包含耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5'-3'聚合酶活性和5' -3'外切酶活性，优选地，所述DNA聚合酶具有3' -5'外切酶活性，更优选为Ex Taq DNA聚合酶。
4.权利要求3的反应液，其中所述DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，优选为ExTaq 热启动DNA聚合酶。
5.—种荧光定量PCR反应液，其特征在于反应液的成份包含10-67mM pH8. 2-9. OTris-HCl、25-50mM KC1、1. 5-5. OmM Mg2+、0. 2-0. 4mM dNTP、0. 05% -0. 1% Tween 20、1%-10%二甲亚砜、0. lyg/μ l-lyg/μ 1 牛血清白蛋白、0. 5-2M甜菜碱和 0. 04-0. 2U/ μ 1热启动DNA聚合酶。
6.权利要求5的反应液，其中所述的Mg2+为2.5-3mM，二甲亚砜为1.2% _5%，牛血清白蛋白为0. 1-0. 8 μ g/μ 1，甜菜碱为1-1. 2Μ，热启动DNA聚合酶为0. 05-0. 07U/y L·
7.一种荧光定量PCR试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述的反应液。
8.一种荧光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用权利要求1-6任一项所述的反应液的步骤。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于包含PCR反应增强剂，所述PCR反应增强剂选自二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱中的一种或多种，例如二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。本发明的荧光定量PCR反应液还包含具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，优选为同时具有3′-5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶和热启动耐热DNA聚合酶。本发明还涉及包含所述反应液的试剂盒以及利用所述反应液进行荧光定量PCR的方法。
文档编号C12N15/10GK102465120SQ20101053826
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者孙勇, 张庆辉, 张秀清, 杨焕明, 陈城超, 陈敏峰, 黄业博 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司